全 文 ：第 !" 卷 第 #$ 期
% $ # # 年 #$ 月
林 业 科 学
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./01!"!*/1#$
2345!% $ # #
松属近缘种形态和分子鉴定及其亲缘关系探讨
洑香香6赵6虎6王6玉
"南京林业大学森林资源与环境学院6南京 %#$$7"$
摘6要!6松属"油松组$树种是我国重要的造林树种!但其种子和幼苗难以区分& 通过比较种子的千粒质量%种子
形状%颜色%幼苗子叶数%幼苗下胚轴颜色和苗高!结合 (&&k和 &&k标记技术!鉴定松属"油松组$## 个近缘种!并
对其亲缘关系进行探讨& 研究结果表明’通过种子和幼苗的形态比较鉴定!可准确鉴定油松和加勒比松#(&&k和
&&k标记则可把油松组的 ## 个树种中的 #$ 个准确鉴定出来!仅有高山松由于遗传背景的复杂性没有发现种特异
性引物"位点$& 利用 9 对 &&k引物获得的 !# 个种间多态性位点构建的 #$ 个树种的近缘种亲缘关系与传统的研
究结果基本一致& 系统聚类分析在相似系数 $18$ 处将 #$ 个树种分为 7 个类群’马尾松和赤松聚为第 # 个类群#云
南松%思茅松%高山松%油松聚成一小类!和另一小类即黑松%樟子松聚成第 % 个类群#第 7 类群为火炬松和加勒比
松!它与前 % 个类群亲缘关系较远!相似系数仅为 $1!%&
关键词’6松属#形态标记#(&&k#&&k#鉴定#系统进化
中图分类号! &"#:1!;%&"#:1!8666文献标识码!,666文章编号!#$$# A"!::"%$####$ A$$9# A$:
收稿日期’%$#$ A#% A#9#修回日期’%$## A$# A%8&
!"*:%*/S(*’$%0%:#$%,’#’(L*’*$%:Q*&#$%,’/;%"=//*//+*’$,06/0")"!*:$B6/0")$
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=2/$-#:$’6fIFWKDFN4CNNV/X&N345@-20&ICNUDV4CDYP4NU 4?C/PE?/P4’?DFI! IFU ICND@K/C4IF4VKN3DNVX/CIX/CNV4I4D/F DF
’?DFI5&NNUVIFU VNNU0DFEV/X4?NVN30/VN0WCN0I4NU VKN3DNVICNVD@D0ICDF @/CK?/0/ED3I03?ICI34NCV5(4DVUDXD3P044/DUNF4DXW
4?N@I33/CUDFE4/4?NDC@/CK?/0/EW5&NNUVIFU VNNU0DFEVXC/@## KDFNVKN3DNVMNCNDUNF4DXDNU YWDF4NECI4DFE4?NDCUDXNCNF4
@/CK?/0/ED3I03?ICI34NCV/XVNNUV"# $$$‘VNNUVMNDE?4! VNNUVV?IKNIFU 3/0/C$ IFU VNNU0DFEV"FP@YNC/X3/4W0NU/F! 3/0/C/X
?WK/3/4W0VIFU VNNU0DFE?NDE?4$! MD4? 4?NDC(&&kIFU &&k@ICZNCV5,44?NVI@N4D@N! ENFN4D3CN0I4D/FV?DK YN4MNNF 4?/VN
30/VN0WCN0I4NU VKN3DNVMIVIVVNVVNU YIVNU /F DFX/C@I4D/F XC/@&&k@ICZNCV5+?NCNVP04VV?/MNU 4?I4@!’1:0*1%;#$G-&IFU
@!.1$-:1%1 MNCNNIVD0WUDV4DFEPDV?NU XC/@## KDFNVKN3DNVI33/CUDFE4/@/CK?/0/ED3I0UDXNCNF3NV/XVNNUVIFU VNNU0DFEV! IFU
#$ /X## VKN3DNVMNCNDUNF4DXDNU I33PCI4N0WYIVNU /F (&&kIFU &&k@ICZNCV5T/MN[NC! F/VKN3DNV‘VKN3DXD3KCD@NC"0/3D$ MIV
X/PFU 4/CN3/EFD^N@!A%2&1’1 YN3IPVN/XD4V3/@K0D3I4NU ENFN4D3YI3ZEC/PFU5hNFN4D3CN0I4D/FV?DK YN4MNNF #$ KDFNVKN3DNV
YIVNU /F !# K/0W@/CK?D30/3DI@K0DXDNU YW9 KIDCV&&kKCD@NCVMIVVD@D0ICMD4? CN0I4D/FV?DK /X4CIUD4D/FI04I_/F/@D3EC/PKV5
qShf,UNFUC/ECI@UN@/FV4CI4NU 4?I47 4I_/F/@D3I0EC/PKVMNCN30PV4NCNU I44?NVD@D0ICD4W3/NXD3DNF4/X$181+?NXDCV4
EC/PK 3/FVDV4NU /X@!G1&-121 IFU @!A%2&-;*#$15+?NVN3/FU EC/PK ?IU 8 VKN3DNVM?D3? XPC4?NCMNCNUD[DUNU DF4/4M/
VPY‘EC/PKV! MD4? /FNVPY‘EC/PK DF30PUDFE@!(02212%2&-&! @!O%&-(1! @!A%2&1’1 IFU @!’1:0*1%;#$G-&# 4?N/4?NCVPY‘EC/PK
DF30PUDFE@!’/02:%$+-IFU @!&(*5%&’$-&5+?N0IV4EC/PK 3/F4IDFNU @!’1%A1 IFU @!.1$-:1%1! IFU 4?NW?IU CN0I4D[N0WUDV4IF4
CN0I4D/FV?DK XC/@/4?NC4M/EC/PKV! MD4? 4?NVD@D0ICD4W3/NXD3DNF4/X$1!%5
>*9 ?,-(/’6@-20&# @/CK?/0/ED3I03?ICI34NC# (&&k# &&k# DUNF4DXD3I4D/F# ENFN4D3CN0I4D/FV?DK
66松属"@-20&$树种分布于北半球!我国有 %% 种!
其中大部分为重要的造林树种!如马尾松 "@!
G1&-121$% 黑 松 "@!’/02:%$+-$% 云 南 松 "@!
(02212%2&-&$等& 国内外研究均表明松属树种表型
上存在广泛的变异!因此传统种的划分主要根据形
态特征进行分类& 但形态特征在一些近缘种甚至属
间种的区分上并不十分可靠 "f/CENFV4NCF %’1*5!
#;8!# fIF0NW! #;"#$!主要表现在’ 一些种天然分
布上存在重叠区域!而生殖上不存在隔离!同时种内
的遗传变异较大"Q/M0NC%’1*5! #;::$!如黄山松"@!
/K12+&/12%2&-&$和马尾松"邢有华等! #;;%$# 而有
些种间杂种分布于 % 个亲本的中间区域!如高山松
林 业 科 学 !" 卷6
"@!A%2&1’1 $是云南松与油松"@!’1:0*1%;#$G-&$的
杂交种!位于亲本都不能生长的青藏东南缘 % "$$ c
! %$$ @的高海拔地带"kDNVNYNCE! #;;"$!其形态和
解剖性状介于 % 个亲本之间"QP %’1*5! #;;;$# 还有
些松树种内群体形态性状的变异较大!在不同的立
地条件下!形态上产生显著的变异!如云南松在高山
贫瘠的地区!主干不明显!形成*地盘松+!而在云南
南部温湿度较高的地区形成*细叶云南松+ "虞泓!
#;;8$# 还有的种间性状差异仅在一定的生长发育
阶段才表现出来"H/F/E?PN%’1*5! #;;%$& 这些都限
制了表型性状在种质鉴定上的可靠性 "h/CU/F!
#;"8# Q/M0NC%’1*5! #;::$&
分子标记为遗传背景一致的种质鉴别提供了成
熟可靠的技术& 研究结果表明!基因的进化可以反
映物种的进化!并且不同的基因由于变异频率不同!
从而在不同分类等级上具有一定的保守性"’?IVN%’
1*5! #;;7# J/?FV/F %’1*5! #;;9# 汪小全等! #;;"$&
同时由于生殖隔离%地理隔离或生态位上的差异!不
同种在进化过程中固定了不同的基因!其中一些被
固定的基因在种的水平上具有高度的保守性!这些
差异可以通过 H*,指纹技术被发现"QPC@IF %’1*5!
#;;"$& 利用分子标记对种质进行鉴别!要求获得
的标记位点在进化上具有一定的保守性!同时具有
一定的变异速率!即在种间具有多态性而在种内具
有高度的保守性& 在过去的二十多年间!H*,标记
为植物分类和种质鉴定提供了有效而又准确的依据
"QPC@IF %’1*5! #;;"# &PF %’1*5! %$$9# k/VV‘HI[DV%’
1*5! %$$:# B/3%’1*5! %$$;$&
在各 类 分 子 标 记 中! 微 卫 星 标 记 " VD@K0N
VNlPNF3NCNKNI4! &&k$具有共显性遗传%重复性与稳
定性好%多态性高等优点!缺点是需设计特异性引
物!引物开发成本高# 而 (&&k"DF4NC‘VD@K0NVNlPNF3N
CNKNI4$技术是在 &&k基础上开发的!大部分 (&&k
标记为显性标记!既具 &&k标记的优点!又克服了
其 缺 点& 二 者 的 稳 定 性 优 于 k,SH" CIFU/@
I@K0DXDNU K/0W@/CK?D3H*,$!在处理大批量的样品
时 比 ,Q-SV " I@K0DXDNU XCIE@NF4 0NFE4?
K/0W@/CK?DV@V$更经济!因此 &&k和 (&&k标记目前
广泛应用于近缘种及杂种的种质鉴定及种质的遗传
多样性评价"TI/%’1*5! %$$%# GI0IVICI[IFIF %’1*5!
%$$9# 吴学尉等! %$$;# 张红莲等! %$#$$&
松属造林树种在生产中主要采用播种育苗或直
播造林& 一些亲缘关系较近的种!如油松组树种!种
间种内的表型多样性使得种质鉴定困难!其种子和
幼苗在表型上更是难以区分!这给林业生产带来很
大的困扰& 近年来随着林权制度改革和林业经济的
发展!对松属种苗的需求增加!种苗的调拨频繁!真
假混杂的种子和苗木对林业生产的影响深远& 因此
亟待开发一套实用%快速%准确的松属种子和幼苗的
鉴别方法& 本研究利用种子和幼苗的形态特征结合
分子标记方法"(&&k和 &&k$对松属"油松组$近缘
种进行早期鉴定!为林业生产中树种的正确使用提
供科学依据&
#6材料与方法
@F@A材料
#1#1#6植物材料6## 个松属"油松组$树种的种子
来源见表 #& 种子在 %9 d光照培养箱中萌发至子
叶脱壳!每个种批收集 7$ 株新鲜幼苗!于 A%$ d冰
箱中保存待用&
表 @A松属树种种子来源!
)#2B@A!**(/,<-:*/,0"%’*$-**/
树种 &KN3DNV 种子来源 &NNU V/PC3NV
火炬松 @!’1%A1 美国 ,@NCD3I"%$
湿地松 @!%*-#’- 美国 ,@NCD3I"#$ # 广东 hPIFEU/FE"#$
加勒比松 @!.1$-:1%1 古巴 ’PYI"#$
马尾松 @!G1&-121 广西 hPIFE_D"7$ # 浙江 n?N\DIFE"%$ # 贵州 hPD^?/P"%$ # 福建 QP\DIF"%$
黑松 @!’/02:%$+- 山东日照 kD^?I/!&?IFU/FE"#$ # 山东枣庄 nI/^?PIFE!&?IFU/FE"#$
赤松 @!A%2&-;*#$1 山东枣庄 nI/^?PIFE! &?IFU/FE"#$
油松 @!’1:0*1%;#$G-& 陕西隆化 -/FE?PI! &?IIF_D"%$
高山松 @!A%2&1’1 云南腾冲 +NFE3?/FE! OPFFIF"#$ # 四川 &D3?PIF"#$
云南松 @!(02212%2&-& 云南弥渡 fDUP! OPFFIF"%$
思茅松 @!O%&-(1 [IC5*12+:-12%2&-& 云南大理 HI0D! OPFFIF"%$
樟子松 @!&(*5%&’$-&[IC5G#2+#*-.1 黑龙江 TND0/FE\DIFE"#$
66!种子来源括号内数字指的是种子样品数& *P@YNCDF YCI3ZN4DF 3/0P@F /XVNNU V/PC3NV@NIFVFP@YNC/XVNNU VI@K0NV5
#1#1%6引物来源6&&k引物分别来自松属树种的
%8% 对核 &&k和 #! 对叶绿体 &&k"3K &&k$!包括黑
松".NFUCI@DF %’1*5! #;;8 $%火炬松 ")0VDZ %’1*5!
%$$$# n?/P %’1*5! %$$% $%北美乔松 "@!&’$#:0&$
%9
6第 #$ 期 洑香香等’ 松属近缘种形态和分子鉴定及其亲缘关系探讨
")3?4%’1*5! #;;8$%海岸松"@!=-21&’%$$和地中海松
"@!/1*%=%2&-&$ "h/F p^0N^ %’1*5! %$$%$%小干松"@!
.#2’#$’1 [IC5*1’-;#*-1$ "TD3ZV%’1*5! #;;:$等& (&&k
引物序列是加拿大哥伦比亚大学"qG’$设计并公
布的 #$$ 条单引物 " ?4K’aaMMM5YD/4N3?5PY353Ia
VNC[D3NVaFIKVaKCD@NCVaSCD@NCV5KUX$&
@FCA试验方法
#1%1#6形态性状观察与测定6根据 hG%""% A
#;;;-林木种子检验规程.测定种子的千粒质量!记
录种子的形状%颜色%幼苗下胚轴颜色!萌发结束时
随机测定 7$ 株幼苗子叶数和苗高&
#1%1%6分子检测6用 %>’+,G和微量提取法
"HN0IK/C4I%’1*!#;:7$提取幼苗基因组总 H*,!每
个种批随机取样 7$ 株分别提取个体 H*,!并分别
制备种源和种的混合基因池& #>琼脂糖凝胶电泳
检测并稀释备用&
利用分群法 " YP0ZNU VNECNEI4NIFI0WVDV!G&,$
"fD3?N0@/CN%’1*5! #;;8$筛选 &&k和 (&&k引物&
&&k扩增体系 "#$ $-$为’ %$ c9$ FE的 H*,
模板!U*+S各 $1% @@/0)-A#!%19 @@/0)-A# fE% j!
正反引物各 $19 $@/0)-A#!$1%9 qJ1S酶"+IBIkI!
+Il+f$ 和 # e GPXNC" #$ @@/0)-A# +CDV‘’0#
9$ @@/0)-A# B’0$&扩增采用 4/P3?U/MF S’k程序’
;! d 9 @DF# ;9 d 7$ V%9: d 7$ V"$19 d$a3W30N
至9$ d$%"$ d 7$ V!#8 3W30NV# 当退火温度降至 9$
d时!再运行 %! 循环# "$ d 9 @DF& 扩增产物用
8>变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离!银染检测&
(&&k扩增体系"%9 $-$为’ %$ FEH*,!U*+S
$1%9 @@/0)-A# ! J1S酶 $19 q! # eGPXNC! %1$
@@/0)-A# fE% j! $1: $@/0)-A# 引物& 扩增程序
为’ ;! d " @DF# ;! d 7$ V!98 d !9 V!"% d %
@DF!!$ 个循环# "% d " @DF& #>琼脂糖凝胶电泳
检测&
@FEA数据分析
统计清晰%再现性强的电泳条带!并按 #a$ 形式
进行数据转换& 采用 *+&O& %1#"k/?0X! %$$$$软件
计算 &f相似指数并进行聚类 qShf," PFMNDE?4NU
KIDCEC/PK @N4?/U ICD4?@N4D3I[NCIENV$ 分析&
%6结果与分析
CF@A种子形态和幼苗表型性状的特异性
## 个树种种子及幼苗的形态特征描述见表 %&
油松组树种的种子从形态上很难区分& 从表 % 可
知!只有加勒比松"@!.1$-:1%1$和油松种子的形状
和颜色较易分辨!可以作为鉴定的依据# 而其他树
种基本形状为椭圆形!颜色有黄%灰%黑色!或者一个
种批内混杂着几种颜色!或同种不同种源间颜色差
异也十分显著!因此难以作为鉴定依据&
种子千粒质量是衡量种子大小的重要指标!尽
管不同种源和不同年份的种批千粒质量差异较大!
但其变异不足以影响种间差异& 从表 % 可知!油松%
火炬松%湿地松和加勒比松的千粒质量均在 %$ E以
上!其他树种则在 %$ E以下& 由此可根据千粒质量
"%$ E为界$把 ## 个松属树种分为 % 大类’ 大粒类
种子包括油松%火炬松%湿地松和加勒比松# 小粒类
种子有马尾松%黑松%云南松%高山松%思茅松 "@!
O%&-(1 [IC5*12+:-12%2&-&$%赤松"@!A%2&-;*#$1$和樟
子松"@!&(*5%&’$-&[IC5G#2+#*-.1$&
从幼苗的特性看!各种间差异主要体现在胚轴
的颜色%子叶数及苗高&
松属树种种子萌发初期幼苗下胚轴颜色存在差
异& 观察发现下胚轴颜色为绿色的树种有加勒比
松%马尾松%黑松和赤松# 其余的均表现为红色!并
在整个萌发期间颜色不变&
与被子植物不同的是裸子植物的子叶数在种
内并不是一定的!种内个体间变异很大& 观察表
明!油松的子叶数目变异范围和平均值最大!分别
达到" c#%和 ;1$!可明显区别于其他种# 其次是
火炬松和湿地松!其均值都达到 :1$ 以上& 而且!
各树种不同子叶数个体所占的比例也有明显差异
"图 #,$ &
幼苗高度在种间也差异明显!在种内不同种源
间则受到种子千粒质量的影响& 从表 % 中可以看
出!尽管种内个体间的变异很大!但种群的平均水平
在种间存在明显差异& 火炬松%湿地松和加勒比松
"均值分别为 8179!"1:;!81$: 3@$!明显高于油松
"均值为 91$" 3@$# 而分布于高海拔地区的云南松
和高山松的苗高平均值分别为 71;" 3@和 71:" 3@!
明显区别于其他树种"表 %$& 各树种的苗高分布情
况差异也较大"图 #G$!如火炬松和湿地松苗高达 8
3@以上的个体达 "$>以上!其群体明显高于其他
种# 其他树种有 :$>左右的植株苗高在 !1$ c81$
3@之间&
综合种子和幼苗形态!可将 ## 种松属树种中的
油松%加勒比松鉴定出来& 油松种子大%椭圆形a棕
黄色%子叶数平均高达 ; 个!但其苗高在大粒类种子
中最小# 加勒比松种子大%三角形%暗灰色!大粒类
种子中只有其幼苗的下胚轴呈绿色&
79
林 业 科 学 !" 卷6
表 CA各树种种子及幼苗特性!
)#2BCA3;#-#:$*-/,0/**(/#’(/**(&%’4/,07#-%,树种 &KN3DNV
种子 &NNU 子叶数"个$*P@YNC/X3/4W0NU/F
千粒质量
#$$$‘VNNU MNDE?4aE
形状a颜色
&?IKNa’/0/C
变异范围
kIFEN
均值
fNIF
下胚轴颜色
’/0/C/X?WK/3/4W0
苗高
TNDE?4/XVNNU0DFEa3@
变异范围
kIFEN
均值
fNIF
火炬松@!’1%A1 %% c7% 宽卵圆a暗灰RDUN/[I4NaUICZ ECNW " c; :1$ 红色 kNU 91! c"19 8179
湿地松@!%*-#’- %# c!7 宽卵圆a黄%灰RDUN/[I4NaWN0/M! ECNW " c#$ :17 红色kNU 919 c;1: "1:;
加勒比松@!.1$-:1%1 %% c7" 卵圆a暗灰2[I4NaUICZ ECNW 9 c; 817 绿色hCNNF !1: c817 81$:
马尾松@!G1&-121 : c#! 椭圆a黄)0DKVNaWN0/M 9 c: "1# 绿色hCNNF 718 c91! !17:
黑松@!’/02:%$+- #8 c%$ 椭圆a灰黄)0DKVNaECNWWN0/M 8 c; "19 绿色hCNNF !1% c81% 91#$
赤松@!A%2&-;*#$1 ## c%# 椭圆a灰)0DKVNaECNW " c#$ "19 绿色hCNNF !17 c"1% 91#"
油松@!’1:0*1%;#$G-& 7% c9$ 卵圆a棕黄)0DKVNaYC/MF WN0/M " c#% ;1$ 红色kNU !1% c819 91$"
高山松@!A%2&1’1 ## c%8 椭圆a灰)0DKVNaECNW 8 c; "1$ 红色kNU 71! c!1: 71;"
云南松@!(02212%2&-& ## c#: 椭圆a灰)0DKVNaECNW 9 c: 819 红色kNU 71% c91# 71:"
思茅松 @!O%&-(1 [IC5
*12+:-12%2&-& #7 c%#
椭圆a灰
)0DKVNaECNW 8 c; 81; 红色kNU !17 c"19 9199
樟子松 @!&(*5%&’$-&[IC5
G#2+#*-.1 9 c#$
椭圆a暗灰
)0DKVNaUICZ ECNW 9 c; 81% 红色kNU 71! c91$ !1%8
66!种子千粒质量引自-中国木本植物种子. "国家林业局国有林场和林木种苗工作总站!%$$#$和-+?NR//UWS0IF4&NNU fIFPI0. "G/FFNC%’
1*5! %$$:$ & HI4I/X# $$$‘VNNU MNDE?43D4NU XC/@ - &NNUV/XR//UWS0IF4VDF ’?DFI. "hNFNCI0,U@DFDV4CI4D/F /X&4I4NQ/CNV4QIC@V! +CNN&NNUVIFU
&NNU0DFEV/X&4I4NQ/CNV4CW,U@DFDV4CI4D/F! %$$#$ IFU-+?NR//UWS0IF4&NNU fIFPI0. "G/FFNC%’1*5! %$$:$5
图 #6各树种不同子叶数和苗高植株的数量分布
QDE5#6SNC3NF4IEN/XVNNU0DFEVMD4? UDXNCNF4FP@YNC/X3/4W0NU/F IFU ?NDE?4
T2’ 火炬松 @!’1%A1# &T’ 湿地松 @!%*-#’-# J’ 加勒比松 @!.1$-:1%1# f’ 马尾松 @!G1&-121# T’ 黑松 @!’/02:%$+-# ’’ 赤松 @!
A%2&-;*#$1# O’ 油松@!’1:0*1%;#$G-&# h’ 高山松@!A%2&1’1# O*’ 云南松@!(02212%2&-&# &’ 思茅松@!O%&-(1 [IC5*12+:-12%2&-&# nT’ 樟子松@!
&(*5%&’$-&[IC5G#2+#*-.15下同& +?NVI@NYN0/M5
!9
6第 #$ 期 洑香香等’ 松属近缘种形态和分子鉴定及其亲缘关系探讨
CFCA分子检测
%1%1#6引物筛选6利用分群法"G&,$筛选获得种
内保守%种间有变异的 9 对 &&k和 9 条 (&&k引物
"表 7$&
表 EA用于分析的 !!Q引物和 S!!Q引物!
)#2BEA);*&%/$,0!!Q"-%+*-/#’(S!!Q"-%+*-/&&k (&&k
引物
SCD@NC
引物序列
&NlPNF3N
来源
kNXNCNF3N
引物
SCD@NC
引物序列
&NlPNF3N
S+!9$$%
Q$ ,,h++hh,++++,’’’,hh+h
k$ h,,’,,h,hh,++++++’+’,+,’,
黑松 @!’/02:%$+-3K&&k
".NFUCI@DF %’1*!#;;8$
qG’:%7 "+’$ :’
S4+L7$#7
Q$ h’++’+’’,++,,’+,,++’+,$
k$ +’,,,,++h++’h+,,,,’’+’ 火炬松
@!’1%A1")0VDZ %’1*!%$$$$ qG’:79 ",h$ :O’
S4+L!$;%
Q$ hh+,h,+,’+++’’,+h,h++,hh
k$ +’+,h+’’,h,+’++hh+’’,’ 火炬松
@!’1%A1 "n?/P %’1*!%$$%$ qG’:!$ "h,$ :O+
S4+L!$;:
Q$ h+hhh,’’’’,,h’,’+
k$ ,++h’’+’’+’+++,h+’,+’+’,
qG’:!# "h,$ :O’
kS$
Q$ h+hhh,’’’’,,h’,’+
k$ ,++h’’+’’+’+++,h+’,+’+’, 北美乔松
@!&’$#:0&")3?4%’1*!#;;8$ qG’:99 ",’$ :O+
66!(&&k引物序列中*O+代表*’+或*++ # k代表 ,或 h& *O+ DF VNlPNF3NV/X(&&kKCD@NCNKCNVNF4V*’+ /C*++ ! IFU *k+ CNKCNVNF4V*,+ /C
*h+5
%1%1%6利用 &&k和(&&k联合鉴定松属树种6根据
种质鉴定的要求!只对在种内保守而在种间有变异
的特异性引物进行扩增鉴定"图 %!图 7$& 利用 9 对
&&k引物和 9 条 (&&k引物对混合基因池和个体基
因组的扩增检测!其中有 ; 个树种获得了特异性扩
增产物!火炬松需 % 个引物的 % 个特异性条带可联
合鉴定出来!仅有高山松没有获得特异性产物 "表
!$&
图 %6&&k引物 S4+L!$;: 鉴定部分松属树种
QDE5%6@-20&VKN3DNVDUNF4DXDNU PVDFE&&kKCD@NCS4+L!$;:
每 8 个泳道为同一树种的 8 个个体& )[NCW8 0IFNVMNCN8 VNNU0DFEVXC/@VI@NVKN3DNV5
图 76(&&k引物 qG’‘:99 对部分松属树种的鉴定
QDE576@-20&VKN3DNVDUNF4DXDNU PVDFE(&&kKCD@NCqG’‘:99
每个泳道为 # 个种源的混合基因池& )I3? 0IFNCNXNCV@D_NU ENFNK//0XC/@/FNKC/[NFIF3N/XVI@NVKN3DNV5
CFEA基于 !!Q标记的松属"油松组#亲缘关系分析
通过 9 对 &&k引物对所有材料的扩增产物分析!
共获得 !: 个等位基因!其中种内保守%种间多态性位
点有 !# 个!多态性比例为 :91!>& 利用 *+&O& %1$
计算 #$ 个松属树种间的相似系数!用qShf,法对其
进行系统聚类"图 !$分析!在相似系数 $18$ 处将 #$
个树种分为 7 个类群& 从图 ! 中可知!马尾松和赤松
聚为第 # 个类群# 亲缘关系较近的云南松%思茅松%
99
林 业 科 学 !" 卷6
高山松%油松聚成一小类!和另一小类即黑松%樟子松
聚成第 % 个类群!它与第 # 类群关系较近又相对独
立# 第 7 类群为火炬松和加勒比松!它与前 % 个类群
亲缘关系较远!其相似系数仅为 $1!%&
表 GA用于鉴别的种特异性引物和片段!
)#2BGA!"*:%*/P/"*:%0%:"-%+*-/#’(0-#4+*’$/树种 &KN3DNV 标记类型 fICZNC4WKN 鉴定引物 SCD@NC 片段大小 QCIE@NF4VD^NaYK
火炬松 @!’1%A1 &&k S4+L!$;: jS4+L7$#7! #;% j#79!
湿地松 @!%*-#’- (&&k qG’:!$! qG’:!# 7:$! # $:$
加勒比松 @!.1$-:1%1 &&k S4+L7$#7 #79
马尾松 @!G1&-121 &&k S4+L7$#7! kS$ ##$! #7$ a#9$
黑松 @!’/02:%$+- (&&k qG’:%7 # #$$
赤松 @!A%2&-;*#$1 (&&k qG’:99 !#$
油松 @!’1:0*1%;#$G-& (&&k qG’:!# # !9$
云南松 @!(02212%2&-& &&k S4+L!$;:! S4+L!$;% %!9! ;9
思茅松 @!O%&-(1 [IC5*12+:-12%2&-& (&&k qG’:79! qG’:!$ # !9$! 89$
樟子松 @!&(*5%&’$-&[IC5G#2+#*-.1 &&k S+!9$$%! S4+L!$;% #!$! #9$
66!!!% 个引物联合鉴定& ! CNXNCV4?I4VKN3DNVMIV\/DF4DUNF4DXDNU PVDFE4M/KCD@NCV5
图 !6基于 &&k标记构建的 #$ 个松属树种亲缘关系
QDE5!6qShf,UNFUC/ECI@V?/MDFE4?NK?W0/ENFN4D3
CN0I4D/FV?DK I@/FE#$ KDFN4CNNVYIVNU /F &&k@ICZNCV
76讨论
EF@A松属"油松组#树种鉴定
松属"油松组$大部分树种为我国的主要造林
树种!具有很高的生态和经济价值!如马尾松%油松%
湿地松等& 但由于松属树种进化历史相同且伴随广
泛的基因交流!近缘种的短期隔离不足以产生基因
库的显著分化"GP33D%’1*5! #;;:$!因而许多种间的
系统学关系模糊不清& 松属许多种的种子%幼苗和
成年树的形态特征高度相似# 细胞水平上!松属"油
松组$树种具有相同的染色体数目 %2 i%! 和极其
相似的核型"吴若菁等! #;;!$!因而无论从形态还
是细胞水平上进行种质鉴定都存在一定的困难&
形态鉴定之难在于种间的差异较小!或者由于
种间分布区重叠!种间发生着不同程度的基因渐渗
杂交"虞泓等! %$$$# -D%’1*5! %$#$$!从而使得种间
的分类界限模糊!分类鉴定困难# 同时有些树种分
布范围广!种内常因种源%立地条件%不同年份气象
因子而产生更大的差异 "虞泓等! %$$$# kN?XN0U4!
#;;#$!这也使得一些种或变异类型的分类学地位
长时间处于混乱状态!如高山松和巴山松 "@!
/%2$(-$"杨雪等! %$$"$& 本研究发现!## 个松属树
种的种子和幼苗形态存在一些差异!结合种子形状%
颜色%千粒质量和幼苗子叶数%下胚轴颜色%苗高!仅
可把油松%加勒比松鉴定出来!其余的树种由于没有
特异的形态特征!难以鉴定&
鉴于形态鉴定的困难!利用分子技术从基因组
水平上进行鉴定被广泛接受!如 k,SH可区分马尾
松和黄山松!,Q-S鉴定油松%云南松%黄山松和黑
松"李淑娴等! %$$7$& 但这些研究所涉及的树种
少!同时没有真正找到种特有性引物或种特异性位
点来进行快速有效的鉴定&
利用 &&k标记鉴定近缘种及杂种具准确%快
速%简单的优点!现已被广泛接受 "张红莲等!
%$#$$!但其引物大部分来源于近缘种& &&k引物的
通用性取决于近缘分类群之间微卫星侧翼序列的保
守性和进化过程中微卫星的稳定性& 遗传距离近的
物种 &&k引物的通用性更高!近 ;$>的亚属间转移
都获得成功!但其通用率的高低仍是较大的困惑&
h/F p^0N^‘fIC4oFN^等"%$$!$研究发现油松组的通用
率为 78> c9;>!稍高于亚组 @-2%1%和 @21&’%$
7%> c!9># T/UEN4V等"%$$#$利用白云杉"@-.%1
+*10.1$的 9 对引物验证在属内的通用率较高!但在
松属中无扩增产物& 本研究结果表明!尽管来自于
松属树种的 &&k引物在油松组的通用率不高!但仍
有 9 对引物符合种内保守种间存在变异的要求%同
时在 #$ 个树种中获得扩增产物"其中湿地松由于
在种内变异大!研究时放弃了该树种$!并产生 ; 个
种特异性位点!可有效鉴定出马尾松%火炬松%加勒
比松%云南松%樟子松# 结合 9 个 (&&k引物扩增出
的 " 个种特异性位点!可鉴定出湿地松%黑松%赤松%
89
6第 #$ 期 洑香香等’ 松属近缘种形态和分子鉴定及其亲缘关系探讨
思茅松%油松& 综合 % 种标记方法!可把 ## 个松属
树种中的 #$ 个鉴定出来!仅有高山松没有获得种特
异性位点!这可能与高山松复杂的遗传背景有关&
&/FE等 " %$$%# %$$7 $ 通过对父系遗传的叶绿体
H*,和母系遗传的线粒体 H*,的对比分析!发现
高山松有些居群的起源是以油松为母本云南松为父
本的组合!有的则正好相反# 或是由于高山松与同
一分布区内云南松和思茅松发生了基因渐渗杂交所
致"虞泓等! %$$$$!其种子的形状%颜色%千粒质量
和苗高与云南松相似!而幼苗的子叶数则介于油松
和云南松之间& 因此从分子水平上难以鉴定&
EFCA松属"油松组#树种亲缘关系探讨
随着分子生物学的发展!H*,序列变异越来越
多地应用于研究物种的进化关系!因为它直接反映
了遗传物质的变异& 利用 3KH*,和 @4H*,进行系
统发育的研究结果和传统的形态分类基本一致
")3ZNC4%’1*5! %$$8# hNIUI-{KN^%’1*5! %$$%# 卢孟
柱等! #;;;$&
本研究首次利用松属树种开发的 &&k引物!对
松属"油松组$树种进行了系统发育的研究& 利用 9
对 &&k引物获得的 !# 个多态性位点构建的 #$ 个树
种的系统进化关系与传统的分类地位比较一致& 其
中云南松%思茅松%高山松和油松表现出亲缘关系很
近!聚为一小类& 来自形态学%解剖学%等位酶%
3KH*,的证据都表明高山松是云南松和油松的天然
杂种 "管中天! #;:## RIFE%’1*5! #;;$I# #;;$Y#
#;;!$# 大量研究表明云南松%油松%高山松和思茅松
的遗传距离很小"虞泓等! %$$$# 卢孟柱等! #;;;#
)3ZNC4%’1*5! %$$8$!说明其遗传分化并不明显!其原
因在于它们在地理位置上的相互交错!且存在着广泛
的基因渗入& 从 #$ 个松属种的系统发育关系来看!
马尾松和赤松占据中间类型!它们可能是几个近缘种
中分化较早的原始类型!但进化缓慢# 而进化较快的
油松类群则是近# $$$万年内物种扩散%生态隔离的
结果")3ZNC4%’1*5! %$$8$# 火炬松和加勒比松成为独
立的类群!与二者起源于北美东南部密切相关!也与
)3ZNC4等"%$$8$的研究结果一致& 但本文的研究结
果显示赤松和马尾松亲缘关系较近!而与樟子松的关
系较远!这与)3ZNC4等"%$$8$的结果存在差异& 研究
认为樟子松为欧洲赤松分布至远东的地理变种!因此
赤松与樟子松的关系应更近& 这可能是由于本研究
的种子只来源于山东!而其主要分布区则在东北地
区!因而结果存在一定的偏差# 同时分子标记类型也
可能产生一定的影响&
用于研究生物系统进化的 H*,序列大都为相
对比较保守的 3KH*,!@4H*,和 FCH*,序列!而
&&k较少用于种的亲缘关系探讨!一是它在种内就
存在很高的变异!二是在种间的通用率较低& 本研
究通过大量筛选!仅获得 9 对 &&k引物!但分析结
果与文献报道结果基本一致!表明种内保守种间有
变异的 &&k引物可应用于系统进化分析& 但需要
注意的是每个种要尽可能涵盖所有的地理种源!进
行全面的居群遗传学研究!在了解种间基因交流及
物种的生态隔离机制之后!才能正确阐明松属 "油
松组$树种的系统进化规律和亲缘关系&
参 考 文 献
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管中天5#;:#1四川松杉类植物分布的基本特征5植物分类学报!
#;"!$ ’ 7;7 A!$"5
国家林业局国有林场和林木种苗工作总站5%$$#1中国木本植物种
子5北京’ 中国林业出版社!#"#5
李淑娴! 尹佟明! 邹惠渝! 等5%$$71利用分子标记技术对林木近缘
种进行遗传鉴别的研究5林业科学! 7;"7$ ’ #%; A#795
卢孟柱! & @^DU4,)5#;;;1松属线粒体基因序列变异研究5林业科
学! 79"!$ ’ #! A%$5
汪小全! 洪德元5#;;"1植物分子系统学近五年的研究进展概况5
植物分类学报!79"9$ ’ !89 A!:$5
吴若菁! 卢芳作5#;;!1松属 9# 个种间的核型进化初探5福建林学
院学报! #!"#$ ’ "7 A"85
吴学尉! 崔光芬! 吴丽芳! 等5%$$;1百合杂交后代(&&k鉴定5园艺
学报! 78"9$ ’ "!; A"9!5
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CN0NIVNKIKNCa%$$"$! A#995
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初步研究5安徽林业科技! "!$ ’ 9 A;5
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张红莲! 李火根! 胥6猛! 等5%$#$1鹅掌楸属种及杂种的 &&k分子
鉴定5林业科学! !8"#$ ’ 78 A7;5
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’?IVNfR! &/04DVH)! 20@V4NIU kh! %’1*5#;;71S?W0/ENFN4D3V/X
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"9
林 业 科 学 !" 卷6
9:$5
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,KK0DNU hNFN4D3V! #$!":$ ’ #%;$ A#%;"5
h/F p^0N^‘fIC4oFN^ & ’! k/Y0NU/‘,CFPF3U JJ! ’/0IUI’! %’1*5%$$!1
’C/VV‘I@K0DXD3I4D/F IFU VNlPNF3N[ICDI4D/F /X@D3C/VI4N0D4N0/3DDF
)PCIVDIF ?ICU KDFNV5+?N/CN4D3I0IFU ,KK0DNU hNFN4D3V! #$; "# $ ’
#$7 A###5
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IFU @D3C/VI4N0D4N@ICZNCVDF 0/UENK/0NKDFN"@-20&.#2’#$’1 [IC5
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f/CENFV4NCF )B! QICCICJ-5#;8!1(F4C/ECNVVD[N?WYCDUD^I4D/F DF CNU
VKCP3NIFU Y0I3Z VKCP3N5 +N3?FD3I0kNK/C4*/5 !1 +/C/F4/!
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=#2A%$#&1 IFU D4VIKK0D3I4D/F DF ENFN CNV/PC3NV@IFIEN@NF45
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kDNVNYNCE-T5#;;"1TWYCDU /CDEDFV/XK0IF4VKN3DNV5,FFPI0kN[DNM/X
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&N4IPZN45
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@/0N3P0IC@N4?/UV4/DUNF4DXWYP4NCFP4" X0+*12&.-2%$%1 $ IFU
YP4NCFP4?WYCDUV’ CN0N[IF3N 4/ YP4NCFP4 3/FVNC[I4D/F5 +CNN
S?WVD/0/EW! %:""$ ’ ##%" A##775
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A%2&1’1! IUDK0/DU ?WYCDU5f/0N3P0IC)3/0/EW! ##"8$’ #$9" A#$875
&/FEGT! RIFEL]! RIFELk! %’1*5%$$71’W4/K0IV@D33/@K/VD4D/F
DF @-20&A%2&1’1 IFU K/KP0I4D/F NV4IY0DV?@NF4/X4?NUDK0/DU ?WYCDU
KDFN5f/0N3P0IC)3/0/EW! #% "##$ ’ %;;9 A7$$#5
&PF JR! JDF Hf! n?/P ’J! %’1*5%$$91(UNF4DXD3I4D/F /XS/CK?WCI
0DFNV"k?/U/K?W4I$ YW,Q-S‘H*, XDFENCKCDF4DFEIFU @/0N3P0IC
@ICZNCV5S0IF4f/0N3P0ICGD/0/EWkNK/C4NC! %7"7$ ’ %9# A%8%5
.NFUCI@DF hh! -N0D-! k/VVDS! %’1*5#;;81,VN4/XKCD@NCVX/C4?N
I@K0DXD3I4D/F /X%$ 3?0/C/K0IV4@D3C/VI4N0D4NVDF SDFI3NIN5f/0N3P0IC
)3/0/EW! 9"!$ ’ 9;9 A9;:5
RIFELk! & @^DU4,)! -NMIFU/MVZD,! %’1*5#;;$I1)[/0P4D/FICWIFI0WVDV
/X@-20&A%2&1’1 fIV4NCV! IKP4I4D[N4NC4DICW?WYCDU5#1,0/^W@N
[ICDI4D/F5+?N/CN4D3I0IFU ,KK0DNU hNFN4D3V! :$"9$’ 879 A8!$5
RIFELk! & @^DU4,)5#;;$Y1)[/0P4D/FICWIFI0WVDV/X@-20&A%2&1’1
"fIV4NCV$ ! IKP4I4D[N4NC4DICW?WYCDU5%1,V4PUWPVDFEVKN3DNV
VKN3DXD3 3?0/C/K0IV4 H*, @ICZNCV5 +?N/CN4D3I0 IFU ,KK0DNU
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!责任编辑6徐6红"
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