全 文 ：第 !" 卷 第 ## 期
$ % # % 年 ## 月
林 业 科 学
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苹果属观赏海棠 H"L’K的克隆及不同叶色
品种间的表达差异!
文樵夫4沈红香4姚允聪4田4佶4宋婷婷
"北京农学院植物科技学院4北京 #%$$%"$
摘4要!4以苹果属观赏海棠品种,王族-叶片总 A*,为模板!通过 A+^k’A与 A,’)扩增!获得 # 个# $!: ZS的二
氢黄酮醇 >! >还原酶基因的 RK*,序列!其基因编码区共# %$# ZS!存在 5 个 oA@!编码 5!7 个氨基酸!命名为
H"L’K& 基因序列全长$ 56" ZS!有 8 个内含子!所有内含子的剪切位点均符合真核生物*O+^,O+规则& 使用实时
荧光定量 k’A和紫外可见光分光光度计!对 ! 种不同叶色类型的观赏海棠品种,火焰- "绿色类叶片$%,绚丽- "新
叶有色类红色叶片$%,高原之火-"新叶有色类红色叶片$和,王族- "常色类紫色叶片$幼叶和功能叶中的 H"L’K
表达及其花色苷和类黄酮的含量进行测定分析!结果表明’ H"L’K在 ! 个品种的幼叶和功能叶中均有表达!
H"L’K表达量与花色苷积累有一定的相关性!H"L’K在幼叶中表达量高于功能叶# 在 ! 个品种中!H"L’K在,高
原之火-幼叶中表达量最大& 幼叶中的类黄酮含量高于功能叶!H"L’K表达量也大于功能叶& 在功能叶中!除绿
色叶品种,火焰-外!类黄酮含量越高!H"L’K的表达量越大!说明 H"L’K对苹果属观赏海棠叶片花色苷%类黄酮
代谢途径及色泽形成具有重要作用&
关键词’4苹果属观赏海棠# 叶片# 二氢黄酮醇 >! >还原酶基因# 花色苷# 实时荧光定量 k’A
中图分类号! &:#71!"" ?6!51$444文献标识码!,444文章编号!#%%# >:!77#$%#%$## >%%#" >%6
收稿日期’ $%%6 >%7 >5## 修回日期’ $%%6 >#% >%5&
基金项目’ 北京市人才强教)))拔尖创新人才计划项目"k[]$%%:t%#!$%:t%!!8"%$ !北京市农业科技项目"$%%:%#%#$ !北京市科技新星
人才培养项目"$%%"C$8$ &
!姚允聪为通讯作者&
*%")()6 &)"0!"#$%-,&8&##%.
LMI ?DG/XE4&=MI F/IJ_DGIJ4BG/BEIR/IJ4+DGI \D4&/IJ+DIJTDIJ
"?%/0+!"4)0")/01 F)"#0$%$6,@$%)6)! A)4B406 7048)(*4+,$&36(4"5%+5()4A)4B406 #%$$%"$
78/’,&-’’4 KD=NUV/X0G2/I/0^! V^MUERTGWM " K@A$ DWT=MXDVWTdMNMI‘N;MDI T=M0GTMVSV/RMUEVM/XGIT=/RNGIDIW
ZD/WNIT=MWDW3LDT= T=MT/TG0A*,UVD2MU XV/;0MG2MW/XH/%5*RVGZGSS0M,A/NG0TN- GWT=MTM;S0GTM! T=MXE0RK*,/XL’K
JMIM"# $!: ZS$ YGWR0/IMU ZNVM2MVWMTVGIWRVDSTD/I S/0N;MVGWMR=GDI VMGRTD/I "A+^k’A$ GIU VGSDU G^;S0DXDRGTD/I /X
RK*,MIUW"A,’)$3+=MJMIMDWIG;MU GWH"L’K! R/ITGDIDIJT=VMM/SMI VMGUDIJXVG;MW"oA@! # %$# ZS$! GIU
MIR/UDIJGSV/TMDI /X5!7 G;DI/GRDUW3K*,WMQEMIRM=GW$ 56" ZS! R/ITGDIDIJXD2MDITV/IW! GIU G0T=MR0MG2MWDTMW/ZMN
YDT= T=MO+^,O VE0M3+=MM_SVMWWD/I /XH"L’K GIU T=MR/ITMIT/XGIT=/RNGIDI GIU X0G2/I/DUWYMVMUMTMV;DIMU
VMWSMRTD2M0NZNVMG0^TD;MQEGITDTGTD2Mk’AGIU WSMRTV/S=/T/;MTMVDI T=M;GTEVMGIU N/EIJ0MG2MW/XHI,@0G;M- "JVMMI
N/EIJGIU ;GTEVM0MGX$! HI,AGUDGIT- " VMU N/EIJ0MGXGIU JVMMI ;GTEVM0MGX$! HI,kVGDVDXDVM- "VMU N/EIJ0MGXGIU
JVMMI ;GTEVM0MGX$GIU HI,A/NG0TN-" SEVS0MN/EIJGIU ;GTEVM0MGX$3+=MVMWE0TWW=/YMU T=GTH"L’KYGWM_SVMWWMU DI
Z/T= ;GTEVMGIU N/EIJ0MG2MW/XT=MGZ/2MX/EVRE0TD2GVW3+=MTVMIUW/XGIT=/RNGIDI R/ITMITYMVMR/IWDWTMITYDT= T=GT/XT=M
VM0GTD2MM_SVMWWD/I /XH"L’KJMIM3+=MM_SVMWWD/I 0M2M0W/XH"L’KDI T=MN/EIJ0MG2MWYMVM=DJ=MVT=GI T=GTDI T=M
;GTEVM0MG2MW3,;/IJT=MX/EVRE0TD2GVW! T=MHI,kVGDVDXDVM- DI T=MN/EIJ0MG2MWW=/YMU T=M=DJ=MWTM_SVMWWD/I 0M2M0W/X
H"L’K3@0G2/I/DU R/ITMITDI N/EIJ0MG2MWYGW=DJ=MVT=GI T=GTDI T=M;GTEVM0MG2MW! GIU T=MM_SVMWWD/I /XH"L’KYGW
G0W/=DJ=MVT=GI DI T=M;GTEVM0MG2MW3(I T=M;GTEVM0MG2MW! M_RMSTX/VT=MJVMMI 0MGX2GVDMTNHI,@0G;M-! T=M=DJ=MV
R/ITMITT=MX0G2/I/DU T=M=DJ=MVM_SVMWWD/I 0M2M0H"L’K3+=MWMVMWE0TW=G2MUMTMV;DIMU T=GTH"L’KS0GNWGI D;S/VTGIT
V/0MDI GIT=/RNGIDI GIU X0G2/I/DU ;MTGZ/0DRSGT=YGNWGIU T=MR/0/VX/V;GTD/I DI T=M0MG2MW3
9.: ;",4第 ## 期 文樵夫等’ 苹果属观赏海棠 H"L’K的克隆及不同叶色品种间的表达差异
44大量研究表明!植物的色泽发育和植物类黄酮代
谢紧密有关& 花色苷是广泛存在于被子植物中的一
类重要的类黄酮化合物& 它是植物花朵%叶片和果实
中几乎所有色泽形成的物质基础"\/WMS= )+/%3!#667#
OD0DGI! $%%#$& 植物中基本的花色苷有 5 种!即花葵
素%花青素%花翠素!以及这些花色素的甲基化衍生物
等"徐纪尊等!$%%"$& 二氢黄酮醇 >! >还原酶
"K@A$是花色素苷合成途径中后期表达的第 # 个关
键酶!它以二氢黄酮醇类"KFl!KF?!KF]$为底物!
在辅因子 *,KkF的作用下将 ! 位的羰基还原为羟
基!产生上述 5 种无色原花色素 "F/0T/I )+/%3!#668$&
K@A是 # 个短链还原酶!属于二氢黄酮醇 >! >还原
酶超家族"]GVTMIW)+/%3!$%%$$& o-AMD0N等"#678$
采用转座子标签技术第 # 次从玉米"])/ =/,*$分离
克隆出 L’K基因!随后从金鱼草"30+4((#405==/B5*$
"o-AMD0N)+/%3!#678$和矮牵牛 "?)+504/ #,;(41/$
"CM0U )+/%3!#676$中克隆到了 L’K基因& 随着深入
研究!人们发现 L’K对于花色的改变具有重要的作
用& ,DUG等 "$%%%$将反义 L’K基因导入蝴蝶草
"F$()04/ "$0"$%$($!发现转化株的花色素苷合成减少!
黄酮和黄酮醇"此二者为助色素$含量显著提高!获
得了开蓝色花的蝴蝶草!表明调控花色素苷的助色素
含量是花色改变的途径之一# 还分别将正义的 L’K
和 @9! 转入蓝猪耳"F$()04/ &$5(04)($中!转基因株系
的花冠花色素苷含量均呈不同程度的减少&
苹果属"H/%5*$观赏海棠是苹果属植物中最具
观赏价值的类型!树形优美!花色丰富多彩!其叶色
有绿色叶类%新叶有色类和常色紫叶类!是园林景观
中不可缺少的彩叶树种资源& 然而!在这一多色型
植物资源中!叶片色泽形成的遗传机制%L’K基因
结构和功能及其品种间差异至今还未见报道& 本文
在克隆获得苹果属观赏海棠叶片查尔酮合成酶
"H"@9!$%查尔酮异构酶"H"@9>$和黄烷酮 5 >羟
化酶 "H"’S9$ 基 因 "OMICGId 登 陆 号 分 别 为’
@\866:"5!@\7#:!78 和 @\7#:!7"$!并对不同叶色品
种基因表达差异分析的基础上!拟从常色紫叶品种
中克隆 L’K基因! 并对基因及其编码蛋白序列进
行分析!采用实时荧光定量 k’A技术检测不同叶色
品种中 L’K表达量!并与花色苷含量进行对比分
析!为观赏海棠不同品种间叶色差异的分子机制研
究提供理论基础与试验证据&
#4材料与方法
=C=>试验材料
选取苹果属观赏海棠中具有典型叶色的 ! 个品
种叶片为试材!即’ 绿色叶类品种 ,火焰 - "H3
,@0G;M-$%新叶有色类"幼叶红色%功能叶为绿色$
品种,绚丽- "HI,AGUDGIT-$ 和 ,高原之火- "HI
,kVGDVDXDVM- $% 常 色 紫 叶 类 品 种 , 王 族 - " HI
,A/NG0TN-$& $%%7 年春季!在北京农学院海棠种质
资源圃采集 ! 个品种相同自然条件下 ! 年生树体萌
芽后 : 天的幼叶和萌芽后 8% 天的功能叶!液氮速冻
后 >7% j保存备用&
=CB>总 IN7的提取及 -EN7第 = 链的合成
用改良热硼酸法"陆旺金等!$%%5$提取,王族-
幼叶总 A*,& 以提取 的 总 A*,为模 板! 利用
’0/ITMR= &],A++]-DZVGVN试剂盒 "购自 ’0/ITMR= 生
物有限公司$合成 5- A^,’)和 8- A^,’)RK*,第 #
链& 采 用 ’+,C 法 提 取 , 王 族 - 叶 片 总 K*,
"LD0DG;W/I )+/%3!#66!$&
=CD>观赏海棠 !0123序列的克隆
以上述提取得到的,王族-叶片 RK*,为模板!
根据 OMICGId 上登录的近缘植物二氢黄酮醇 >! >
还原酶基因保守区段序列!设计 5-端引物 L’Kk#’
’,’,+’’+’,O’,OO,,’+O!扩增 H"L’K基因的
5- 端序列# 设计 8 - 端引物 L’Kk$’ O’++O,+
O,+O’’,+,,+O+O! L’Kk5’ ’,+++’++,,O,+’
OO’O,,,O+’!扩增 H"L’K基因的 8 - 端序列&
pk]通用引物由 A,’)试剂盒提供!根据试剂盒说
明!转录产物的 5-末端和 8-末端分别用 L’Kk# 和
L’Kk$ 及 pk]引物扩增!其 k’A反应条件为 6! j
预变性 8 ;DI# 6! j变性 # ;DI!"! j和 "7 j退火
5% W!:$ j延伸 $ ;DI!5% 个循环# :$ j延伸 8 ;DI&
将第 # 轮 k’A产物稀释# %%%倍!取 # --作为模板!
以 L’Kk5 和 pk]为引物!进行巢式 k’A反应!k’A
反应条件与第 # 轮相同& 经回收%纯化!与 S]K#6 +^
.MRT/V"购自宝生物工程有限公司$连接!转化 KF8/
感受态细胞!蓝白斑筛选后测序 "上海生工生物工
程技术服务有限公司$& 用 K*,],*81$1$ 软件拼
接以上序列得到观赏海棠叶片二氢黄酮醇 >! >还
原酶基因全长 RK*,序列&
=CO>观赏海棠 !0123基因 -EN7和 EN7全长序
列的获得
以上述提取得到的 ,王族-叶片 RK*,和 K*,
为模板!设计全长引物 L’K@’ ,+OOO,+’’O,O+’
’O,,+’ 和 L’KA’ ,’’+,’+++O,’,+’,,’O,
OO!扩增二氢黄酮醇 >! >还原酶基因的全长序列&
k’A反应条件’ 6! j预变性 8 ;DI# 6! j变性 #
;DI!8: j退火 5% W!:$ j延伸 5 ;DI!5% 个循环# :$
j延伸 8 ;DI& k’A产物经回收%纯化!与 S]K#6 +^
:#
林 业 科 学 !" 卷4
.MRT/V"购自宝生物工程公司$连接!转化 KF8/感
受态细胞!蓝白斑筛选后测序 "上海生工生物工程
技术服务有限公司$&
图 #4H"L’K基因的克隆及结构分析
@DJ3#4’0/IDIJGIU K*,WMQEMIRMWTVERTEVM/XH"L’K
]1# dZ K*,0GUUMV3
,1H"L’K基因的 A,’)末端扩增结果# C1H"L’K基因的 RK*,和对应基因组 K*,扩增# ’1H"L’K基因 K*,序列的结构&
,3A,’)MIUWG;S0DXDRGTD/I /XH"L’K# C1+=MXE0^0MIJT= G;S0DXDRGTD/I /XRK*,GIU JMI/;DRK*,# ’1+=MK*,WMQEMIRMWTVERTEVM/XH"L’KI
=CP>实时荧光定量 !*I分析
分别提取,绚丽-%,火焰-%,高原之火-% ,王
族- ! 个品种的幼叶和功能叶 A*,"陆旺金等!
$%%5$!使用 ]^]E-.@DVWTRK*,&NIT=MWDWlDT"购自
kV/;MJG公司$合成第 # 链 RK*,备用& 按照 AMG0
]GWTMV]D_"&BCAOVMMI$k’A试剂盒"购自天根生
化科技有限公司 $操作指南!采用实时荧光定量
k’A"VMG0^TD;MQEGITDTGTD2Mk’A!A+^Qk’A$的方法!
检测基因的相对表达量& 扩增目标基因 H"L’K的
引物设计为 L’K^@’ OO++OO,+O+,’++’O+’+’和
L’K^A’ +O,+O,OO’++OO+OO’,+!预测产物长度
是 #!8 ZS!适用于荧光定量 k’A# 以苹果属的杂交
种 "H/%5*m1$=)*+4"/ $ #7& (4;$*$=/%KO3基 因
"OMICGId 序列号’ K?5!#57$$作为内参基因!其引
物 #7&A^@’ ,’,’OOOO,OO+,O+O,’,,和 #7&A^
A’ ’’+’’,,+OO,+’’+’O++,!预测产物长度是
7% ZS!适用于荧光定量 k’A&
对反转录所得的 RK*,按体积分别进行 8 倍梯
度稀释"#!#i#%!# i#%%!#i# %%%!#i#% %%%$!实施荧
光定量反应!然后绘制相对标准曲线& 反应程序为’
6! j预变性 $ ;DI# 6! j变性 $% W!8: j 退火 5% W!
:$ j延伸 5% W!!% 次循环!每次循环第 5 步进行荧
光采集# 最后 68 j变性 # ;DI!退火至 88 j"每隔
#% W上升 %1#8 j$后保温 # ;DI!接着检测其荧光
值!绘制熔点曲线& 内参基因反应程序同 H"L’K的
反应程序基本相同!退火温度为 88 j& 标准品
RK*,和待测样品均设置 5 次重复&
=CR>花色苷和类黄酮含量测定
花色苷和类黄酮相对含量的提取根据何亦昆等
"#668$的方法略有改动& 称取 #1% J叶片剪碎"$ 9
5 ;;$!置于 8% ;-离心管中!加入 #% ;-#a的盐
酸甲醇!常温下浸泡 $% =& 取上清液!以提取液作空
白!采用 p*(’op.^$#%% 型紫外可见分光光度计在
85% I;处和 5$8 I;处测定吸光度& 以每克鲜质量
叶片的提取液的光密度变化值 oK85% u%1# 作为 #
个花色苷单位& 类黄酮含量以每克鲜质量叶片的提
取液的光密度变化值 oK5$8 u# 作为 # 个类黄酮
单位&
$4结果与分析
B?=>!0123的克隆与序列比较
依据得到的保守片断设计 8 - 和 5 - 末端的
A,’)引物& 用引物对 pk]iL’Kk$%L’Kk5 进行
H"L’K的 8-末端的扩增反应!在琼脂糖凝胶电泳
中显现出 :%% ZS 左右 $ 条目的条带"图 #,!左$!将
:%% ZS 左右的条带回收%测序!获得到 # 条 L’K的
8-RK*,末端& 用引物 pk]iL’Kk# 进行 H"L’K
的 5-末端扩增!获得 # 条约 78% ZS 的带 "图 #C!
右$!克隆入 +>载体!挑选 " 个长度有代表性的单
克隆测序!获得 # 条 L’K的 5-RK*,末端& 以上述
片断进行 C0GWT分析!确认其与其他植物 L’K基因
同源& 根据 5-A,’)和 8-A,’)测序结果拼读出
苹果属观赏海棠 L’K基因!全长序列为# $!: ZS!命
名该基因为 H"L’K"登陆号’ @\7#:!7:$& 基因组
扩增得到约$ !%% ZS的条带!拼接后得到全长序列
$ 56" ZS"图 #’$& 分析发现!H"L’K存在 8 个内含
子!将起始密码子 ,+O定义为 q# 位!则 8 个内含
7#
4第 ## 期 文樵夫等’ 苹果属观赏海棠 H"L’K的克隆及不同叶色品种间的表达差异
子分别位于 q##6 9q$57 ZS! q!%6 9q# #": ZS!
q# 5"5 9q# "$% ZS! q# :78 9q# 77: ZS! q$ %7# 9
q$ $%% ZS&结果与大多数物种一致!且内含子 >外
图 $4苹果属观赏海棠 H"L’K全长 RK*,的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
@DJ3$4+=MXE0^0MIJT= RK*,WMQEMIRMGIU T=MUMUERMU G;DI/GRDU WMQEMIRM/XH"L’K
起始密码子和终止密码子用下划线表示!阴影处是功能结构域!黑框表示保守域&
+=MWTGVTR/U/I GIU T=MWT/S R/U/I GVMEIUMV0DIMU!T=MXEIRTD/IG0U/;GDIWGVMW=GUMU!GIU T=MR/IWMV2MU U/;GDIWGVMZ/_MU3
显子边界均符合*O+^,O+规则& 第 # 个内含子有多
个直接重复序列!如 q#$!! q#$7 ZS 处分别存在 #
个 7 ZS 的直接重复序列 "+’’’+’’’$! q#!%!
q#!$ ZS处分别存在 # 个 6 ZS 的直接重复序列
"+++++++++$等# 只存在 # 个 7 ZS 的镜像重复序
列!为 q#::! q$$$ ZS 处的 +,,O+,++# 不存在反
向重复序列& 第 $ 个内含子则散布着多个重复序
列!如 q""7! q"65 ZS 处分别存在 # 个 #% ZS 的直
接重复序列 ",OO,,O,+++$! q!::! q68# ZS 处
分别存在 # 个 6 ZS 镜像重复序列",++,+,,,+$!
q76!! q# %$6 ZS 处 的 #! ZS 反 向 重 复 序 列
",,++,,,,,,++O+$等& 第 5 个内含子也同样散
布着多个重复序列!如 q# !#8! q# !#: ZS处分别存
在 # 个 ## ZS 的直接重复序列 ",+,+,+,+,+,$!
q# 57!! q# !7% ZS处分别存在 # 个 6 ZS 镜像重复
序列",++,,,,,,$! q# 57"! q# 8!6 ZS处的7 ZS
反向重复序列 "+,,,,,,,$等& 第 ! 个内含子存
在 $ 个镜像重复序列!为 q# 7#%! q# 7!! ZS处的
,,+,,++,++ 和 q# 75#! q# 7:8 ZS 处 的
++O++,,++!还存在 $ 个反向重复序列!为 q# 7%#!
q# 7$8 ZS处的 ,,+,,,,+和 q# 75$! q# 78: ZS
处的 +O++,,++,& 第 8 个内含子只存在 # 个反向
重 复 序 列! 为 q$ ##:! q$ #$7 ZS 处 的
,,++O,++,&
对该基因的序列进行分析表明!其含有 # 个编
码 5!7 个氨基酸的完整阅读框架!包括起始密码子
和终 止 密 码 子& 利 用 K*,],*81$1$ 软 件! 对
H"L’K编码的氨基酸序列分析!认为该基因具有起
始密码子",+O$和终止密码子"+,,$!是苹果属观
赏海棠 L’K基因的 oA@序列"图 $$&
根据 (ITMVkV/&RGI 和 &],A+在线软件对编码
氨基酸分子质量%编码蛋白的结构域和功能位点进
行分析表明!H"L’K;GDI oA@编码 5!7 个氨基酸
"S(8165$的分子质量约为 !#16:5 dE!其编码的蛋白
具有典型的 K@A蛋白功能结构域’ 短链的脱氢酶
和还原酶" &KA$家族"从 )" 到 L#"# $!大多数已知
是 *,K^或者 *,Kk^依赖的还原酶& 其中大多数脱
6#
林 业 科 学 !" 卷4
氢酶具有至少 $ 个结构域!第 # 个结构域通常结合
*,K^的辅酶!第 $ 个结构域决定底物的特异性并且
决定氨基酸是否具有催化作用& 还包括 *;V,区
域!这是 # 个反式作用调控区域!参与转录因子
,VM,转录后的修饰& 该结构域还包括差向酶和霍
霍巴酰基辅酶 ,还原酶等&
用 &ok],对 蛋 白 的 二 级 结 构 预 测 表 明!
]RK@A蛋白与草莓 "’(/6/(4/ m/0/0/**/$ 和葡萄
" 4^+4*8404&)(/$"&ok],预测$之间的二级结构十分
相似& 它们主要由 />螺旋 " /^=M0D_$%随机卷曲
"VGIU/;R/D0$%0>转角"0^TEVI$和延伸链"M_TMIUMU
WTVGIU$组成& 在二级结构中!/>螺旋均匀分布在
整个蛋白中& ]RK@A蛋白由 !$17$a的 />螺旋%
#!1%7a的延伸链%:1!:a的 0>转角和 581"5a的
随机卷曲组成"图 5,$&
以 .2K@A" $R$6@$为模型!用 &YDWW^]/UM0对
]RK@A蛋白进行三级结构的同源建模!所得到结果
都与已知结构和功能的葡萄 K@A蛋白的三级结构
很类似"图 5C$!水桶状!上端表面有一个缺口!与底
物特异结合催化的部位正好位于水桶底部裂口所对
位置!而与 *,KkF结合的部位位于水桶外表面&
由于 .2K@A的结构和功能是已知的!故而推断
]RK@A与其有类似的功能&
BCB>苹果属观赏海棠 !0123的同源性及进化
分析
利用 K*,],*81$1$ 软件进行多重序列比对
"图 !$发现!H"L’K含有与其他同源基因相似的中
央编码区!显示了二氢黄酮醇 >! >还原酶进化的保
守性& 同时还发现不同物种的 L’K氨基酸序列在
很多区域有较高的相似性& 在不同的物种中
*.+O,,O@(O&L-(]A--)AOB+是高度保守区!是
L’K与 *,Kk结合位点 "\/=IW/I )+/%1! #666 $!
H"L’K具有该结合位点"从 .#%到 B5%$&
为了进一步了解 L’K的进化关系!选择部分植
物的 K@A蛋白利用 ])O,!1% 软件!对 ]RK@A与
已知植物 K@A结构域蛋白进行进化树分析!可以看
出 H"L’K编码的氨基酸序列与其他物种来源的
L’K具 有 较 高 相 似 性& 其 与 西 洋 梨 " ?,(5*
"$==504*$ " ,B$$::5# $ 和 月 季 " K$*/ #,;(41/ $
",C!6%%:$ $ 的 相 似 性 最 高! 分 别 为 6718:a!
7$17#a& 基于氨基酸序列的系统进化树可以看出
其氨基酸的进化与植物的进化基本一致!同科植物
在进化树上处于同一分支 "图 8$ &
BCD>!0123在不同叶色品种中的表达差异分析
由 D’NR0MVD?+]自动测出的苹果属内参基因
XV! (KO3的回归方程%k’A扩增效率和相关系数分
别为’ Ru>51!%6C q58178:!6"18a和 %166:! #
测出的苹果属 H"L’K的回归方程%k’A扩增效率
和相关系数分别为’ Ru >515$$ $ Cq$61"#!
#%%1%a和%166: "! &说明该试验具有良好的重复性
和较高扩增效率& 熔点曲线分析出的 XV! (KO3和
H"L’K均只有 # 个 F; 值!分别为 77 j和 78 j!
表明 XV! (KO3和 H"L’K所用引物具有高度特异
性!其 k’A扩增产物均为目的片段!不含引物二
聚体&
H"L’K在 ! 个苹果属观赏海棠品种叶片中的
表达模式如图 "& 以表达量最高的,高原之火-幼叶
的表达量为 *#+!按照相对定量公式 $ >’’@T作图&
由图 " 可以看出!H"L’K在 ! 个观赏海棠品种的幼
叶和功能叶中均有表达& 就叶龄而言!供试品种除
绿色叶品种,火焰-外!幼叶中的花色苷含量均高于
功能叶!并且幼叶中 H"L’K表达量也大于功能叶&
就不同叶色品种而言!新叶有色类品种,高原之火-
在幼叶中花色苷含量最高!H"L’K的表达量也最
大# 在功能叶中 H"L’K的表达量最高!花色苷含量
仅次于,王族-& 新叶有色类品种,绚丽-花色苷含
量与 H"L’K的表达量在各个时期都居中& 常色紫
叶品种,王族-在幼叶期花色苷含量与 H"L’K的表
达量无明显的对应关系# 而在功能叶中花色苷含量
最高!H"L’K的表达量仅次于,绚丽-& 绿色叶类品
种,火焰-幼叶和功能叶中的 H"L’K表达量最低!
花色苷积累量最低!在功能叶中几乎没有表达& 对
不同品种中类黄酮含量进行分析可以看出!幼叶中
的类黄酮含量高于功能叶!并且幼叶中 H"L’K表达
量也大于功能叶& 在幼叶中!类黄酮含量与 H"L’K
的表达量无明显相关性# 在功能叶中!除绿色叶品
种,火焰 -外!类黄酮含量越高!H"L’K的表达量
越大&
对花色苷和类黄酮含量的多重比较分析还表
明’ 花色苷含量在不同时期由于品种的不同表现出
显著差异& 类黄酮含量在功能叶时期随着品种的不
同表现出显著差异# 而在幼叶时期常色紫叶品种
,王族-与绿色叶品种,火焰-和新叶有色类品种存
在显著差异!绿色叶品种,火焰-与新叶有色类存在
显著差异!而新叶有色类的 $ 个品种间不存在显著
差异&
54结论与讨论
K@A是花色素苷合成途径中后期表达的第 #
个关键酶!对于植物器官色泽形成具有十分重要的
%$
4第 ## 期 文樵夫等’ 苹果属观赏海棠 H"L’K的克隆及不同叶色品种间的表达差异
444
图 54]RK@A蛋白结构
@DJ354+=MSV/TMDI WTVERTEVM/X]RK@A
A1随机卷曲 AGIU/;R/D0# ’1’端4’^TMV;DIG0# /1/>螺旋 /^=M0D_# )1延伸链 )_TMIUMU WTVGIU# *1*端 *^TMV;DIG0# 010>折叠 0^TEVI3
,1]RK@A与 .2K@A"B##:!6$和 @GK@A",@%$6"78$二级结构预测!/>螺旋%延伸链%0>折叠和随机卷曲分别用蓝色%红色%绿色和紫色
表示# C1预测的 ]RK@A蛋白三级结构和 .2K@A蛋白结构!/>螺旋%0>折叠%随机卷曲%延伸链分别用红色%蓝色%白色和黄色表示&
,1&MR/IUGVNWTVERTEVMW/X]RK@A! @GK@A",@%$6"78$ GIU .2K@A"B##:!6$ SVMUDRTMU ZN&ok],1+=MTY/^UD;MIWD/IG0;/UM0W/X]RK@A! @GK@A
",@%$6"78$ GIU .2K@A"B##:!6$1/^=M0D_DWDIUDRGTMU DI Z0EM! 0^TEVI DI JVMMI! VGIU/;R/D0DI SEVS0MGIU M_TMIUMU WTVGIU DI VMU# C3+=MT=VMM^UD;MIWD/IG0
;/UM0W/X.2K@A"$R$6@$GIU T=MUMUERMU ]RK@A3/^=M0D_DWDIUDRGTMU DI VMU! 0^TEVI DI Z0EM! VGIU/;R/D0DI Y=DTMGIU M_TMIUMU WTVGIU DI NM0/Y3
图 !4苹果属观赏海棠 H"L’K基因中央编码区推导的氨基酸序列的多重比对分析
@DJ3!4,0DJI;MIT/XT=MSVMUDRTMU G;DI/GRDU WMQEMIRMW/XH"L’K;GDI oA@DI H/%5*RVGZGSS0MWGIU /T=MVS0GITW
#1观赏海棠H/%5*RVGZGSS0M# $3西洋梨?,(5*"$==504*# 53月季K$*/ #,;(41/# !3大豆E%,"40)=/G# 83蒺藜苜蓿 H)14"/6$+(50"/+5%/# "3甜橙 @4+(5*
*40)0*4*# :3毛果杨 ?$25%5*+(4"#$"/(2/# 73菠菜 !240/"4/ $%)(/")/# 63金荞麦 ’/6$2,(5=",=$*5=##%3杜鹃 K#$1$1)01($0 *4=*4###3烟草 O4"$+4/0/
+/;/"5=##$3蓝灰石竹 L4/0+#5*6(/+4/0$2$%4+/05*# #53缕丝花E,2*$2#4%/ )%)6/0*# #!3斑点矢车菊@)0+/5()/ =/"5%$*/# #83桃?(505*2)(*4"/I
#$
林 业 科 学 !" 卷4
图 84苹果属观赏海棠 H"L’K与其他物种 L’K*的分子进化树聚类分析
@DJ384,S=N0/JMIMTDRTVMM/XH"L’KGIU /T=MVWSMRDMWL’K*
图 "4苹果属观赏海棠叶片中 H"L’K基因相对表达量与花色苷%类黄酮含量的关系
@DJ1"4+=MVM0GTD/IW=DS ZMTYMMI VM0GTD2MM_SVMWWD/I 0M2M0W/XH"L’KGIU T=MR/ITMIT/XGIT=/RNGIDI GIU X0G2/I/DU
DI T=M0MG2MW/XUDXMVMITH/%5*RVGZGSS0MRE0TD2GVW
,1不同品种幼叶中 H"L’K基因相对表达量与花色苷%类黄酮含量的关系# C1不同品种功能叶中 H"L’K基因相对表达量与花色苷%类黄
酮含量的关系& 差异显著水平分析数据采用 KEIRGI 新复极差法进行方差分析!不同小写字母表示在 %1%8 水平上差异显著&
,1+=MVM0GTD/IW=DS ZMTYMMI VM0GTD2MM_SVMWWD/I 0M2M0W/XH"L’KGIU T=MR/ITMIT/XGIT=/RNGIDI GIU X0G2/I/DU DI T=MN/EIJ0MG2MW/XUDXMVMITRE0TD2GVW#
C3+=MVM0GTD/IW=DS ZMTYMMI VM0GTD2MM_SVMWWD/I 0M2M0W/XH"L’KGIU T=MR/ITMIT/XGIT=/RNGIDI GIU X0G2/I/DU DI T=M;GTEVM0MG2MW/XUDXMVMITRE0TD2GVW3
+=MWDJIDXDRGIRMYGWZN2G0EM/XKEIRGI(WIMY;E0TDS0MVGIJM;MT=/U3-MTMVWDI 0/YMVRGWMDIUDRGTMWDJIDXDRGITUDXMVMIRM0M2M0"?e%1%8$3
意义"刘娟等!$%%8$& o-AMD0N等"#678$采用转座
子标签技术首次从玉米分离%克隆出 L’K基因!其
后研 究 人 员 相 继 从 金 鱼 草% 矮 牵 牛% 拟 南 芥
"3(/;41$2*4*+#/%4/0/$%大麦"9$(1)5=85%6/()$%非洲
菊 " E)(;)(/ B/=)*$04$% 香 石 竹 " L4/0+#5*
"/(,$2#,%5*$%野百合".4%45=;($Q04$等多种植物中
克隆到了 L’K基因"刘娟等!$%%8$& 对 L’K基因
结构分析表明!大多数植物 L’K都由 " 个外显子和
8 个内含子组成!如裂叶牵牛 ">2$=$)/ #)1)(/")/$%
圆叶牵牛 ">I25(25()/$%金鱼草%矮牵牛%拟南芥
"(IGJGdD)+/%I!#666# LDIdM0^&=DV0MN)+/%I!#66$$等的
K@A!并且它们内含子剪切位点相同& 但在玉米%大
麦和高粱" !$(6#5=;4"$%$($ " &R=YGVT‘^&/;;MV)+/%I!
#67:# lVDWTDGIWMI )+/%I!#66## ’=MI )+/%I!#667$中!
L’K基因结构则由 ! 个外显子和 5 个内含子组成!
玉米和大麦的内含子剪切位点相同!与金鱼草和矮
牵牛的 L’K基因的前 5 个内含子相对应& 本研究
从,王族-中克隆得到了 H"L’K的 RK*,和 K*,全
$$
4第 ## 期 文樵夫等’ 苹果属观赏海棠 H"L’K的克隆及不同叶色品种间的表达差异
长序列!含有 " 个外显子和 8 个内含子& H"L’K具
有植物 L’K典型的结构特点!其编码的蛋白具有典
型 K@A蛋白的功能结构域’ 短链的脱氢酶和还原
酶"&KA$家族"从 )" 到 L#"# $!大多数已知是 *,K^
或者 *,Kk^依赖的还原酶!大多数脱氢酶具有至少
$ 个结构域!第 # 个结构域通常结合 *,K^的辅酶!
第 $ 个结构域决定底物的特异性并且决定氨基酸是
否具有催化作用& 通过多重序列比对!发现 H"L’K
具有与 *,Kk的结合位点"从 .#%到 B5% $& \/=IW/I
等"$%%#$发现!结合区中的 #5! 位与 #!8 位的氨基
酸可直接影响酶的底物特异性!大多数物种在 #5!
位含有 K"天冬氨酸$或 *"天冬酞胺$!而 H"L’K
在此位点则是 ."缬氨酸$!因而其 K@A酶作用底物
仅限于 KF?& 仅与 KF?结合将会生成花青素 >
5 >葡萄糖苷!表现为红色!这与观赏海棠的叶片紫
红色相对应& 对 ]RK@A进行二级结构预测发现!
/>螺旋均匀分布在蛋白内部!与草莓和葡萄的二
级结构类似& 对 H"L’K基因编码蛋白的三级结构
进行建模后发现!]RK@A与已知结构和功能的葡萄
.2K@A"$R$6@$蛋白的高级结构非常相似!故而推
断 ]RK@A蛋白功能与 .2K@A功能类似& 与已知其
他植物 K@A蛋白相比! H"L’K编码的氨基酸序列
与其他物种来源的 L’K具有较高相似性& 其与西
洋梨和月季的相似性最高!分别为 6718:a 和
7$17#a& 所以推断 H"L’K具有典型的 L’K的生
物学功能& 这为进一步研究 H"L’K的遗传转化和
揭示观赏海棠器官色泽形成的分子机制提供了
基础&
结合实时定量 k’A和花色苷含量测定的数据
对不同时期不同叶色品种进行分析发现!H"L’K均
有表达!而且与叶色密切相关& 叶色越红的品种!其
花色苷含量越高!而 H"L’K表达量也相应比较高&
供试品种中除绿色叶品种,火焰-外!幼叶中的花色
苷含量均高于功能叶!并且幼叶中 H"L’K表达量也
大于功能叶& 随着新叶有色类品种在功能叶时期变
为绿色!常色紫叶品种,王族-叶片红色变浅!花色
苷含量与 H"L’K表达量在功能叶中也明显降低#
绿色叶品种,火焰-幼叶和功能叶中的 H"L’K表达
量最低!花色苷积累量也最低!在功能叶中几乎没有
表达# 这些结果都说明叶片的红着色与 H"L’K的
表达量存在一定的相关性& 而就不同叶色品种而
言!新叶有色类品种,高原之火-在幼叶中花色苷含
量最高!H"L’K的表达量也最大# 在功能叶中
H"L’K的表达量最高!而花色苷含量次于,王族-&
H"L’K的表达量又不是完全与花色苷的含量相对
应& 对 L’K基因表达的大量研究表明!不同物种的
L’K基因在不同发育期与不同部位的时空表达特
性也有所不同!调控方式十分复杂& 金鱼草和拟南
芥的 L’K基因的表达受多个转录调控因子的调控
"F/0T/I )+/%I!#668# *MWD)+/%I! $%%#$& 作者曾应用
同样的方法研究过观赏海棠 H"@9! 基因在叶片发
育过程中的变化及与花色苷积累的关系!发现
H"@9! 的表达量与花色苷的积累在叶片发育早期
密切相关!而功能叶期的这一变化特点不明显!由此
看来!在观赏海棠叶片类黄酮代谢过程中叶片
H"@9! 和 H"L’K各自的表达阶段不同!也可能存
在着某种程度的协同表达作用"宋婷婷等!$%#%$&
在各个品种中!对不同品种中类黄酮含量进行
分析可以看出!幼叶中的类黄酮含量高于功能叶!并
且幼叶中 H"L’K表达量也大于功能叶& 这个结果
与花色苷的含量与 H"L’K表达量关系相一致& 花
色苷的含量与类黄酮的含量却没有明显的相关性&
在幼叶中!类黄酮含量与 H"L’K的表达量无明显相
关性# 在功能叶中!除绿色叶品种,火焰-外!类黄酮
含量越高!H"L’K的表达量越大& 由此推测类黄酮
含量与 H"L’K的表达量有一定的相关性& 通过对
类黄酮含量进行多重比较统计分析!不同叶色品种
的类黄酮含量在不同时期的差异性不同!因此类黄
酮的含量受不同时期和不同品种的影响!与 H"L’K
的表达量不是表现为简单的对应关系& 作者用相同
的方法研究 H"3O! 发现其与类黄酮也无明显的相
关性& 类黄酮的生物合成途径很复杂!受到发育和
多种外界环境因素的调控!有待于进一步的研究&
作者期望找到苹果属观赏海棠不同叶色类型的
品种和不同发育时期的叶片中 H"L’K及花色苷生
物合成途径中的相关酶基因的表达与花色苷和类黄
酮积累的对应关系!用于解释花色苷积累对叶色形
成的作用!进而了解花色苷积累的调控机制& 在本
试验中!新叶有色类品种,高原之火-在各个时期中
的 H"L’K表达量都是最高的!而在功能叶中花色苷
含量却不是最高的& 这可能是由于花色苷的生物合
成受多种诱导因子影响!例如光诱导!各种花色苷的
相对含量受光敏素的调控"]/0)+/%I! #66" $# 低温
也可以诱导一些植物体内花色苷的合成!如拟南芥
"OVG=G;! #667$%玉米 "’=VDWTDM)+/%I! #66!$%高粱
幼苗"&=DR=DP/)+/%I! #665$等& 诱导因子除上述因
子外!其他一些内在的和外界环境因子也与植物花
色素苷的诱导%积累和抑制有关"]/0)+/%I! #66"$&
从二氢黄酮醇转变成花色素苷的反应非常复杂!需
要几个不同酶的作用& 其中一些已被证实& 由于这
5$
林 业 科 学 !" 卷4
个过程的复杂性和中间产物的不稳定!精确的反应
过程还没有完全搞清楚!有待于进一步研究& 葡萄
L’K基因启动子与 Op& 融合后!在葡萄幼苗中的表
达分析表明! 8^L’K基因在幼苗的根%茎和叶中都
有表达!受光%盐和糖的诱导!其启动子区具有多个
调控元件"O/0/S )+/%I! $%%$ $!所以花色苷含量与
H"L’K的表达量不仅仅表现出简单的对应关系&
今后的工作中!对于叶色相关的 L’K基因来讲!其
转基因研究不仅能了解其功能!而且有助于用各种
方法"启动子的克隆及功能验证%反义 A*,%共抑制
或 A*,D等$实现叶色的修饰!继续深入研究具有重
要意义&
参 考 文 献
何亦昆!代庆阳!苏学辉3#6683雁来红叶色转变与超微结构及色素
含量的关系3四川师范学院学报’ 自然科学版!#" " 5 $ ’ #68
>#6:3
刘4娟!冯群芳!张4杰3$%%83二氢黄酮醇 ! >还原酶基因"L’K$
与花色的修饰3植物生理学通讯!!#""$ ’ :#8 >:#"3
陆旺金!蒋跃明3$%%53荔枝果实两个膨大素基因的克隆与序列分
析3中国农业科学!5""#$$ ’ #8$8 >#8$63
宋婷婷!沈红香!姚允聪!等3$%#%3苹果属观赏海棠 H"@9! 基因的
克隆及实时定量表达研究3园艺学报!5:"$$ ’ $"6 >$:"3
徐纪尊!王丽辉!潘庆玉3$%%"3观赏植物花色基因转化的研究进展3
中国农业科技导报! 7"8$ ’ 8" >"%3
,DUGA! lDW=D;/T/&! +GIGdGB! )+/%3$%%%3]/UDXDRGTD/I /XX0/YMV
R/0/VDI T/VMIDG"F$()04/ &$5(04)(4-DIU3$ ZNJMIMTDRTVGIWX/V;GTD/I3
k0GIT&RD! #85"#!$ ’ 55 >!$3
CM0U ]! ]GVTDI ’! FEDTWF! )+/%3#6763@0G2/I/DU WNIT=MWDWDI ?)+504/
#,;(41/’ kGVTDG0R=GVGRTMVD‘GTD/I /XUD=NUV/X0G2/I/0! V^MUERTGWM
JMIMW3k0GIT]/TCD/0! #5"8$ ’ !6# >8%$3
’=MI ]! &GI]DJEM0k! CMIIMT‘MI \-3#6673&MQEMIRM/VJGID‘GTD/I GIU
R/IWMV2GTD/I DI W=$iG# =/;/0/J/EWVMJD/IW/XW/VJ=E; GIU VDRM3
OMIMTDRW! #!7"#$ ’ !58 >!!53
’=VDWTDMk\! ,0XMIDT/]A! LG0Z/T.3#66!3(;SGRT/X0/Y^TM;SMVGTEVM
WTVMWW/I JMIMVG0S=MIN0SV/SGI/DU GIU GIT=/RNGIDI SGT=YGNW’
MI=GIRM;MIT/XTVGIWRVDSTGZEIUGIRMGIU GIT=/RNGIDI SDJ;MITGTD/DI
;GD‘MWMMU0DIJW3k0GITG! #6!"$$ ’ 8!# >8!63
OD0DGI ,3$%%#3’/ITVDZETD/IW/XPMXVMN=GVZ/;MGIU R/^Y/VdMVWT/T=M
WTEUN/XGIT=/RNGIDIW3k=NT/R=M;DWTVN! 8""5$ ’ $$6 >$5"3
O/0/S A! )2MI &! ’/0/2G^+W/0/2G.! )+/%3$%%$3)_SVMWWD/I /XT=M
JVGSMUD=NUV/X0G2/I/0VMUERTGWMJMIMGIU GIG0NWDW/XDTWSV/;/TMV
VMJD/I3\)_S C/T! 85"5:5$ ’ #56: >#!%63
OVG=G;+-3#6673@0G2/I/DU GIU X0G2/I/0J0NR/WDUM;MTGZ/0DW; DI
3(/;41$2*4*3k0GITCD/R=M;! 5""$$ ’ #58 >#!!3
F/0T/I + ,! ’/VIDW= ) ’3 #6683 OMIMTDRWGIU ZD/R=M;DWTVN/X
GIT=/RNGIDI ZD/WNIT=MWDW3k0GIT’M0! :":$ ’ #%:# >#%753
(IGJGdDB! \/=‘EdG^FDWGT/;DB! ]/VD+! )+/%3 #6663 OMI/;DR
/VJGID‘GTD/I /XT=MJMIMWMIR/UDIJUD=NUV/X0G2/I/0! V^MUERTGWMX/V
X0/YMVSDJ;MITGTD/I DI T=M\GSGIMWMGIU R/;;/I ;/VIDIJJ0/VDMW3
OMIM! $$""$$ ’ #7# >#773
\/=IW/I )+! ANE &! BDF! )+/%3$%%#3,0TMVGTD/I DI GWDIJ0MG;DI/
GRDU R=GIJMWT=MWEZWTVGTMWSMRDXDRDTN/XUD=NUV/X0G2/I/0! V^MUERTGWM3
k0GIT\! $8"5$ ’ 5$8 >5553
\/=IW/I ) +! BDF! &=DI C! )+/%3 #6663 @,=;4145= #,;(41/
UD=NUV/X0G2/I/0! V^MUERTGWMU/MWI/TMXDRDMIT0NVMUERMUD=NUV/dGM
;SXMV/0T/SV/UERMSM0GVJ/IDUDI T^NSMGIT=/RNGIDIW3k0GIT\! #6"5$ ’
7# >783
\/WMS= ]! )VDR= O! A/IG0U l3#6673F/YJMIMWSGDITX0/YMVWGIU
WMMUW3+VMIUWk0GIT&RDMIRM! 5""$ ’ $#$ >$#73
lVDWTDGIWMI l*! A/=UML3#66#3&TVERTEVM/XT=M9$(1)5=85%6/()JMIM
MIR/UDIJUD=NUV/X0G2/I/0! V^MUERTGWMGIU ;/0MRE0GVGIG0NWDW/XGIT#7
;ETGITWZ0/RdMU DI X0G2/I/DU WNIT=MWDW3]/0OMIM! $5% " $ $ ’ !6
>863
]GVTMIW&! +MMVD+! @/Vd;GII O3$%%$3FMTMV/0/J/EWM_SVMWWD/I /X
UD=NUV/X0G2/I/0! V^MUERTGWMWXV/;2GVD/EWS0GITW3@)C& -MT! 85#
"5$ ’ !85 >!873
]/0\! \MIdDIWO \! &R=GXMV)! )+/%3#66"3 &DJIG0SMVRMSTD/I!
TVGIWUERTD/I! GIU JMIM M_SVMWWD/I DI2/02MU DI GIT=/RNGIDI
ZD/WNIT=MWDW3’VDTAM2k0GIT&RD! #8"8$ ’ 8$8 >88:3
*MWD*! \/IU ’! KMZMGEP/I (! )+/%3$%%#3+=M3(/;41$2*4*++$ JMIM
MIR/UMWGI A$A5 ]BC U/;GDI SV/TMDI T=GTGRTWGWG dMN
UMTMV;DIGITX/VSV/GIT=/RNGIDUDI GRRE;E0GTD/I DI UM2M0/SDIJWMMU3
k0GIT’M0! #5"5$ ’ $%66 >$##!3
o(AMD0N’! &=MS=MVU *&! kMVMDVG,3#6783]/0MRE0GVR0/IDIJ/XT=M
G0/REWDI ])/ =/,*EWDIJT=MTVGIWS/WGZ0MM0M;MITW)I GIU ]E03
)]Co\! !"5$ ’ 7:: >77$3
&R=YGVT‘^&/;;MVH! &=MS=MVU *! +GRdM)! )+/%3#67:3(IX0EMIRM/X
TVGIWS/WGZ0MM0M;MITW/I T=MWTVERTEVMGIU XEIRTD/I /XT=M3X JMIMW
/X])/ =/,*I)]Co\! ""$$ ’ $7: >$6!3
&=DR=DP/’! FG;GUG+! FDVG/dG]! )+/%3#6653)I=GIRM;MIT/XVMU^
0DJ=T^DIUERMU GIT=/RNGIDI WNIT=MWDWDI W/VJ=E; XDVWTDITMVI/UMWZN
;/UMVGTM0/YTM;SMVGTEVMJD2MI DI T=MDVVGUDGTD/I RE0TEVMSMVD/U3
k0GITG! #6#"$$ ’ $57 >$!83
LD0DG;W/I .]! F/\B! LE @@! )+/%3#66!3,k’AZGWMU ;GVdMV
TDJ=T0N0DIdMU T/T=MIM;GT/UMVMWDWTGIRMJMIM! H4! DI T/;GT/3
+=M/VMTDRG0GIU ,SS 0DMU OMIMTDRW! 7:":$ ’ :8: >:"53
LDIdM0^&=DV0MNC! FGI0MN&! O//U;GI F ]3#66$3)XMRTW/XD/IDIJ
VGUDTD/I /I GS0GIT’ JMI/;MGIG0NWDW/XTY/3(/;41$2*4*TVGIWSGVMIT
TMWTG;ETGTD/IW3k0GIT’M0! !"5$ ’ 555 >5!:3
!责任编辑4徐4红"
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