全 文 ：第 51 卷 第 6 期
2 0 1 5 年 6 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 6
Jun．，2 0 1 5
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20150613
收稿日期: 2014 － 01 － 12; 修回日期: 2015 － 04 － 01。
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572014CA22)。
* 王秋玉为通讯作者。
3 种白腐菌木质纤维素酶活性及酶相关
基因的 TＲAP标记遗传多态性*
訾晓雪 曹 宇 闫绍鹏 王秋玉
(东北林业大学生命科学学院 哈尔滨 150040)
摘 要: 【目的】木质纤维素是重要的可再生资源，白腐菌对降解木质纤维素具有特殊的优势。研究 3 种白腐菌的
生物学特性、酶学活性以及菌种间的遗传多样性，系统分析 3 种白腐菌木质纤维素酶的表达与相关基因多态性的关
系，为高产木质纤维素酶菌种选育提供理论基础，为白腐菌木材降解分子机制的研究提供科学依据。【方法】以云芝
栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝 3 种白腐菌为研究材料，测定在不同培养温度下固体培养基中菌落的生长速度和液
体培养基中的生物量变化，利用比色法测量白腐菌 5 种木质纤维素酶活性，运用目标区域扩增多态性(TＲAP)分子标
记分析 3 种白腐菌的木质纤维素降解相关酶基因的多态性。【结果】在不同温度下(23，28 ℃ )，3 种白腐菌在 PDA 固
体培养基上的生长速度均为云芝栓孔菌 ＞火木层孔菌 ＞松杉灵芝，云芝栓孔菌和火木层孔菌在 28 ℃的生长速度高
于 23 ℃，而松杉灵芝在 23 ℃培养生长更快; 液体培养基中云芝栓孔菌的生物量高于火木层孔菌和松杉灵芝。3 种白
腐菌木质素相关酶活性受木屑诱导显著提高，木质素酶活性最高的是漆酶，其次是木质素过氧化物酶，最低的是锰过
氧化物酶; 纤维素酶的表达在 3 种白腐菌中无显著差异，但外切纤维素酶活性明显高于内切纤维素酶活性，玉米秸秆
为碳源诱导产生的纤维素酶活性明显高于木屑碳源样品。云芝栓孔菌更偏好于木质素酶的表达，而火木层孔菌和松
杉灵芝则更偏好于纤维素酶的表达。TＲAP 分子标记扩增结果显示，木质素酶相关基因的 6 对引物共产生 109 条条
带，多态性条带为 79 条，多态性百分比为 72. 47% ; 纤维素酶相关基因的 11 对引物共产生 198 条条带，多态性条带为
140 条，多态性百分率为 70. 70%。【结论】通过生长速度、生物量、木质纤维素酶活性的检测以及 TＲAP 分子标记结
果表明 3 种白腐菌在种间具有较高的遗传差异。3 种白腐菌木质素酶活性的大小与其酶基因多态性之间没有明显的
对应关系; 3 种白腐菌纤维素酶活性大致相同，其基因多态性也比较一致。
关键词: 白腐菌; 木质素酶; 纤维素酶; TＲAP 分子标记; 遗传变异
中图分类号: S718. 8 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)06 － 0111 － 08
Ligocellulolytic Enzyme Activities in Three White-Ｒot Fungi and
Genetic Polymorphism of These Enzyme-Ｒelated Genes Using TＲAP Marker
Zi Xiaoxue Cao Yu Yan Shaopeng Wang Qiuyu
(College of Life Science，Northeast Forestry University Harbin 150040)
Abstract: 【Objective】Lignocellulose is an important renewable resource in the world，and white-rot fungi have special
advantages in degradation of this resource． We studied the biological characteristics，enzymatic activity and genetic
diversity of fungi，and analyzed systematically the relationship between woody cellulase expression and the related gene
polymorphism，in order to provide a theoretical basis of breeding and molecular mechanisms of white-rot fungi． 【Method】
Three white-rot fungi，Trametes versicolor，Phellinus igniarius and Ganoderma tsugae，were used to study the growth rate
in solid medium under different culture conditions and the biomass in liquid medium． Colorimetric methods were used to
measure activities of five kinds of cellulose enzymes，and the target region amplification polymorphism ( TＲAP) was
applied to analyze polymorphisms of three kinds of lignocellulose-degrading enzyme genes． 【Ｒesult】The results showed
that growth rate of the three white-rot fungi was successively Trametes versicolor ＞ Phellinus igniarius ＞ Ganoderma
tsugae at different temperatures ( 23° C and 28° C ) on the PDA medium． The growth rate of Trametes versicolor and
Phellinus igniarius was higher at 28° C than at 23° C，while this was inverse for Ganoderma tsugae． The biomass of
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Trametes versicolor in the liquid medium was highest among the three fungi． Spectrophotometry was used to detect the
activities of the five ligocellulose enzymes produced by three fungi． Sawdust could markedly increase ligninase activities，
however cellulose activity induced by maize straw was higher than that by sawdust as carbon source． The activity of laccase
was highest in all the three ligninases，manganese peroxidase was the second and lignin peroxidase was the last． There was
no significant difference in the cellulases activities among the three fungi，but exo-cellulase was significantly higher than
endo-cellulase． Trametes versicolor had the highest ligninase activity，and the others produced higher cellulase activity． In
addition，a total of 109 bands were amplified by 6 primers related to ligninase gene，including 79 polymorphic bands，and
the polymorphism ratio was 71． 34% ． With 11 primers related to cellulase gene，198 fragments were obtained，of which
140 were polymorphic bands (70． 70% ) ． 【Conclusion】There existed relatively high genetic differences among these three
kinds of white-rot fungi using the detection of growth rate，biomass，enzyme activities and molecular marker． The values of
enzyme activities had no corresponding relationship with enzyme gene polymorphism． However，cellulose activities were
consistent among fungi，and the same in gene polymorphism． These results would be helpful for the study on mechanism of
wood decayed by white-rot fungi．
Key words: white-rot fungi; ligninase; cellulase; TＲAP; genetic variation
白腐菌是木材腐朽菌的一类，在生态系统循环
中起到关键的降解作用(戴玉成，2012)。在植物体
内，木质素与半纤维素通过化学键紧密连接，包裹在
纤维素之外，这种复杂的结构使得纤维素很难被微
生物降解(吕世翔等，2009)，但白腐菌在降解木质
纤维素方面具有特殊的优势(张晓昱等，2004)。
图 1 云芝栓孔菌( a)、火木层孔菌(b)和 松杉灵芝( c)
Fig． 1 Trametes versicolor( a)，Phellinus igniarius ( b) and Ganoderma tsugae ( c)
近年来，国内外对白腐菌的各种木质纤维素酶
进行了大量研究。主要集中在木质纤维素酶高产菌
种选育、木质素降解机制以及污染物降解等方面。
吴志 显 等 ( 2005 ) 对 火 木 层 孔 菌 ( Phellinus
igniarius)、粗毛盖菌(Funalia gallica)等 6 种白腐菌
木质素降解的机制进行了初步研究。Kamei 等
(2012)筛选出一株新的白腐菌 Phlebia sp． MG-60，
可以在有氧状态下去除木材的木质素，在无氧状态
下降解纤维素并糖化发酵生产乙醇。 Liew 等
(2011)利用马占相思木屑对几种热带白腐菌的生
物制浆和木质素降解酶活进行研究，结果显示云芝
栓孔菌 ( Trametes versicolor)和针层孔菌 ( Phellinus
sp． )的木质素降解能力更强。
目标区域扩增多态性( TＲAP)分子标记技术是
利用已知目标基因序列设计固定引物，选择性扩增
目的基因的某一特定区域(Miklas et al．，2006)。该
技术的优点在于能够产生围绕目标基因序列的多态
性标记(Li et al．，2011)。目前已广泛应用于遗传多
样性分析、基因定位、遗传图谱构建等方面的研究
(Xiao et al．，2010; Devarumath et al．，2013; 张丽群
等，2012)。
本研究以帽儿山采集的云芝栓孔菌、火木层孔
菌和松杉灵芝为对象，测定其生长速度及几种主要
木质纤维素酶活性变化，并采用 TＲAP-PCＲ 技术探
讨 3 种白腐菌木质纤维素酶相关基因序列间的遗传
差异。目的是从分子水平上了解 3 种白腐菌木质纤
维素酶的表达与相关基因多样性的关系，为以后高
产木质纤维素酶菌种选育和白腐菌木材降解分子机
制的研究提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
本试验所使用的 3 种白腐菌均可造成木材海绵
状白色腐朽(图 1)，即云芝栓孔菌、火木层孔菌和松
杉灵芝(Ganoderma tsugae)，均采自黑龙江省尚志市
东北林业大学帽儿山实验林场。
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第 6 期 訾晓雪等: 3 种白腐菌木质纤维素酶活性及酶相关基因的 TＲAP 标记遗传多态性
1. 2 菌种的分离与纯化
在无菌的条件下，用含 75%的酒精棉擦拭菌体
表面，用解剖刀切取子实体中有生命力的菌块 (约
1 cm2)，用 75%酒精表面消毒 2 min，次氯酸钠溶液
消毒 1 min，无菌水冲洗 3 次，然后将组织块切成
2 mm2大小，滤纸吸干后接入 PDA 平板培养基上，置
于 28 ℃下恒温培养，待菌丝体覆盖整个平板后用接
种针挑取尖端菌丝转接到新的 PDA 培养基上，如此
反复使菌株纯化。将纯的白腐菌株转接到白桦
(Betula platyphylla 木屑麦麸培养基上，置于 28 ℃培
养箱中继续培养，待菌丝体长满试管放入 4 ℃冰箱
中保存。
1. 3 3 种白腐菌生长特性比较
用打孔器取直径约 0. 75 cm 大小的菌饼接种到
PDA培养基中，分别放入 23，28 ℃培养箱中培养，每 12
h测量记录培养基中的菌落直径，每个菌种设 3 个重
复。每 20 mL马铃薯 －葡萄糖液体培养基(200 g·L － 1
马铃薯，20 g·L － 1葡萄糖)接入一个直径约 0. 75 cm 的
菌饼，在 28 ℃、150 r·min － 1摇床中震荡培养，每隔 48 h
取出，过滤并用蒸馏水冲 3 次，放入 100 ℃烘箱中烘至
恒质量后称量，每个菌种设 3个重复。
1. 4 木质纤维素降解相关酶活性检测
1. 4. 1 木质素酶粗酶液制备 白桦木屑的处理:
干燥的白桦木屑经粉碎机粉碎后用蒸馏水多次冲
洗，经 6 层纱布过滤最后放入烘箱中烘干备用。
在 20 mL 马铃薯 － 葡萄糖液体培养基中加入
1 g白桦木屑，分别接种 3 种白腐菌菌饼 1 块(直径
约 0. 75 cm)，无白桦木屑的马铃薯 －葡萄糖液体培
养基为对照，每个菌种设 3 个重复。分别培养 3，6，
9 天后取出，培养液在10 000 r·min － 1离心 10 min，
上清液即为粗酶液。
1. 4. 2 纤维素酶粗酶液制备 麦麸的处理: 干燥
的麦麸用蒸馏水多次冲洗，经 4 层纱布过滤后，放入
烘箱中烘干，经粉碎机粉碎后备用。
培养液中各物质的质量分数分别为: 2%
(NH4 ) 2 SO4，0. 1% KH2PO4，0. 5% MgSO4·7H2O，
0. 01% CaCl2，0. 01% NaCl，0. 005% FeSO4·7H2O，
0. 001 6% MnSO4·H2O，0. 001 4% ZnSO4·7H2O，
0. 002% CoCl2。
在 50 mL 三角瓶中加入 1 g 烘干的麦麸碎屑或
白桦木屑及 10 mL 培养液，灭菌后接入菌饼(直径
约 0. 75 cm)，分别培养 3，6，9 天后，向培养物中加
入 5 倍质量的蒸馏水，盖上封口膜浸泡 12 h，随后用
2 ～ 3 层纱布过滤，培养液在 6 000 r·min － 1 离心
10 min，取上清即为粗酶液。
1. 4. 3 酶活测定 木质素过氧化物酶 ( LiP)活性
测定参见文献 (董旭杰等，2007 )，锰过氧化物酶
(MnP)活性测定参见文献(徐淑霞等，2007)，漆酶
(Lac)活性测定参见文献(李慧蓉，2005)。内切纤
维素酶活测定参见文献(Deswal et al．，2011)，外切
纤维素酶活测定参见文献(Li et al．，2007)。
1. 5 3 种白腐菌木质纤维素酶相关基因的 TＲAP-
PCＲ 检测
利用 CTAB 法提取 3 种白腐菌的基因组 DNA，
紫外分光光度计 ( UV － 1800，Japan)检测 DNA 浓
度。引物设计: 来自 NCBI 数据库的木质纤维素降
解相关酶基因为靶标基因序列，设计固定引物用于
TＲAP-PCＲ，筛选出产生多态性条带的引物用于
PCＲ 扩增 ( PTC － 100，Germany)。PCＲ 反应条件:
在 20 μL 反应体系中，ddH2O11. 2 μL、10 × buffer
2 μL、Mg2 + (25 mmol·L － 1 )2. 0 μL、dNTP(10 mmol·
L － 1)0. 6 μL、固定引物(10 μmol·L － 1)1. 5 μL、随机引
物(10 μmol·L － 1 )1. 5 μL、模板 DNA 100 ng、TaqDNA
聚合酶 0. 2 μL。PCＲ 程序为: 94 ℃ 5 min; 94 ℃
1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 个循环; 94 ℃
1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，35 个循环; 4 ℃保存。
PCＲ 扩增产物经 1. 5%琼脂糖凝胶，以 100 V 缓冲电
压，1 × TAE 缓冲液电泳分离，使用 UPS 凝胶成像系
统(Universal HoodⅡ，BioＲad)检测结果。
1. 6 数据处理与统计分析方法
采用 SPSS17. 0 统计学软件进行木质纤维素酶
间方差(单因素和双因素)和显著性分析。
多态位点比率(PPB): PPB =多态位点数 /检测
到的位点总数 × 100%。
2 结果与分析
2. 1 3 种白腐菌在 PDA 固体培养基中生长速度的
比较
在不同温度下，3 种白腐菌的生长情况见图 2。
28 ℃时，云芝栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝的菌
落平均生长速度(直径变化)分别为 7. 0，3. 6 和 2. 6
mm·d － 1; 而在 23 ℃培养条件下，3 种白腐菌的生长
速度分别为 6. 0，3. 4 和 3. 2 mm·d － 1。说明云芝栓
孔菌生长受温度变化影响较大，28 ℃ 更适合其生
长; 火木层孔菌菌丝体长满平板需要 12 天，温度差
异对这种真菌影响不明显; 松杉灵芝是 3 种白腐菌
中生长最慢的菌株，生长天数也相对较长一些，但与
其他菌种相比，23 ℃更适合其生长。
2. 2 3 种白腐菌在液体培养基中生物量比较
3 种木材白腐菌生物量变化如图 3 所示，它们
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林 业 科 学 51 卷
图 2 3种白腐菌在 28 ℃ (a)、23 ℃ (b)PDA培养基生长情况
Fig． 2 Growth rate of three white-rot fungi in PDA
medium at 28 ℃ ( a) and 23 ℃ ( b)
在液体培养基中的生物量变化很大，云芝栓孔菌从
第 2 天开始进入对数期，生长速度比较快，在第
10 天生物量达到最大值后迅速进入衰亡期; 火木
层孔菌延迟期为 0 ～ 4 天，随后生物量直线上升，到
第10 天时达到同期云芝栓孔菌的 42. 36%，对数期
时间较长，16 天还未到达平台期; 松杉灵芝的生物
量最低，延迟期为 0 ～ 6 天，第 10 天仅达到同期云芝
栓孔菌的 9. 27%，第 12 天达到其生物量最大值 248
mg，随后逐渐下降，第 16 天降到 135. 8 mg。
2. 3 3 种白腐菌木质纤维素降解相关酶活性变化
2. 3. 1 3 种白腐菌木质素降解相关酶活性变化
木质素过氧化物酶活性如图 4a 所示，云芝栓孔菌
受木屑诱导处理与对照间的差异极显著，F =
34. 859＊＊＊(表 1)，在相同培养条件下，云芝栓孔菌
表达的木质素过氧化物酶活性最强。3 种白腐菌
的锰过氧化物酶活性与生长天数关系紧密，随着
培养时间的增加而递增，之后持平或略有下降(图
4b)。其中，火木层孔菌木屑诱导处理与对照间的
差异显著，F = 10. 424 * 。3 种白腐菌漆酶活性表
图 3 液体培养基中 3 种白腐菌生物量的变化
Fig． 3 Biomass changes of three white-rot fungi in liquid culture
图 4 3 种白腐菌木质素过氧化物酶、
锰过氧化物酶和漆酶活性
Fig． 4 Activities of lignin peroxidase，manganese
peroxidase and laccase of three white-rot fungi
达量最高，变化较大(图 4c)。其中，云芝栓孔菌漆
酶活性最高，松杉灵芝基本没有漆酶产生。3 种白
腐菌的漆酶活性受木屑诱导显著提高，且随生长
天数递增。3 种酶活性均随培养时间的增加而
增强。
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第 6 期 訾晓雪等: 3 种白腐菌木质纤维素酶活性及酶相关基因的 TＲAP 标记遗传多态性
2. 3. 2 3 种白腐菌纤维素降解相关酶活性变化
如图 5 所示，3 种白腐菌在麦麸作为碳源诱导产生
的内切 β －葡聚糖酶酶活性均高于木屑碳源样品。
火木层孔菌产酶能力最强，云芝栓孔菌产酶能力最
低，但不同菌种间差异不明显。3 种白腐菌在麦麸
作为碳源诱导产生的外切 β －葡聚糖酶活性均高于
木屑碳源样品，松杉灵芝受木屑诱导处理与对照间
的差异极显著，F = 69. 894＊＊ (表 2)。3 种白腐菌在
培养第 3 天时 EC 酶活最强，之后随着培养天数的
增加而降低，云芝栓孔菌降幅最为明显，火木层孔菌
降幅居中，松杉灵芝降幅最小。
2. 4 3 种白腐菌木质纤维素酶相关基因的 TＲAP
标记的遗传变异
2. 4. 1 TＲAP 引物筛选 经预试验扩增筛选，从 64
对 TＲAP 引物中确定了扩增后条带清晰、多态性高
的 17 对 引 物: LiP2-me2，MnP1-me1，MnP2-em3，
Lac1-em2，Lac1-em3，Lac2-em3，CBHⅠ1-em2，CDH1-
em2，CDH1-em3，CDH2-em3，EG1-em2，EG1-em3，
EG2-me2，β1-em2，β1-em3，β2-em2，β2-me1。引物
序列如表 3 所示(王玉英等，2012; 应正何，2006)。
表 1 3 种白腐菌漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶活性方差分析①
Tab. 1 The variance analysis of the activities of three main lignin degradation enzymes
白腐菌
White-rot fungi
Lac MnP LiP
F treatments F time F treatments F time F treatments F time
云芝栓孔菌 T． versicolor 10. 140＊＊ 9. 794＊＊ 1. 577 6 12. 015 * 34. 859＊＊＊ 1. 208
火木层孔菌 P． igniarius 5. 238 * 10. 148＊＊ 10. 424 * 4. 171 * 10. 173 * 3. 25
松杉灵芝 G． tsugae 5. 168 * 4. 374 * 3. 213 0. 578 * 11. 314 * 1. 663
①3 种白腐菌间 F 值 F value among 3 white-rot fungi: F = 3. 934 * ( Lac ) ( 0. 040 8 )，F = 7. 782＊＊ ( MnP ) ( 0. 001 2 )，F = 14. 408＊＊＊
(Lip) (0. 006 2) ．
图 5 3 种白腐菌内切 β －葡聚糖酶和外切 β －葡聚糖酶活性
Fig． 5 Activities of endoglucanase(EG) and exoglucanase(EC) by three white-rot fungi
表 2 3 种白腐菌内切 β －葡聚糖酶、外切 β －葡聚糖酶活性方差分析①
Tab. 2 The variance analysis of the activities of endoglucanase(EG) and exoglucanase(EC)
白腐菌 White-rot fungi
内切 β －葡聚糖酶 EG 外切 β －葡聚糖酶 EC
F treatments F time F treatments F time
云芝栓孔菌 T． versicolor 0. 117 9. 144＊＊ 1. 985 18. 658＊＊
火木层孔菌 P． igniarius 0. 378 7. 592＊＊ 16. 983＊＊ 3. 927 *
松杉灵芝 G． tsugae 12. 295＊＊ 0. 441 69. 894＊＊ 1. 067
①3 种白腐菌间 F 值 F value among 3 white-rot fungi:F = 3. 452(EG) (0. 875 5)，F = 7. 142 * (EC) (0. 046 1) ．
2. 4. 2 3 种白腐菌木质纤维素酶相关基因的
TＲAP-PCＲ 的多态性 3 种白腐菌木质素相关酶基
因的 TＲAP-PCＲ 结果见图 6。采用 LiP 编码基因引
物对 3 种白腐菌基因组 DNA 扩增后共产生 15 条条
带，云芝栓孔菌多态性比率为 83. 33%，火木层孔菌
50%，松杉灵芝 85. 71%，物种间多态性比率为
80%。MnP 编码基因的 2 对引物对 3 种白腐菌基因
组 DNA 扩增后共产生 22 条条带，云芝栓孔菌多态
性比率为 80%，火木层孔菌为 87. 5%，松杉灵芝
88. 89%，物种间多态性比率为 86. 36%。Lac 编码
基因引物的 TＲAP-PCＲ 结果显示，共产生 72 条条
带，云芝栓孔菌多态性比率 71. 43%，火木层孔菌
60%，松 杉 灵 芝 80%，物 种 间 多 态 性 比 率 为
66. 67%。由此得出 3 种白腐菌的 LiP 基因、MnP 基
因和 Lac 基因在种内和种间均存在较高的遗传差异
(表 4)。
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林 业 科 学 51 卷
表 3 3 种白腐菌 TＲAP-PCＲ 引物序列
Tab. 3 TＲAP-PCＲ primers of three white-rot fungi
引物类型 Primer 靶标酶名称 Name of target enzyme 序列 Primer sequence(5—3)
固定引物 木质素过氧化物酶 Lignin peroxidase(LiP2) CCCCGAGCCCTTCC
Fixed primer 锰过氧化物酶 Manganese peroxidase(MnP1) ATGGCGTCGTGGAAGGTG
锰过氧化物酶 Manganese peroxidase(MnP2) GGTGAGGCGGAGGGAC
漆酶 Laccase(Lac1) ACAACTACAACAACCCGTCTG
漆酶 Laccase(Lac2) GTCTGGAAGCGGATTGTG
纤维素二糖水解酶ⅠCellobiohydrolaseⅠ(CBHⅠ1) ATCTGCGACAAGGACGG
纤维二糖脱氢酶 Cellobiosedehydrogenzse(CDH1) TCAACGACAACCCCGAC
纤维二糖脱氢酶 Cellobiosedehydrogenzse(CDH2) GTCGGGGTTGTCGTTGA
内切葡萄糖苷酶 Endoglucase(EG1) ACGAGCCGCACGACAT
内切葡萄糖苷酶 Endoglucase(EG2) TCGTGCGGCTCGTTCAT
β －葡萄糖苷酶 β-glucosidase(β1) GTGGAAGGTGCTGCGGTA
β －葡萄糖苷酶 β-glucosidase(β2) CAGGGAGGCGGAGTGG
随机引物 em2 GACTGCGTACGAATTTGC
Arbitrary primer em3 GACTGCGTACGAATTGAC
me1 TGAGTCCAAACCGGATA
me2 TGAGTCCAAACCGGAGC
图 6 木质素相关基因 TＲAP-PCＲ 电泳
Fig． 6 TＲAP-PCＲ Electrophoresis of ligninase-related genes
1，2，7，8，13，14，19，20:云芝栓孔菌 T． versicolor;3，4，9，10，15，16，21，22:火木层孔菌 P． igniarius;5，6，11，12，17，18，
23，24:松杉灵芝 G． tsugae;M:DL 2000 Marker．
表 4 木质素酶相关基因 TＲAP-PCＲ 的多态位点百分率
Tab. 4 Polymorphic loci percentage of the ligninase-related genes by TＲAP-PCＲ
标记基因引物
Primer of marker gene
条带总数
Total number of
bands
多态条带数
Number of
polymorphic bands
多态位点比率
Percentage of
polymorphic bands(% )
LiP 编码基因引物
Primer of LiP-related gene
云芝栓孔菌 T． versicolor 6 5
火木层孔菌 P． igniarius 2 1
松杉灵芝 G． tsugae 7 6
80
MnP 编码基因引物
Primer of MnP-related gene
云芝栓孔菌 T． versicolor 5 4
火木层孔菌 P． igniarius 8 7
松杉灵芝 G． tsugae 9 8
86. 36
Lac 编码基因引物
Primer of Laccrelated gene
云芝栓孔菌 T． versicolor 28 20
火木层孔菌 P． igniarius 20 12
松杉灵芝 G． tsugae 24 16
66. 67
总计 Total 109 79 72. 47
3 种白腐菌纤维素相关酶基因的 TＲAP-PCＲ 结
果见图 7。用 CBH 编码基因引物对 3 种白腐菌基因
组 DNA 扩增后共产生 31 条条带，云芝栓孔菌多态
性比率 57. 14%，火木层孔菌 66. 67%，松杉灵芝
58. 33%，物种间多态性比率为 61. 29% ; 用 CDH 编
码基因引物对 3 种白腐菌基因组 DNA 扩增后共产
生 38 条条带，云芝栓孔菌多态性比率 88. 89%，火
木层孔菌 92. 85%，松杉灵芝 86. 67%，种群间多态
位点比率为 72. 91% ; 用 EG 编码基因引物对 3 种
白腐菌基因组 DNA 扩增后共产生 50 条条带，云芝
栓孔菌多态性比率 63. 15%，火木层孔菌 58. 82%，
松杉灵芝 50%，物种间多态性比率为 58% ; 用
611
第 6 期 訾晓雪等: 3 种白腐菌木质纤维素酶活性及酶相关基因的 TＲAP 标记遗传多态性
β －葡萄糖苷酶编码基因引物对 3 种白腐菌基因组
DNA 扩增后共产生 72 条条带，多态性条带为 58
条，云芝栓孔菌多态性比率 72%，火木层孔菌
70. 83%，松杉灵芝 57. 5%，物种间多态性比率
72. 45%。由此得出 3 种白腐菌间的纤维素降解相
关基因的遗传多样性较高(表 5)。
图 7 纤维素酶相关基因 TＲAP-PCＲ 电泳
Fig． 7 TＲAP-PCＲ electrophoresis of cellul-related genes
(1，2，7，8，13，14，19，20:云芝栓孔菌 T． versicolor; 3，4，9，10，15，16，21，22:火木层孔菌 P． igniarius; 5，6，11，12，17，
18，23，24:松杉灵芝 G． tsugae;M:DL 2000 Marker．
表 5 纤维素酶相关基因 TＲAP-PCＲ 的多态位点百分率
Tab. 5 Polymorphic loci percentage of the cellulase-related genes by TＲAP-PCＲ
标记基因引物
Primer of marker gene
条带总数
Total number of
bands
多态条带数
Number of
polymorphic bands
多态位点比率
Percentange of
polymorphic bands(% )
纤维二糖水解酶
编码基因引物
Primer of CBH
云芝栓孔菌 T． versicolor 7 4
火木层孔菌 P． igniarius 12 8
松杉灵芝 G． tsugae 12 7
61. 29
纤维二糖脱氢酶
编码基因引物
Primer of CDH
云芝栓孔菌 T． versicolor 9 8
火木层孔菌 P． igniarius 14 13
松杉灵芝 G． tsugae 15 13
89. 47
内切葡聚糖苷酶
编码基因引物
Primer of EG
云芝栓孔菌 T． versicolor 19 12
火木层孔菌 P． igniarius 17 10
松杉灵芝 G． tsugae 14 7
58. 00
β －葡萄糖苷酶
编码基因引物
Primer of BG
云芝栓孔菌 T． versicolor 25 18
火木层孔菌 P． igniarius 24 17
松杉灵芝 G． tsugae 30 23
72. 45
总计 Total 198 140 70. 70
3 结论与讨论
本研究得出云芝栓孔菌和火木层孔菌的最适宜
生长温度是 28 ℃，松杉灵芝的最适培养温度为
23 ℃，这与国家食用菌最适培养温度的参考值不一
致。刘欣等(2008)研究也表明木蹄层孔菌 (Fomes
fomentarius)更适合在 23 ℃下培养。尽管本研究菌
种均采自黑龙江，并且长时间生长在较低温环境下，
但不同的菌种却有着不同的温度适应性。
3 种白腐菌木质素相关酶活性受木屑诱导显著
提高，玉米秸秆为碳源诱导产生的纤维素酶活性均
高于木屑碳源样品，原因可能在于纤维素酶属于糖
苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中 β － 1，4 －
糖苷键的一类酶的总称，单个纤维素酶的作用是独
立的，而不同酶分子之间的作用是相互补偿的，各酶
组分之间存在复杂的协同反应关系，因此对不同碳
源的响应也十分复杂(张小梅等，2013)。而且，纤
维素酶酶活的表达量与菌种的生长速度和生物量没
有直接关系，如松杉灵芝生长速度和生物量最低，但
其纤维素的表达量却高于其他 2 菌种。云芝栓孔菌
更偏好于木质素酶的表达，而火木层孔菌和松杉灵
芝则更偏好于纤维素酶的表达。该结果可以为今后
相关酶生产的候选菌种的选择提供依据。
松杉灵芝生长速度较慢，菌丝体较薄、量少，不
容易收集，因此严重影响松杉灵芝基因组 DNA 提取
量和效果。本研究选用液体培养基培养菌种，并用
于基因组 DNA 提取，提取效果理想。
在木质素过氧化物酶的研究中，云芝栓孔菌与
松杉灵芝的酶活差异较大，但酶基因多态性均在
80%左右，差异不大。3 种白腐菌的锰过氧化物酶
活性为云芝栓孔菌 ＞ 火木层孔菌 ＞ 松杉灵芝，但它
们的锰过氧化物酶基因多态性变化趋势相反，云芝
711
林 业 科 学 51 卷
栓孔菌最低而松杉灵芝最高。在漆酶活性的测定
中，松杉灵芝几乎没有产生漆酶，但其漆酶基因多态
性却和其他 2 种白腐菌大致相同。由此可见，3 种
菌木质素酶活性的大小与其酶基因多态性之间没有
明显的对应关系。而 3 种白腐菌纤维素酶活性大致
相同，其基因多态性也比较一致，两者可能存在某种
联系，但还有待于进一步研究。
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(责任编辑 朱乾坤)
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