全 文 ：第 8? 卷 第 ? 期
4 A 2 5 年 ? 月
林 业 科 学
7;QRS6QL 7Q!ILR 7QSQ;LR
I.(T8?"S.T?
7-H3" 4 A 2 5
D."!2A322=A=UV32AA2F=8>>34A25A?A>
收稿日期! 4A24 W24 W42# 修回日期!4A25 WA: W2=’
基金项目!浙江省自然科学基金项目$ 5^22A895% # 浙江省农业科技重点项目$4A22;24A28% # 浙江省重点创新团队$4AA?X9AA59 W?% # 浙
江省农业科技重大专项$4AA>;A4AA8 W2% # 浙江农林大学研究生科研创新基金项目$5244A2548A42>% # 浙江省重大科技专项$4AA?;24A?>% ’
#林二培为通讯作者’
光皮桦 F$?8:\ 转录因子基因的克隆&
表达及单核苷酸多态性分析#
李玉岭\周厚君\林二培\黄华宏\徐莉莉\童再康
$浙江农林大学林业与生物技术学院\亚热带森林培育国家重点实验室培育基地\临安 5225AA%
摘\要!\7P#%B.+%H*.B.)-*E"&D"&CH*.)-"& ("b-C-&-+$?8:-%对植物开花具有重要的调控作用’ 基于转录组序列并
利用 XL;R技术从光皮桦中分离获得 F$?8:\ 基因"其 ,aSL序列全长 2 >49 EH"包含开放阅读框长 2 2=A EH"编码
5>? 个氨基酸"与桃 8K?8:\ $R$[2A8A9% 的同源性最高$:=d%"属于陆地植物 71!+基因家族的 C*.#H IQQ分支’ 表
达分析显示 F$?8:\ 在光皮桦芽&雌花&雄花&幼苗中均有表达"在雄花和幼苗中表达量较低"但在芽发育成雌花过
程中明显上调"推测其可能对早期的雌花形成起调控作用’ 同时"从 9= 个不同的光皮桦无性系中克隆 F$?8:\ 的基
因组序列"进行单核苷酸多态性 $ 7S1%分析"共检测到 ?> 个 7S1位点"7S1频率为 2U4: EH"多样性指数 "为
ATAA= 24’ 在外显子区域"共检测到 4> 个 7S1位点"其中 22 个为同义突变" 2= 个为错义突变’ 进一步的连锁不平
衡分析显示"随着序列长度的增加"不同光皮桦群体 F$?8:\ 内的 7S1+连锁不平衡在基因内部迅速衰退’
关键词!\光皮桦# 转录因子# ?8: 基因# 单核苷酸多态性
中图分类号!7=2>T8:\\\文献标识码!L\\\文章编号!2AA2 W=8>>"4A25#A? WAA94 W2A
80")&’("#" PJ%*/00("#$(#=)/!+,)/"’(7/>"):4"*%.(040@#&):0(0"1
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@50’*&,’!\7P#%B.+%H*.B.)-*E"&D"&CH*.)-"& ("b-C-&-+$?8:-%H(%G%& "BH.*)%&)*.(-"& *-C#(%)"&C/(.J-*"&C./H(%&)+3
Q& )0"++)#DG" .&-?8: C-&-&%B-D F$?8:\ J%+,(.&-D /*.BF!"A$# $A*+1+-&D+% +)*%)-CG360-,aSL./F$?8:\ "+2 >49 EH "& (-&C)0 J")0 %& .H-& *-%D"&C/*%B-$@XZ% -&,.D"&C%H*.)-"& ./5>?
%%360-D-D#,-D H*.)-"& +-P#-&,-./)0-F$?8:\ +0%*-+)0-0"C0-+)"D-&)")GJ")0 8K?8:\ $R$[2A8A9 % $ :=d% %&D
E-(.&C+).C*.#H , ./71!/%B"(G/*.B(%&D H(%&)+3RcH*-++".& %&%(G+"+"&D",%)-D )0%))0-F$?8:\ )*%&+,*"H)+J-*-%)%
*-(%)"K-(G(.J(-K-("& B%(-/(.J-*%&D +--D("&C+" E#)J-*-%HH%*-&)(G#HF*-C#(%)-D D#*"&C)0-D-K-(.HB-&)/*.BE#D+).
/-B%(-/(.J-*+" J0",0 "BH("-D )0%)F$?8:\ B"C0)H(%G"BH.*)%&)*.(-+"& -%*(G+)%C-.//-B%(-/(.J-*/.*B%)".&3L))0-
+%B-)"B-" )0-,.**-+H.&D"&CC-&.B",/*%CB-&)+./F$?8:\ J-*-%(+.,(.&-D /*.B9= D"/-*-&)C-*BH(%+B+/.*)0-+"&C(-
&#,(-.)"D-H.(GB.*H0"+B$7S1% %&%(G+"+3L).)%(./?> 7S1+J-*-D-)-,)-D" %&D )0-/*-P#-&,G%&D D"K-*+")G./7S1+J-*-
2U4: EH %&D A3AA= 24" *-+H-,)"K-(G360-*-J-*-4> 7S1+D-)-,)-D "& )0--c.&+./F$?8:\" %B.&CJ0",0" )0-*-J-*-22
+G&.&GB.#+%&D 2= B"++-&+-B#)%)".&+7S1+" *-+H-,)"K-(G3!"&b%C-D"+-P#"("E*"#B $!a% %&%(G+"++0.J-D )0%)!a
D-,("&-D *%H"D(GJ")0"& )0-F$?8:\ %(.&CJ")0 )0-(-&C)0 "&,*-%+"&C"& D"/-*-&)H.H#(%)".& ./F%$A*+1+)0%)!aB%HH"&CE%+-D .& F$?8:\ C-&-J.#(D E-/-%+"E(-%&D #+-/#("& F%$A*+1+A/: B"*70!\F!"A$# $A*+1+\\转录因子是真核生物基因表达调控的重要组成
部分"它们与靶基因上游特定的 aSL序列片段结
合"激活或抑制靶基因转录活性"从而调控靶基因的
特异时空表达$j".&C!"#$%" 4AA9%’ 作为植物特有
\第 ? 期 李玉岭等! 光皮桦 F$?8:\ 转录因子基因的克隆&表达及单核苷酸多态性分析
的一 类 转 录 因 子" 7N1基 因 首 先 是 在 金 鱼 草
$&1"+66/+1A**#0A-%中发现和确认的"因其能识别并
结合 $LaFE.c基因 ?U4&CN?&$ ?U4&%启动子而
被命名为 7P#%B.+%H*.B.)-*E"&D"&CH*.)-"& $ 7N1%
$Y(-"& !"#$%" 2??: %’ 在 拟 南 芥 $ &6#;+()K-+-
"/#$+#1#%等其他植物中均发现存在 7N1基因家族成
员"其基因内部存在一个高度保守的 aSL结合域"
被称为 7N1D.B%"&"由于这些基因能编码类似 7N1
蛋白"将它们称为类 7N1 $ 7M’L$@7L H*.B.)-*
E"&D"&CF("b-"71!% 基因 $;%*D.& !"#$%" 2???# 7).&-
!"#$3" 4AA9# %^B%+%b"!"#$%" 4AA:%’ 已有的研究表
明"?8: 基因家族在植物中参与了如开花时间的调
节&种子的萌发&胚胎的发育&产量的形成等不同的
发育过程$$"#*%!"#$%" 4A2A# 7,0J%*r!"#$%" 4AA>#
h%&C!"#$%" 4AA?# #^ !"#$%" 4A2A%’ 例如"拟南芥
?8:] 编码的蛋白能够识别花分生组织特征基因
&8\ $?U4&的同源基因%的启动子"调控 &8\ 的表
达"从而控制成花的过程# 且其在拟南芥中的过量
表达会引起提前开花"因而被认为是调控开花的重
要因子 $;%*D.& !"#$3" 2??=# 代法国等" 4A2A%’ 在
水稻$N67H# -#"+5#%中"N-?8:\^ 能够促进花序的分
枝&控制植株形态"且其在0日本晴(中的过量表达
提高了水稻的产量 $$"#*%!"#$%" 4A2A# ["%.!"#$%"
4A2A%’ 同样地"在林木中也发现 ?8: 基因可能与
成花和花的发育相关’ 如白桦 $F!"A$# K$#"7K/7$#%
NH71!2 蛋白能特异结合 FKC&S?_ 启动子"被认为
参与调节 花 发 育 $!u&&-&Huu!"#$3" 4AA8 %# 枳
$8)1,+6A-"6+<)$+#"#% 的 4 个转录因子 ?8:‘ 和 ?8:\]
可能对茎和果实的发育有调控作用 $宋长年等"
4A2A %’ 同 时" 该 基 因 家 族 的 很 多 成 员 是
B",*.XSL29:$B"X29:%的靶基因"其基因序列上具
有 B"X29: 的识别靶序列"其表达受 B"X29: 的调控
$S.&.C%b"" 4A2A# h%&C!"#$%" 4A22# ‘.# !"#$%"
4A22%’ B"X29: 介导的 ?8:-基因表达也被认为是
调控植物开花的内源性途径 $h%&C!"#$%" 4AA?%’
如在拟南芥 ?8:]"?8:^ 和 ?8:_ 中存在 B"X29: 的
调控位点"研究人员通过减少 B"X29: 的含量"结果
导致 ?8:] 表达增强和植株提前开花"表明 B"X29:
通过调控 ?8:] 的表达来实现幼年期到成年期的转
变 $h# !"#$%" 4AA:# Z.*&%*%!"#$%" 4AA?# h%&C
!"#$%" 4AA? %’ 在水稻中" N-?8:\^ 也直接受 到
N-*+B\_a 的调控"来控制花序的分枝和植株形态"
从而影响水稻的产量$["%.!"#$%" 4A2A%’
光皮桦 $F!"A$# $A*+1+木科$N-)#(%,-%-%桦木属$F!"A$#%落叶乔木"属我国
特有速生树种"主要分布于秦岭和长江流域以南至
两广北部及西部"其材质优良"纹理细致"木材坚硬"
是高级实木家具&高级胶合板和实木地板等的优良
材料"也是近年来我国南方部分地区大力发展的重
要用材树种$郑万钧" 2?>9# 胡晓媛等" 4AA:%’ 本
课题组前期对全分布区的光皮桦天然种群进行了调
查和种质收集"发现在天然种群中存在丰富的遗传
变异"来自不同种源的种质在材性&叶形&花期等性
状上存在显著差异 $陈奕良等" 4AA?# 张俊红等"
4A2A%’ 这些变异丰富的材料为研究相关基因的
7S1+$+"&C(-&#,(-.)"D-H.(GB.*H0"+B+%变异与关联分
析提供了优良材料和重要基础’ 7S1+作为基因组
中最丰富的多态性位点"已经成为遗传作图&关联分
析&多样性分析以及图位克隆的重要工具$X%/%(+b""
4A2A%’ 基于候选基因 7S1+的关联遗传分析已成
为揭示林木基因型与表型内在联系的重要手段"逐
渐应用于林木的分子辅助育种研究 $王荣焕等"
4AA=# 60#BB%!"#$%" 4AA9# ‘.&rv(-rF$%*)w&-r!"#$%"
4AA=%’ 因此"本研究以具有丰富变异的光皮桦为
材料"分离克隆了与成花相关的 F$?8:\ 基因"并对
其进行了表达&7S1以及连锁不平衡$!a% 分析"为
在光皮桦中开展基于 F$?8:\ 基因的连锁不平衡作
图和辅助育种提供科学依据’
2\材料与方法
EDEF植物材料
用于基因克隆的材料为 9 年生光皮桦无性系植
株# 用于基因表达分析的材料为 : 年生光皮桦无性
系植株上的芽及不同发育时期的雌花和雄花$2 月
中旬至 5 月底%# 用于 7S1分析的材料为来自黄山
东部$浙江临安和安徽黄山%&武夷山东部$福建武
夷山和温州%&四川&贵州&广西光皮桦天然分布区
的 9= 个无性系$: 年生%’ 所有无性系均种植于浙
江农林大学良种繁育中心苗圃内’
EDGF基因组 9!@的提取
基因组 aSL的提取按改良的 ;6LN法$谢一青
等" 4AA:%’
EDCF总 X!@的提取和 ,9!@的合成
总 XSL的提取采用 6*"r.(法",aSL合成采用
1*"B-7,*"H)(X6*-%C-&)Y")$6%Y%X%%"均按照试剂
盒说明书进行’
EDLF,9!@和 9!@序列的克隆
依据已测序的光皮桦转录组序列设计特异引物
9mF‘712$表 2 %进行 9mFXL;R"XL;R具体步骤按
7$LX66$XL;R,aSLLBH("/",%)".& Y")$;(.&6-,0%
59
林 业 科 学 8? 卷说明书进行’ 根据克隆获得的全长序列"设计引物
92Z和 92X$表 2%"用于全长 ,aSL和相应基因组
aSL序列的克隆’ 1;X扩增程序为!?8 o 预变性
9 B"&# ?8 o 5A +"99 o 5A +"=4 o 5 B"&"扩增 59
个循环# =4 o 延伸 9 B"&’ 克隆所用 6载体为
H‘R$F6R%+GI-,).*$1*.B-C%%"测序由南京金斯瑞
生物科技公司完成’
EDNF序列分析
利用 S#,(-",6..(+$ 0)H!UU+*+3-E"3%,3#bU
+*+E"&U,C"FE"&UJC-)rFH%C-]%HH(7-(-,)% 分 析 推 测
F$?8:\ 基因编码蛋白的氨基酸组成’ 用 1*.)1%*%B
)..($ 0)H!UUJJJ3-cH%+G3.*CU)..(+UH*.)H%*%B30)B(%
工具推测分子量和等电点 $ HQ%’ 利用蛋白质保守
结构域推测工具 Q&)-*1*.7,%& $ 0)H!UU-E"3%,3#bU
6..(+3UQ&)-*1*.7,%&U%分析其结构域’ 采用 I-,).*
S6Q22TA 进行多序列比对’
基于拟南芥&水稻&毛果杨$8)KA$A-"6+,/),#6K#%&
小立 碗 藓 $8/7-,)*+"6!$# K#"!1-%& 番 茄 $ ?)$#1A*
$7,)K!6-+,A*%&衣藻$=/$#*7()*)1#-6!+1/#6("+%的 71!
蛋白中 7N1FD.B%"&区氨基酸序列$=: %%%"采用 $R‘L
8TA 软件$邻接法%进行多序列比较"对光皮桦 N(71!2
进行系统进化分析 $6%B#*%!"#$%" 4AA=%"所用序列来
自数 据 库 1(&6ZaN $K5TA % $ 0)H!UUH(&)/DE3E".3
#&"H.)+D%B3D-UK5TAU%&S;NQ$ 0)H!UUJJJ3&,E"3&(B3
&"03C.K%&1(%&)6ZaN$0)H!UUH(%&)/DE3,E"3-D#3,&%’
具体的基因名和序列号参考 7%("&%+等$4A22%的报道’
EDOFX/&)’(4/>-X
X-%()"B-1;X按照7 N^X( 1XR$QjRj6LM6$
QQ$6LYLXL%试剂盒说明进行"其扩增反应程序为!
?9 o 9 B"&# ?9 o 9 +":A o 4A +"=4 o 4A +"8A 个
循环’ 定量引物为 92MZ和 92MX"内参基因 &,"+1
的引物为 L,)"&MZ和 L,)"&MX$表 2%"采用相对定量
分析基因表达’
ED[F$!>分析
鉴于 F$?8:\ 基因组序列较长"为便于克隆和测
序"将其分成 L和 N4 段进行克隆&7S1搜寻与分
析"其中 L片段包含 9mF’6X部分序列和第 2&4 个
外显子及第 2 个内含子&第 4 个内含子部分序列共
2 ::9 EH"N片段包括第 4 个内含子部分序列&第 5
个外显子 $含 B"X29: 靶位点%以及 5mF’6X共 >8:
EH’ 引物 92Z855 和 92X4A?> 用于 L片段的克隆"
92Z4:A> 和 92X用于 N片段的克隆 $图 4%’ 以 9=
个不同种源的无性系植株基因组 aSL为模板"采用
高保真 1/# 酶$北京全式金%进行 1;X扩增"1;X扩
增产物回收后采用 HRL7 F^N(#&),(.&"&CY")进行克
隆"挑取阳性克隆进行序列测定"每个样本至少挑 5
个克隆进行测序’ 利用 a&%719TA 软件 $!"E*%D.!"
#$%" 4AA?%对序列进行分析"搜寻 7S1位点&计算
7S1频率及多样性指数# 分析同义突变&错义突变
和无义突变情况# 分析 !a在光皮桦不同群体
F$?8:\ 基因中的延伸模式’
表 EF用于基因克隆和表达分析的引物
H&5IEF>*(4/*0+0/71"*=/#/,)"#(#= 
/J%*/00("#&#&):0(0
引物名称
1*"B-*&%B-
序列
7-P#-&,-$9m)5m%
9m‘712 ;‘L‘‘‘‘66;6‘‘;6‘L‘‘;66;;
92Z 6‘‘LL‘6;6;6‘;6L;6;;;;6‘;
92X L;L6;L;L‘‘‘;‘‘LLL;;L6L‘6
92Z855 ;‘‘‘66‘L6LL‘‘6‘6‘6‘‘L
92X4A?> 6‘;L;L6;;6L;66;L‘L‘;6‘L
92Z4:A> 6‘66‘L‘LL‘L‘;L;;LLLL‘L;6
92MZ ;6;‘‘666;L;;;L;L6L‘;6;L
92MX 6‘L6;;L6;L‘L;;;;L6‘6‘L
L;6MZ ‘;;LL;L‘L‘LLLL‘L6‘L;6;
L;6MX 6;L;;L‘LL6;;L‘;L;LL6L;
4\结果与分析
GDEF光皮桦 :,27;< 基因的克隆及其序列分析
基于光皮桦转录组序列"利用 XL;R技术"克隆
获得了 F$?8:\ 基因’ 序列分析结果表明"该基因
,aSL序列全长 2 >49 EH"分别包含 8>: EH 的
9mF’6X" 2:? EH 的 5mF’6X"以及长为 2 2=A EH 开放
阅读框"其编码 5>? 个氨基酸’ 用 1*.)1%*%B)..(估
算推导的蛋白质的分子量约为 84T5= ba%"其等电点
为 >T85’ 同源分析表明"F$?8:\ $Y;22AA>A%与桃
$86A1A-K!6-+,#%8K?8:\ $R$[2A8A9%&苹果$C#$A-e
()*!-"+,#%C(?8:\ $La!5:>48T2%的序列同源性最
高"分别达到 :=d和 :Ad $图 2%’ 同时"为进行后
续的 7S1分析"根据 ,aSL序列克隆了其对应的基
因组 aSL序列’ 结果表明 F$?8:\ 的基因组序列全
长 5 89= EH"包含 4 个内含子和 5 个外显子"第 2 个
内含子长 2 AA9 EH"第 4 个内含子为 :48 EH"5 个外
显子分别长 82: EH" 258 EH":4A EH"在第 5 个外显
子处含有 B"X29: 靶位点 $图 4%’
进一步的蛋白结构域分析表明"F$?8:\ 在蛋白
质的第 ?4)2=A 氨基酸残基位置上含有该基因家族
所特有 7N1结构域"此结构域包含 4 个锌指结构"
其中 S端锌指结构 $_&F2%为 ;G+5<"+";端锌指结
构$_&F4%为 ;G+4<"+;G+"另外在该结构域的 ;端第
29A)2:= 位 置 上 含 有 核 定 位 信 号 $ S#,(-%*
!.,%("r%)".& 7"C&%("S!7 % $图 2 %" 这与相关报道
$N"*b-&E"0(!"#$%" 4AA9# %^&C!"#$%" 4AA>E% 相符’
89
\第 ? 期 李玉岭等! 光皮桦 F$?8:\ 转录因子基因的克隆&表达及单核苷酸多态性分析
为分析 F$?8:\ 基因的系统进化关系"参照 7%("&%+
等$4A22%构建了 7N1FE.c基因家族系统发育进化
树’ 由图 5 可见"陆地植物 71!蛋白分化为 > 个分
支"即 C*.#H ! W-"而 N(71!2 属于 C*.#H ,这一分
支"与来自水稻&拟南芥和杨树的相关 71!蛋白同
属一个分支"且与杨树的 1)7N14A 亲缘关系最近’
图 2\N(71!2 与其他植物 71!蛋白质的同源比对
Z"C32\7-P#-&,-%("C&B-&)./N(71!2 %&D *-(%)-D 71!/*.BD"/-*-&)H(%&)+
$D71!2$La!5:>48T2% !苹果 C#$A-e ()*!-"+,## 1H71!2 $R$[2A8A9 % !桃 86A1A-K!6-+,## 1)71!2 $j1tAA45444=5T2 % !毛果杨
8)KA$A-"6+,/),#6K## L)71!25$S1t9:>=52T2 % !拟南芥 &6#;+()K-+-"/#$+#1#% !B"X29: 靶位点编码的多肽 60-,.&+-*K-D H-H)"D-
-&,.D-D EG)0-B"X29: )%*C-)+")-3
图 4\光皮桦 F$?8:\ 基因的结构示意
Z"C34\7,0-B%)",+)*#,)#*-./)0-F$?8:图由 aSL4TA 公司的软件 ‘-&-a-+"C&-*$L(%& !"#$%" 4AA:%绘制3‘*%H0",J%+B%D-EGB-%&+./‘-&-a-+"C&-*EGaSL4TA Q&,3$L(%& !"
#$%" 4AA:%3L" N!7S1分析区域 7S1%&%(G+"+*-C".&# Q! 外显子 2 Rc.& 2# QQ!外显子 4 Rc.& 4# QQQ!外显子 5 Rc.& 53
GDGF:,27;< 基因的表达分析
?8: 基因在植物成花过程中被认为是比较上游
的调控因子$定量 1;X对 F$?8:\ 基因在光皮桦芽&雌花&雄花以
及幼苗早期不同发育阶段的表达情况进行了分析’
由图 8 可见"F$?8:\ 基因在光皮桦的芽&雌花&雄
99
书林 业 科 学 !" 卷#
花!幼苗中均有表达"但在雄花和幼苗中的表达水平
较低"而在芽发育成雌花的过程中其表达逐渐升高
#图 !$% &$’$"在雌花明显可见时#图 !(%$表达量
达到最高"其后表达量又逐渐降低 #图 !() &(’$%
从这些结果可以初步推测 !"#$%& 可能在芽发育为
雌花的过程中起调控作用%
图 ’#光皮桦 $*+,-% 蛋白的系统进化分析
(./0’#,12*3/4546.7858*29.93:$*+,-% 85; +,-<=364.5 :=3>=4*864; <*8569<47.49
图 !#!"#$%& 基因在不同器官和不同发育时期组织中的表达分析
(./0!#?@<=499.35 858*29.93:!"#$%& .5 ;.:4=4563=/85985; 6.99A49:=3>;.:4=456;4B4*3<>456968/49
上图为光皮桦不同器官在不同发育阶段的示意#$8=C% 7>$ "下图为 !"#$%& 在对应材料中的表达情况%
D1463< 3::./A=4=4<=494569614;.:4=456;4B4*3<>4568*<189493:;.:4=4563=/859.5 !’()"* ")+,-,.’/*#$8=C% 7>$ & D14
E363>3::./A=4913F96144@<=499.35 <864=593:!"#$%& .5 61473==49<35;.5/>864=.8*90
$% &$’’芽的不同发育阶段 D14;.:4=456;4B4*3<>4568*<18943:EA;& (% &(’’早期雌花的不同发育阶段D14;.:4=456
;4B4*3<>4568*<18943:48=*2:4>8*4:*3F4=& G% &G’’雄花的不同阶段 D14;.:4=456;4B4*3<>4568*<18943:>8*4:*3F4=&
+%"+)’苗的不同发育时期 D14;.:4=456;4B4*3<>4568*<18943:23A5/<*85690
HI
\第 ? 期 李玉岭等! 光皮桦 F$?8:\ 转录因子基因的克隆&表达及单核苷酸多态性分析
GDCF:,27;< 基因 $!>多样性分析
分析基因在自然群体中的 7S1多样性是进行
连锁不平衡作图的基础"同时也可获知该基因在种
内演化过程中是否遭受自然选择的影响’ 以来自主
要天然分布区 9= 株不同基因型的光皮桦个体为材
料"克隆 F$?8:\ 基因片段进行 7S1位点搜寻和分
析’ 结果显示"在检测的光皮桦不同基因型中"
F$?8:\ 基因内存在 5 次缺失& 5 次插入及 ?> 个
7S1+$含 2 个位于非编码区的三态 7S1位点% $表
4%’ 插入和缺失长度在 2 f5 EH 之间"其中编码区
有一长度为 5 EH 的插入"未导致编码区的移码突
变"其余均发生在非编码区’ F$?8:\ 基因内 7S1发
生的平均频率为 2U4: EH"在 9mF’6X&外显子&内含
子&5mF’6X分别检测到了 4&4>&:2&= 个 7S1+"其出
现频率为内含子 i5mF’6Xi9mF’6Xi外显子’ 由
7S1在 F$?8:\ 基因内部出现的频率可知"该基因不
同区域的保守性不同"而在编码区核苷酸变异程度
最低"显示了该基因在进化过程中编码区受到了较
强的选择压’ 进一步对检测到的 ?= 个 7S1+进行了
变异类型统计$表 5%’ 结果显示"在这些 7S1+中"
有 9= 个属于转换类型"分别包含 4? 个 L)‘和 4>
个 6);’ 对于颠换类型"共检测到 8A 个"分别是 28
个 L);&= 个 6)‘&22 个 L)6和 > 个 ‘);"转
换U颠换 k2T85$表 5%’
表 GF在 :,27;< 基因组不同区域检测到的 $!>数量及其频率
H&5IGF!+45/*G*/V+/#,: "1$!>07/’/,’/7(#7(11/*/#’*/=("#0"1:,27;<
F$?8:\ 总数
6.)%(
9m非翻译区
9mF’6X
外显子
Rc.&
内含子
Q&)*.&
5m非翻译区
5mF’6X
序列长度 ‘-&-(-&C)0UEH 4 922 98 2 2=A 2 22> 2:?
7S1数量 7S1&#BE-* ?> 4 4> :2 =
7S1频率 7S1/*-P#-&,GUEH W2 4: 4= 84 2> 48
表 CF:,27;< 基因内部 $!>替代类型
H&5ICFH./0+50’(’+’("#’:%/0"1$!>01"*:,27;<
基因
‘-&-
二态 7S1数量
M#%&)")G./
D"B.*H0",7S1+
替代类型 7#E+)")#)".& )GH-+
转换 6*%&+")".&+ 颠换 6*%&+K-*+".&+
L)‘ 6); L); 6)‘ L)6 ‘);
F$?8:\ ?= 4? 4> 28 = 22 >
\\为检测 F$?8:\ 编码区 7S1+是否引起其编码氨
基酸的改变"对编码区内的 4> 个 7S1+进行了同义
突变&错义突变&无义突变分析’ 在 F$?8:\ 编码区
内的 4> 个 7S1+中" 22 个属于同义突变" 2= 个为错
义突变’ 其在 7N1D.B%"& 区域内发生了 4 次同义
突变和 A 次错义突变"而在 7N1D.B%"& 外的编码区
发生了 ? 次同义突变和 2= 次错义突变"如位于编码
区的第 2=4 和第 2?=8 位置上分别发生了第 2 位和
第 4 位密码子的改变"由 L‘L突变为 ‘‘L"‘;L突
变为 ‘LL"从而分别导致其编码的氨基酸由精氨酸
$L*C%变成甘氨酸$‘(G%&丙氨酸 $L(%%变成谷氨酸
$‘(#%’ 可知 7N1D.B%"& 编码区内无错义突变"而
7N1D.B%"& 以外编码区错义突变频率为 2U2>%%# 又
基因的第 5 个外显子内错义突变达 29 个"而其区域
内的 B"X29: 靶位点$图 4%没有核苷酸突变位点出
现$表 8%’ 由以上可知 7N1D.B%"& 和 B"X29: 靶位
点有很强的保守性’
表 LF:,27;< 编码区内 $!>的突变类型
H&5ILF2+’&’("#’:%/0"1$!>0)",&’/7(#,"7(#= */=("#(#:,27;<
基因
‘-&-
编码区长度
!-&C)0 ./
,.D"&C
*-C".&UEH
编码氨基酸数量
M#%&)")G./
%B"&.%,"D+
-&,.D-D
同义突变 7G&.&GB.#+B#)%)".& 错义突变 $"++-&+-B#)%)".&
7N1结构域
7N1D.B%"&
7N1结构域外$B"X29:%
@#)+"D-./7N1
D.B%"& $B"X29:%
7N1结构域
7N1D.B%"&
7N1结构域外$B"X29:%
@#)+"D-./7N1
D.B%"& $B"X29:%
F$?8:\ 2 2=A 5>? 4 ?$A% A 2=$A%
GDLF:,27;< 基因在光皮桦不同群体内的遗传分化
及变异
为了检测 F$?8:\ 基因在光皮桦不同群体内核
苷酸变异及群体分化程度"利用 a&%719TA 软件对 9
个群体分别进行了多态性位点数&单核苷酸多样性&
6%V"B%(+S#和 Z# %&D !"(+S# $6%V"B%" 2?>?# Z# !"
#$%" 2??5%的中性检验 $表 :%’ 对于检测到的 7S1
多样性指数 ").)&"+"(&"+&"&均有差异"但差异不显
=9
林 业 科 学 8? 卷著"说明 F$?8:\ 在群体间的分化程度并未达到显著
水平’ 6%V"B%(+S#和Z# %&D !"(+S#中性检验结果
表明"S# 均为负值"这显示了在光皮桦群体内"
F$?8:\ 基因在进化过程中存在过剩的稀有 7S1+"特
别是广西群体内存在较多的低频率 7S1+’ 而 9 个
群体"均为 "& p"+"即非同义突变与同义突变的比
率 p2"显示出在光皮桦物种演化过程中"纯化选择
是 F$?8:\ 基因内同义 7S1位点的主要筛选压’
表 OF:,27;< 基因在不同群体内的核苷酸变异%
H&5IOF$+44&*: "1#+,)/"’(7/?&*(&’("#(#O %"%+)&’("#01"*:,27;<
群体
1.H#(%)".&
个体数
1
位点数
-
").) "+"( "+ "&
6%V"B%(+
S#
Z# %&D !"(+
S#
黄山东部 R%+)./<#%&C+0%& > 88 ATAA= A4 ATAA> :A ATA2A 28 ATAA5 :? W2T8>> :? W2T:A: ?=
武夷山东部 R%+)./h#G"+0%& ? 8: ATAA: 5= ATAA> 44 ATAA> ?A ATAA4 >5 W2T:58 9A W2T?49 ?:
四川 7",0#%& 24 :A ATAA= A> ATA2A A4 ATAA: A= ATAA5 AA W2T:=4 A8 W4T25A ?=
广西 ‘#%&Cc" 2= 9? ATAA: >> ATAA> >> ATAA= :4 ATAA5 :> W2T>2= 59 W5T52> >A
贵州 ‘#"r0.# 22 98 ATAA= 5= ATAA? 22 ATAA? 8= ATAA8 28 W2T:A8 ?9 W4T548 49
总和 6.)%( 9= ?> ATAA= 24 ATAA? 2A ATAA> 89 ATAA5 99 W4T549 :5 W:T482 8?
\\%1!测序的样本数 S#BE-*./+-P#-&,-++%BH(-D# -!分离的位点数 S#BE-*./+-C*-C%)"&C+")-+# ").)!整个基因区域单核苷酸多样性 LK-*%C-
&#,(-.)"D-D"K-*+")G"& /#(C-&-# "+"(!非编码区和内含子区域的单核苷酸多样性 LK-*%C-&#,(-.)"D-D"K-*+")G"& #&F)*%&+(%)-D *-C".& %&D "&)*.&+# "+!
编码区同义突变单核苷酸多样性 LK-*%C-&#,(-.)"D-D"K-*+")G./+G&.&GB.#+B#)%)".&# "& !编码区内非同义突变多样性 LK-*%C-&#,(-.)"D-D"K-*+")G
./&.&F+G&.&GB.#+B#)%)".&3
\图 9\不同群体间 F$?8:< 基因内 7S1+的连锁不平衡
Z"C39\!"&b%C-D"+-P#"("E*"#B./7S1+"& F$?8:\ /*.BD"/-*-&)H.H#(%)".&+
GDNF:,27;\ 基因内 $!>0的连锁不平衡分析
为分析 F$?8:\ 基因内 7S1位点间在光皮桦不
同群体内连锁不平衡$("&b%C-D"+-P#"("E*"#B"!a%的
延伸长度及程度"利用 a&%719TA 软件中的 !a程序
进行分析’ 由图 9 可知"随着 F$?8:\ 基因核苷酸序
列长度的增加"7S1+的 !a程度迅速削弱"但不同群
体内 !a衰退程度明显不同# 当 B4 pAT2"在黄山东
部&武夷山东部&广西&四川&贵州群体中 !a衰退序
>9
\第 ? 期 李玉岭等! 光皮桦 F$?8:\ 转录因子基因的克隆&表达及单核苷酸多态性分析
列长度分别达到 2 249">5>"=99"9:5":=> EH"其中
来自四川的群体 !a在该基因组延伸长度最短’ 这
一结果表明"在光皮桦不同天然群体内"F$?8:\ 基
因内 7S1+存在不同程度的连锁不平衡"但其连锁
不平衡在候选基因内就已衰退’
5\讨论
?8: 基因是植物特有的一类转录因子"典型特
征为其编码的氨基酸序列有一个高度保守的 7N1
结构域’ 目前的研究表明"?8: 基因广泛分布于低
等到高等的植物中"对植物的不同发育过程和生理
反应起重要调控作用$j"-!"#$%" 4AA:# X"-+-!"#$%"
4AA=# ‘#.!"#$%" 4AA># #^ !"#$%" 4A24%’ 本研究首
次从光皮桦中分离获得 F$?8:\ 基因"序列分析表明
在其第 5 个外显子处含有B"X29: 靶位点"同时其编
码的氨基酸具有典型的 7N1FD.B%"&"包含 4 个典型
的锌指结构 $图 2%’ 进一步的系统进化分析表明
N(71!2 属于陆地植物 71!蛋白 C*.#H ,这一分支
$7%("&%+!"#$%" 4A22%"且与杨树的 8"?F8bc&拟南芥
&"?8:\] 等具有较近的亲缘关系$图 5%"基因组序
列分析结果也显示 F$?8:\ 的基因结构与这一分支
的同源基因相似$图 4% $‘#.!"#$%" 4AA># 7%("&%+!"
#$3" 4A22%"因此这些基因在功能上可能有一定的相
似性"但目前这一分支的基因并没有深入的功能研
究’ 同时"系统进化分析显示在每个 ?8: 蛋白分支
中都包含至少一个单子叶和双子叶植物的 ?8: 基
因$C*.#H $除外%"这表明 F$?8:\ 与其他高等植物
的 71!基因可能具有共同的祖先"而在 C*.#H ,分
支中"F$?8:\ 与同为林木的杨树 ?8: 基因亲缘关系
最近"反映了光皮桦与杨树间的亲缘关系"同时也表
明随着双子叶植物的分化"其相应的 ?8: 基因可能
也在进一步的特化’
虽然 ?8: 基因在植物中参与不同的生长发育
调控"但目前对功能的研究主要集中于其对开花过
程的调控’ 在模式植物拟南芥中的研究说明"
B"X29:F?8:] 是调控植物成花的重要途径$#$%" 4A24# Y"B!"#$%" 4A24%’ 但在林木中"?8: 基因
的功能和调控机制仍然不明确’ 由于缺乏可用转基
因平台或突变体"目前对木本植物 ?8: 基因功能的
研究大多是通过表达分析来进行研究’ 如对枳的
?8:‘ 和 ?8:\] 进行了表达分析"发现两者在叶&茎&
根&花&果等各个器官均有表达"分别在茎和幼果中
表达量最高"推测它们可能分别与茎和果实的发育
相关$宋长年等" 4A2A%’ F$?8:\ 基因的表达也具
有组成性"在幼苗&芽&雄花和雌花均有表达"在雄花
和幼苗中表达水平较低"但在芽发育成雌花的过程
中有一个明显的表达水平上调"这些结果暗示
F$?8:\ 与光皮桦的开花相关"且可能在雌花发育过
程中起调控作用$图 8%’ 当然"这种组成性的表达
不是木本植物特有的’ 如拟南芥全部 ?8: 基因在
其花分生组织和四轮花器官中均有表达"在茎&叶等
营养器官中亦有表达$ %^&C!"#$%" 4AA>%%’ 陆地棉
$G)--7K+A*/+6-A"A*% G/?8:] 在根&茎&叶&花&顶芽
中均有表达"并且在具 5 片真叶的顶芽和花中表达
量最高$李洁等" 4A24%’ 这说明 ?8: 基因的组成性
表达在高等植物中可能是保守的"也暗示了其功能
的多样性’
由于 ?8: 基因在成花过程中的重要调控作用"
同时光皮桦群体在开花性状上存在广泛的变异"因
此选择 ?8: 基因作为候选基因"在光皮桦中研究其
7S1变异"可能有助于挖掘与开花性状相关的 7S1
位点"以及阐明开花性状变异的内在分子机制’
7S1分析表明"在光皮桦 F$?8:\ 基因内存在丰富的
7S1变异"多样性水平为 ATAA= 24& 7S1频率为
2U4:’ 在可能影响蛋白功能的编码区中存在 4> 个
7S1"在保守的 7N1FD.B%"& 内"存在 4 个 7S1+"错义
突变U同义突变等于零"而在 7N1FD.B%"& 外的编码
区存在 4: 个 7S1+"其错义突变U同义突变 i2’ 这
说明 ?8: 基因的不同区域受到了不同的进化选择
压力"7N1FD.B%"& 受到较大的进化压力"是纯化选
择的作用# 而除 7N1FD.B%"& 外的其他区域的进化
压力较小"进化速率较快"受到正向选择作用$ %^&C
!"#$%" 4AA>E%’ 这种正向选择是基因复制后产生蛋
白新功能的主要驱动力"说明 ?8: 基因在进化中其
功能在进一步分化"类似正向选择的现象在拟南芥
和水稻 X!Y和 a./基因家族中也同样存在 $ 70"#
!"#$%" 4AA8# %^&C!"#$%" 4AA:%’
连锁不平衡$!a%程度可以反映性状与 7S1间
相关性"是进行 !a作图的前提’ 一般认为"开展基
于候选基因或全基因组 !a作图"取决于 !a在目标
物种基因组中延伸的长度及程度"在人类&动物和植
物中存在较大差异$_0%&C!"#$%" 4AA9%’ 如 !a在
人类中可从 9 bE 延伸到 9AA bE"这使得人类全基因
组!a作图成为可能$X-",0 !"#$3" 4AA2%’ 然而在植
物中 !a的延伸范围变异很大"自交植物如拟南芥
可延伸至 49A bE $S.*DE.*C!"#$%" 4AA4%"但异交植
物如玉米$.!# *#7-% !a延伸仅在 2 bE 之内就已消
失 $X-B"&C).& !"#$3" 4AA2%# 在松树&杨树&桉树等
林木中 !a延伸在 2bE 至几 bE 内迅速消失 $N*.J&
!"#$%" 4AA8# S-%(-!"#$%" 4AA8# Q&CK%*++.&" 4AA9# 徐
?9
林 业 科 学 8? 卷煲铧等" 4AA?%’ 这说明群体结构对!a的延伸和程
度会有较大的影响’ 在光皮桦同样观察到 F$?8:基因 7S1+在不同群体的 !a延伸在较短的距离内
迅速消失$图 9%"与杨树等异交植物具有同样的特
征’ 但在不同光皮桦群体内"F$?8:\ 基因 7S1+的
连锁不平衡程度衰退程度明显不同"四川群体 !a
程度最小"延伸长度也最短"其原因可能是地理隔离
使得不同群体间的基因交流减少"使得 F$?8:\ 在进
化过程中发生了遗传漂变’
参 考 文 献
陈奕良"谢正成"张俊红"等34AA?3天然光皮桦树干生长特性初步研
究3浙江林业科技" 4?$8% !=5 W==3
代法国"胡宗利"陈国平"等34A2A3植物特有的 7N1FE.c基因家族的
研究进展3生命科学" 44$4% !299 W2:A3
胡晓媛"李志真"粱一池34AA:3优良速生树种光皮桦研究进展3福建
林业科技"55$4% !29? W2:53
李\洁"范术丽"宋美珍"等34A243陆地棉 G/?8:] 基因的克隆&亚细
胞定位及表达分析3棉花学报" 48$9% !828 W82?3
宋长年"钱剑林"房经贵"等34A2A3枳 ?8:‘ 和 ?8:\] 全长 ,aSL克
隆&亚 细 胞 定 位 和 表 达 分 析3中 国 农 业 科 学" 85 $ 2A % !
42A9 W42283
王荣焕"王天宇"黎\裕34AA=3植物基因组中的连锁不平衡3遗传"
4?$22% !252= W25453
谢一青"李志真"黄儒珠"等34AA:3光皮桦基因组 aSL提取方法比
较3浙江林学院学报" 45$:% !::: W::>3
徐煲铧"杨晓慧"李百炼"等34AA?3毛白杨纤维素合酶基因 8"=!-^的
克隆&表达及单核苷酸多态性分析3林业科学"89$9% !> W2A3
张俊红"黄华宏"童再康"等34A2A3光皮桦 : 个南方天然群体的遗传
多样性3生物多样性" 2>$5% !455 W48A3
郑万钧32?>93中 国 树 木 志3第 4 卷3北 京! 中 国 林 业 出 版 社"
4248 W42523
L(%& IL"S-++[R"‘#+)%/++.& ;"!"#$34AA:3‘-&-D-+"C&-*! %+G&)0-)",
E".(.CG )..( /.* ,.&+)*#,)"&C %*)"x,"%( aSL +-CB-&)+3N$;
N"."&/.*B%)",+"=!4>93
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9>9 W9?:3
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2A2 $84% !29499 W294:A3
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71!)*%&+,*"H)".& /%,).*31(%&);-(" 45 $8% !2924 W29443
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W22983
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%+H-& $8)KA$A-"6!*A$# !3" 7%(",%,-%-%3‘-&-)",+" 2:? $4% !?89
W?953
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@+71!28 EG@+B"X29: D-/"&-+"D-%(H(%&)%*,0")-,)#*-"& *",-3
S%)#*-‘-&-)",+"84$:% !982 W9883
Y"B[["!--[<"Y"Bh"!"#$%4A24360-B",*.XSL29:F7M’L$@7L
1X@$@6RXNQSaQS‘1X@6RQSF!QYR5 B.D#(-*-C#(%)-+%BE"-&)
)-BH-*%)#*-F*-+H.&+"K-/(.J-*"&CK"%Z!@hRXQS‘ !@;’7 6"&
&6#;+()K-+-31(%&)10G+".(" 29?$2% !8:2 W8=>3
Y(-"& [" 7%-D(-*<" <#"V+-*132??:3L &-J /%B"(G./aSL E"&D"&C
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S-%(-aN"7%K.(%"&-& @34AA83L++.,"%)".& C-&-)",+./,.BH(-c)*%")+"&
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S.*DE.*C$"N.*-K()r[@"N-*C-(+.& ["!"#$34AA4360--c)-&)./("&b%C-
D"+-P#"("E*"#B"& &6#;+()K-+-"/#$+#1#3S%)‘-&-)"5A!2?A W2?53
S.&.C%b"<34A2A3$",*.XSL C-&-*-C#(%)".& ,%+,%D-+D#*"&C-%*(G
+)%C-+./H(%&)D-K-(.HB-&)31(%&)%&D ;-(10G+".(.CG" 92 $ 22 % !
2>8A W2>8:3
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X-",0 aR";%*C"($"N.(b 7"!"#$34AA23!"&b%C-D"+-P#"("E*"#B"& )0-
0#B%& C-&.B-3S%)#*-"822!2?? W4A83
X-B"&C).& a!"60.*&+0-**G[$"$%)+#.b% "^!"#$34AA237)*#,)#*-./
("&b%C-D"+-P#"("E*"#B %&D H0-&.)GH",%++.,"%)".&+"& )0-B%"r-
C-&.B-31SL7"?>$4A% !228=? W228>83
X"-+-$"<.0B%&& 7"7%-D(-*<"!"#$34AA=3;.BH%*%)"K-%&%(G+"+./)0-
7N1FE.cC-&-/%B"("-+"& 8%K#"!1-%&D +--D H(%&)+3‘-&-" 8A2!
4> W5=3
A:
\第 ? 期 李玉岭等! 光皮桦 F$?8:\ 转录因子基因的克隆&表达及单核苷酸多态性分析
7%("&%+$" j"&C7" <.0B%&& 7" !"#$34A223‘-&.B",.*C%&"r%)".&"
H0G(.C-&-)",,.BH%*"+.& %&D D"/-*-&)"%(-cH*-++".& ./)0-7N1FE.c
/%B"(G./)*%&+,*"H)".& /%,).*+"& ).B%).31(%&)%" 459 $ : % !22=2 W
22>83
7,0J%*r7" ‘*%&D-L I" N#VD.+.S" !"#$34AA>360-B",*.XSL
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