全 文 ：第 源怨 卷 第 圆 期
圆 园 员 猿 年 圆 月
林 业 科 学
杂悦陨耘晕栽陨粤 杂陨蕴灾粤耘 杂陨晕陨悦粤耘 灾燥造郾 源怨袁晕燥郾 圆云藻遭援 袁圆 园 员 猿
凿燥蚤院员园援员员苑园苑 辕 躁援员园园员鄄苑源愿愿援圆园员猿园圆员怨
收稿日期院 圆园员圆 原 园苑 原 园缘曰 修回日期院 圆园员圆 原 园愿 原 圆苑遥
基金项目院林业公益性行业科研专项渊圆园员员园源园园猿冤曰 愿远猿 计划课题渊圆园员员粤粤员园园圆园圆冤曰 湖南省科技厅重点项目渊圆园员园晕运圆园园愿袁圆园员员晕运圆园员怨冤曰
广东省林业创新专项渊圆园员员运允悦载园员怨冤遥
鄢谢耀坚为通讯作者遥
桉树 郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸和 耘杂栽鄄杂杂砸引物的快速筛选与通用性研究鄢
刘摇 果员摇 张党权圆 摇 谢耀坚员 摇 谷振军圆 摇 章怀云圆
渊员郾 国家林业局桉树研究开发中心摇 湛江 缘圆源园圆圆曰 圆郾 中南林业科技大学 林业生物技术湖南省重点实验室
摇 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室摇 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室摇 长沙 源员园园园源冤
关键词院 摇 杂杂砸标记曰 桉树曰 引物筛选曰 基因组 阅晕粤混合池
中图分类号院杂苑员愿郾 源远曰 匝怨源猿郾 圆摇 摇 摇 文献标识码院 粤摇 摇 摇 文章编号院 员园园员 原 苑源愿愿渊圆园员猿冤园圆 原 园员圆苑 原 园苑
砸葬责蚤凿 杂糟则藻藻灶蚤灶早 葬灶凿 栽则葬灶泽枣藻则葬遭蚤造蚤贼赠 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸 葬灶凿
耘杂栽鄄杂杂砸 孕则蚤皂藻则泽 蚤灶 耘怎糟葬造赠责贼
蕴蚤怎 郧怎燥员 摇 在澡葬灶早 阅葬灶早择怎葬灶圆 摇 载蚤藻 再葬燥躁蚤葬灶员 摇 郧怎 在澡藻灶躁怎灶圆 摇 在澡葬灶早 匀怎葬蚤赠怎灶圆
渊员郾 悦澡蚤灶葬 耘怎糟葬造赠责贼 砸藻泽藻葬则糟澡 悦藻灶贼则藻摇 在澡葬灶躁蚤葬灶早 缘圆源园圆圆曰 圆郾 匀怎灶葬灶 孕则燥增蚤灶糟蚤葬造 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠摇 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠
燥枣 晕燥灶鄄宰燥燥凿 云燥则藻泽贼 孕则燥凿怎糟贼泽 燥枣 杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶摇 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 晕燥灶鄄宰燥燥凿 云燥则藻泽贼 栽则藻藻泽 葬灶凿 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣
酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 耘凿怎糟葬贼蚤燥灶摇 悦藻灶贼则葬造 杂燥怎贼澡 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠摇 悦澡葬灶早泽澡葬 源员园园园源冤
粤遭泽贼则葬糟贼院摇 月葬泽藻凿 燥灶 贼澡藻 则藻造藻增葬灶贼 责则燥责藻则贼蚤藻泽 燥枣 耘杂栽鄄杂杂砸 早藻灶藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶袁 葬灶凿 贼澡藻 澡蚤早澡 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 葬灶凿 责燥贼藻灶贼蚤葬造
则藻早怎造葬贼燥则赠 枣怎灶糟贼蚤燥灶 燥枣 郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸袁 贼澡藻 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 藻枣枣藻糟贼 葬灶凿 贼则葬灶泽枣藻则葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 耘杂栽鄄杂杂砸 葬灶凿 早藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸 燥枣 藻怎糟葬造赠责贼
贼则藻藻泽 憎葬泽 糟燥皂责葬则葬贼蚤增藻造赠 泽贼怎凿蚤藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 葬则贼蚤糟造藻援 粤 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 责燥燥造蚤灶早 皂藻贼澡燥凿 憎葬泽 凿藻增藻造燥责藻凿 贼燥 则葬责蚤凿造赠 泽糟则藻藻灶 藻怎糟葬造赠责贼
杂杂砸 责则蚤皂藻则泽援 粤 贼燥贼葬造 燥枣 猿源园 责葬蚤则泽 燥枣 藻怎糟葬造赠责贼 杂杂砸 责则蚤皂藻则泽 憎藻则藻 泽糟则藻藻灶藻凿 枣则燥皂 猿怨缘 责葬蚤则泽 凿藻泽蚤早灶藻凿 遭赠 燥责贼蚤皂蚤扎蚤灶早 杂杂砸鄄孕悦砸
泽赠泽贼藻皂袁 葬灶凿 贼澡藻 泽糟则藻藻灶蚤灶早 则葬贼蚤燥 憎葬泽 愿远郾 园远豫 援 郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸 葬灶凿 耘杂栽鄄杂杂砸 泽糟则藻藻灶藻凿 圆园源 责葬蚤则泽 渊 则葬贼蚤燥 愿猿郾 圆远豫 冤 葬灶凿 员猿远
责葬蚤则泽 渊则葬贼蚤燥 怨园郾 远苑豫 冤袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 栽澡藻 则藻泽怎造贼 蚤灶凿蚤糟葬贼藻泽 贼澡葬贼 贼澡藻泽藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿 杂杂砸 责则蚤皂藻则泽 澡葬增藻 早燥燥凿 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 葬灶凿
贼则葬灶泽枣藻则葬遭蚤造蚤贼赠 蚤灶 藻怎糟葬造赠责贼 贼则藻藻泽袁 葬灶凿 葬则藻 泽怎蚤贼葬遭造藻 枣燥则 杂杂砸 皂葬则噪藻则 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 增葬则蚤燥怎泽 藻怎糟葬造赠责贼 泽责藻糟蚤藻泽援 悦燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻
糟燥灶增藻灶贼蚤燥灶葬造 泽蚤灶早造藻鄄贼藻皂责造葬贼藻 泽糟则藻藻灶蚤灶早 皂藻贼澡燥凿袁 贼澡藻 枣蚤则泽贼 则燥怎灶凿 燥枣 泽糟则藻藻灶蚤灶早 责则蚤皂藻则泽 遭赠 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 责燥燥造蚤灶早 贼藻糟澡灶燥造燥早赠
澡葬泽 则藻凿怎糟藻凿 皂燥则藻 贼澡葬灶 愿圆豫 燥枣 憎燥则噪造燥葬凿 葬灶凿 则藻葬早藻灶贼 糟燥灶泽怎皂责贼蚤燥灶援 栽澡藻 枣蚤灶凿蚤灶早泽 造葬赠 葬 枣燥怎灶凿葬贼蚤燥灶 枣燥则 葬造造鄄葬泽责藻糟贼袁 枣葬泽贼 葬灶凿
葬糟糟怎则葬贼藻 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 杂杂砸 皂葬则噪藻则 贼藻糟澡灶燥造燥早赠 蚤灶 藻怎糟葬造赠责贼 贼则藻藻泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院摇 杂杂砸 皂葬则噪藻则曰 耘怎糟葬造赠责贼怎泽曰 责则蚤皂藻则 泽糟则藻藻灶蚤灶早曰 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 责燥燥造蚤灶早
摇 摇 桉 树 是 桃 金 娘 科 渊 酝赠则贼葬糟藻葬藻 冤 桉 属
渊耘怎糟葬造赠责贼怎泽 冤尧 杯果木属 渊 粤灶早燥责澡燥则葬 冤 和伞房属
渊悦燥则赠皂遭蚤葬冤猿 个属的树种总称袁约有 怨源缘 种遥 桉树
具有生长迅速尧轮伐期短尧耐干旱尧耐贫瘠尧适应性广
等优良特性袁且用途广尧经济效益高袁因此袁桉树现已
被世界近百个国家与地区引种袁遍布于地中海地区尧
东南亚尧美洲和非洲袁目前已经成为世界第二大类造
林树种渊陈少雄等袁 圆园园愿曰 欧阳乐军等袁 圆园园愿曰 祈述
雄袁 圆园园远冤遥 我国自 员愿怨园 年引种桉树以来袁已有 员圆园
多年的历史袁种植面积不断增长袁至 圆园员园 年底袁我国
桉树人工林面积超过 猿远愿 万 澡皂圆渊谢耀坚袁 圆园员员冤遥
桉树具有优良的遗传特性和生物学性状袁种间
遗传变异很大袁这为桉树的杂交育种提供了大量的
遗传改良材料遥 但由于受自身生物学特性如树体高
大不便授粉尧世代周期长尧杂合度高等因素的制约袁
其遗传改良进程较慢遥 然而袁随着分子标记技术的
引入袁桉树的分子遗传改良研究发展迅速渊谭晓风
等袁 圆园园愿曰 张党权等袁 圆园园愿 冤遥 圆园员园 年巨桉 渊 耘援
早则葬灶凿蚤泽冤已被美国能源部联合基因组研究中心选择
为模式树种袁完成了基因组的测序 渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援
责澡赠贼燥扎燥皂藻援 灶藻贼 辕 糟早蚤鄄遭蚤灶 辕 早遭则燥憎泽藻 辕 藻怎糟葬造赠责贼怎泽 辕 冤 渊 阅韵耘
允燥蚤灶贼 郧藻灶燥皂藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 粤灶灶燥怎灶糟藻泽袁 圆园园苑冤曰 在 晕悦月陨
公共数据库中袁目前已有员远愿 园园园多条桉树的 耘杂栽序
列遥 这些基因信息都为桉树功能基因组研究和分子
育种提供了有价值的资源袁为应用分子标记技术进
行桉树特异性状分子定向育种提供了理论基础和技
林 业 科 学 源怨 卷摇
术支撑遥
基于 员 对特异引物的 杂杂砸 渊 泽蚤皂责造藻 泽藻择怎藻灶糟藻
则藻责藻葬贼泽袁 简单重复序列冤标记袁是以 圆 耀 远 个核苷酸为
单位多次串联重复的 阅晕粤 序列渊王宇袁 圆园园怨冤遥 杂杂砸
标记具有高度变异性尧共显性尧重复性好尧基因组覆盖
率高等优异特性而被广泛应用渊郧怎责贼葬 藻贼 葬造援袁 圆园园园曰
孕澡蚤造蚤责责藻 藻贼 葬造援袁 员怨怨远曰 孕燥憎藻造造 藻贼 葬造援袁 员怨怨远曰 栽葬怎贼扎袁
员怨愿怨冤遥 杂杂砸标记的开发包括 圆 种院 一种是基于基因
表达序列渊藻曾责则藻泽泽藻凿 泽藻择怎藻灶糟藻 贼葬早泽袁 耘杂栽冤开发的 杂杂砸
标记袁称为 耘杂栽鄄杂杂砸渊藻杂杂砸冤渊张亚东等袁 圆园员员曰 月藻则怎遭藻
藻贼 葬造援袁 圆园园苑曰 孕燥灶糟藻贼 藻贼 葬造援袁 圆园园远冤曰 另一种是基于基因
组序列开发的 杂杂砸 标记袁称为 郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸渊早杂杂砸冤遥
藻杂杂砸来自于基因编码序列袁更容易获得基因表达的
信息袁为功能基因的直接鉴定提供了可能性渊罗冉等袁
圆园员园冤遥 早杂杂砸来自于基因组非编码序列袁多态性明显
高于 藻杂杂砸袁但开发成本高且周期长袁然而袁随着非编
码序列调控功能的大量发现袁早杂杂砸 在发现性状调控
因子方面的潜力巨大遥
桉树的 杂杂砸标记有高度保守性和遗传多样性袁
采用 杂杂砸标记技术非常有利于桉树遗传结构尧遗传
多样性尧分子标记辅助选择育种的深入研究渊刘果
等袁 圆园员圆曰 张党权等袁 圆园员园曰 阅藻灶蚤泽 藻贼 葬造援袁 圆园员圆冤遥 目
前国内外已有较多桉树 耘杂栽鄄杂杂砸 标记的开发研究
渊何旭东袁 圆园员园曰 李发根袁 圆园员园曰 王宇袁 圆园园怨曰
粤则怎皂怎早葬泽怎灶凿葬则葬皂 藻贼 葬造援袁 圆园员员曰 月则燥灶凿葬灶蚤 藻贼 葬造援袁 员怨怨愿曰
月则燥灶凿葬灶蚤 藻贼 葬造援袁 圆园园圆曰 晕葬早葬遭澡怎泽澡葬灶葬 藻贼 葬造援袁 圆园员员曰
酝葬则择怎藻泽 藻贼 葬造援袁 圆园园圆冤袁但对桉树 郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸 标记
的开发研究还较少遥 本研究采用开发的基于基因组
阅晕粤混合池的桉树 杂杂砸引物快速筛选技术袁进行桉
树 早杂杂砸与 藻杂杂砸 标记的大量快速开发研究袁探索二
者及其引物在桉树中的通用性和多态性效应袁为
杂杂砸标记技术在桉树中的全方面尧快速准确应用奠
定基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 试验材料摇 采用 远 种桉树叶片为材料袁其中细
叶桉渊耘怎糟葬造赠责贼怎泽 贼藻则藻贼蚤糟燥则灶蚤泽冤 渊员 号冤尧巨桉渊圆 号冤和
粗皮桉渊耘援 责藻造造蚤贼葬冤渊远 号冤采集于广东省湛江市遂溪
县南方国家级重要种苗基地袁尾叶桉渊耘援 怎则燥责澡赠造造葬冤
渊猿 号冤尧赤桉 渊耘援 糟葬皂葬造凿怎造藻灶泽蚤泽冤 渊源 号冤和柠檬桉
渊悦燥则赠皂遭蚤葬 糟蚤贼则蚤燥凿燥则葬冤 渊缘 号冤采集于广东省雷州市遥
其中袁柠檬桉渊缘 号冤属于桃金娘科伞房属植物袁其余
缘 种桉树均属于桃金娘科桉属植物 渊王豁然袁
圆园员园冤遥
员郾 圆摇 桉树基因组 阅晕粤 提取与混合池构建摇 员冤 基
因组 阅晕粤 提取及检测 摇 采用 匝陨粤郧耘晕 公司的
阅晕藻葬泽赠 孕造葬灶贼 酝蚤灶蚤 运蚤贼进行桉树叶片的基因组 阅晕粤
提取遥 提取结束后袁在 员郾 缘豫 琼脂糖凝胶上进行
阅晕粤样品的浓度检测渊检测染料为 郧藻造砸藻凿栽酝冤遥 依
据样品 阅晕粤的浓度袁将各样品 阅晕粤 稀释为相同浓
度袁于 原圆园 益保存备用遥
圆冤 基因组 阅晕粤混合池的构建摇 将浓度一致的
远个桉树基因组 阅晕粤样品等量混合袁构建为 员 个桉
树基因组 阅晕粤混合池袁电泳检测确定其浓度遥
员郾 猿摇 桉树 杂杂砸引物的设计摇 员冤 基因组序列和 耘杂栽
序列的下载与预处理 摇 以 晕悦月陨 公共数据库
渊澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援 早燥增 辕 泽蚤贼藻泽 辕 早择怎藻则赠冤下载
的桉树相关核苷酸序列及 圆园员园 年和 圆园员员 年更新的
桉树 耘杂栽序列渊截至 圆园员员 年 员员 月 苑 日冤为基础袁利
用 阅晕粤杂贼葬则软件的 杂藻择酝葬灶域模块对所有下载的序
列分别进行 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻数据库和 耘杂栽 数据库的去冗
拼接和聚类遥
圆冤 杂杂砸位点查找及引物设计摇 利用 杂杂砸匀怎灶贼藻则
软件对去冗拼接好的 悦燥灶贼蚤早泽 序列进行 杂杂砸 位点查
找遥 查找标准为含有 圆袁猿袁源袁缘袁远 碱基重复的 杂杂砸位
点袁其重复次数分别不小于 怨袁远袁缘袁源袁猿袁即碱基重复
至少要达到 员愿 个碱基长度遥 对所有筛选出的含有
杂杂砸位点的 悦燥灶贼蚤早泽序列利用软件 孕则蚤皂藻则缘郾 园 进行引
物设计袁利用 韵造蚤早燥 远郾 园 软件对所设计出的引物进行
评价分析并筛选出评价高的引物遥 筛选出的引物由
英潍捷基渊上海冤贸易有限公司合成遥
员郾 源摇 杂杂砸鄄孕悦砸条件优化摇 以桉树基因组 阅晕粤混合
池为模板袁参照李发根渊圆园员园冤的 杂杂砸鄄孕悦砸条件优化
程序进行引物筛选遥 孕悦砸 条件优化主要通过调整
酝早圆 垣浓度和退火温度渊栽皂冤袁使扩增产物具有较好的
特异性及较高的得率遥 具体的 孕悦砸扩增体系如表 员
所示遥 孕悦砸扩增产物进行 员郾 缘豫的琼脂糖凝胶电泳
检测遥
表 员摇 圆园 滋蕴 杂杂砸鄄孕悦砸反应体系
栽葬遭郾 员摇 圆园 滋蕴 杂杂砸鄄孕悦砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂
成分 悦燥皂责燥灶藻灶贼 含量 悦燥灶贼藻灶贼
酝早圆 垣 员郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 圆郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员 圆郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员
栽葬择 月怎枣枣藻则渊酝早圆 垣 枣则藻藻冤 圆郾 园 滋蕴 圆郾 园 滋蕴 圆郾 园 滋蕴
凿晕栽孕泽 圆郾 园 滋蕴 圆郾 园 滋蕴 圆郾 园 滋蕴
栽葬择渊缘 哉窑滋蕴 原员 冤 园郾 源 滋蕴 园郾 源 滋蕴 园郾 源 滋蕴
酝早圆 垣 渊圆缘 皂皂燥造窑蕴 原员 冤 员郾 圆 滋蕴 员郾 远 滋蕴 圆郾 园 滋蕴
云燥则憎葬则凿 孕则蚤皂藻则 员郾 园 滋蕴 员郾 园 滋蕴 员郾 园 滋蕴
砸藻增藻则泽藻 孕则蚤皂藻则 员郾 园 滋蕴 员郾 园 滋蕴 员郾 园 滋蕴
阅晕粤 员郾 园 滋蕴 员郾 园 滋蕴 员郾 园 滋蕴
凿凿匀圆韵 补水至 圆园 滋蕴 宰葬贼藻则 贼燥 圆园 滋蕴
愿圆员
摇 第 圆 期 刘摇 果等院 桉树 郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸和 耘杂栽鄄杂杂砸引物的快速筛选与通用性研究
员郾 缘摇 杂杂砸引物筛选摇 杂杂砸 引物筛选流程为院 员冤 将
所有引物在退火温度 缘远 益尧酝早圆 垣浓度为 圆郾 园 皂皂燥造窑
蕴 原员的条件下扩增袁结果为明显的单一条带或 圆 条条
带袁其中亮带较弱带强 圆 倍以上的为有效引物曰
圆冤 再将剩下的引物继续在 酝早圆 垣浓度为 圆郾 缘 皂皂燥造窑
蕴 原员或 员郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员条件下进行第 圆 轮扩增袁结果
较好的为有效引物曰 猿冤 最后设定退火温度 栽皂为 缘园
益或 远园 益袁并与 猿 种 酝早圆 垣浓度相互交叉袁反复筛
选遥 每一轮筛选保留扩增结果较好的引物为有效引
物袁筛选到最后仍得不到较理想扩增产物的引物为
无效引物袁舍弃遥
孕悦砸扩增循环条件为院 怨源 益预变性 源 皂蚤灶曰 怨源
益变性 猿园 泽袁栽皂退火渊缘远 益袁缘园 益袁远园 益冤猿园 泽袁苑圆 益
延伸 员 皂蚤灶袁猿缘 个循环曰 苑圆 益后延伸 员园 皂蚤灶遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 杂杂砸引物设计摇 员冤 耘杂栽 序列和核苷酸序列下
载与预处理摇 从 晕悦月陨公共数据库下载桉树相关的
源缘 圆缘苑条序列袁包括核苷酸序列圆愿 远怨员条袁耘杂栽 序列
员远 缘远远条遥 经去冗拼接后得到员源 员圆员条 悦燥灶贼蚤早泽袁符
合 杂杂砸位点查找标准的有效序列有员 苑愿缘条袁其中
耘杂栽序列有 愿圆园 条袁核苷酸序列有 怨远缘 条遥 从表 圆
可知袁本次下载的桉树 耘杂栽 序列和桉树核苷酸序列
中袁二核苷酸重复单元在所有重复单元中占有比重
最大袁所占比例为 源源郾 缘缘豫 曰 其次为三核苷酸重复单
元袁所占比例为 猿圆郾 怨源豫 曰 四核苷酸和五核苷酸重复
单元所占比例都很小袁所占比例分别为 猿郾 员愿豫和
圆郾 愿源豫 遥 与何旭东渊圆园员园冤和李发根渊圆园员园冤的 藻杂杂砸
统计数据一致遥
表 圆摇 桉树 杂杂砸位点数据统计
栽葬遭郾 圆摇 杂贼葬贼蚤泽贼蚤糟泽 燥枣 杂杂砸泽 早藻灶藻则葬贼藻凿 枣则燥皂 耘怎糟葬造赠责贼怎泽
序列的分类悦造葬泽泽蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 泽藻择怎藻灶糟藻泽
耘杂栽序列耘杂栽 泽藻择怎藻灶糟藻泽 基因组序列郧藻灶燥皂蚤糟 泽藻择怎藻灶糟藻泽
巨桉
耘郾 早则葬灶凿蚤泽 蓝桉耘郾 早造燥遭怎造怎泽 巨桉耘郾 早则葬灶凿蚤泽 蓝桉耘郾 早造燥遭怎造怎泽 赤桉耘郾 糟葬皂葬造凿怎造藻灶泽蚤泽 亮果桉耘郾 灶蚤贼藻灶泽 冈尼桉耘郾 早怎灶灶蚤蚤 尾叶桉耘郾 怎则燥责澡赠造造葬
合计栽燥贼葬造
所有下载的序列栽燥贼葬造 灶怎皂遭藻则 燥枣 泽藻择怎藻灶糟藻泽凿燥憎灶造燥葬凿藻凿 员远 园园愿 缘缘愿 缘 苑缘员 员 圆园远 员猿 猿苑猿 圆远缘 苑 愿园猿 圆怨猿 源缘 圆缘苑
拼接后的序列悦燥灶贼蚤早泽 苑 苑员怨 缘圆猿 员 愿圆源 圆远远 员缘猿 猿猿 猿 缘员远 愿苑 员源 员圆员
含 杂杂砸位点的序列栽燥贼葬造 灶怎皂遭藻则 燥枣 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 杂杂砸泽 苑怨远 圆源 远猿园 缘员 源苑 猿 员愿员 缘猿 员 苑愿缘
二核苷酸阅蚤鄄灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 贼赠责藻 圆愿远 员园 缘园远 圆愿 源愿 猿 愿园 远园 员 园圆员渊源源郾 缘缘豫 冤
三核苷酸栽则蚤鄄灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 贼赠责藻 源园缘 苑 圆源源 猿员 苑 园 缘愿 猿 苑缘缘渊猿圆郾 怨源豫 冤
四核苷酸栽藻曾葬鄄灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 贼赠责藻 猿园 员 猿圆 员 园 园 愿 员 苑猿渊猿郾 员愿豫 冤
五核苷酸孕藻灶贼葬鄄灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 贼赠责藻 圆缘 园 猿园 猿 员 园 远 园 远缘渊圆郾 愿源豫 冤
六核苷酸匀藻曾葬鄄灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 贼赠责藻 员怨怨 苑 员员怨 源 缘 园 源猿 员 猿苑愿渊员远郾 源怨豫 冤
摇 摇 圆冤 杂杂砸位点查找及引物设计评估 摇 随机挑选
部分有效序列进行引物的设计和评估分析后袁共
猿怨缘 对引物用于本次试验遥 其中 藻杂杂砸 引物 员缘园 对袁
包括蓝桉 怨 对和巨桉 员源员 对遥 早杂杂砸 引物 圆源缘 对袁包
括巨桉 员远愿 对袁蓝桉 员猿 对袁赤桉 员苑 对袁冈尼桉 猿远
对袁尾叶桉 员员 对遥 杂杂砸引物长度均为 员愿 耀 圆圆 遭责袁引
物设计的目的片段大小均为 圆园园 耀 缘园园 遭责遥
圆郾 圆摇 杂杂砸引物筛选摇 经过 怨 轮 孕悦砸 体系优化的筛
选后袁总共成功扩增的引物有 猿源园 对袁藻杂杂砸 引物筛
选成功 员猿远 对袁早杂杂砸引物成功筛选了 圆园源 对遥 筛选
成功的引物能获得比较单一明亮的片段袁扩增成功
率达 愿远郾 园愿豫 袁其中 耘杂栽鄄杂杂砸 引物筛选成功率为
怨园郾 远苑豫 袁早杂杂砸 引物筛选成功率为 愿猿郾 圆远豫 袁说明了
桉树 杂杂砸 引物在桉树中的通用性比较好遥 图 员 和
图 圆 分别为 藻杂杂砸和 早杂杂砸部分引物筛选图遥
如表 猿 所示袁退火温度 栽皂为 缘远 益袁酝早圆 垣浓度为
圆郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员或 圆郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员时袁成功扩增率最
高遥 第 员 轮筛选中袁 藻杂杂砸 引物筛选在 圆郾 缘 皂皂燥造窑
蕴 原员 酝早圆 垣和 缘远 益退火温度条件下袁成功扩增率就达
到了 缘远郾 园豫 曰 早杂杂砸引物筛选在 圆郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员 酝早圆 垣
和 缘远 益 退火温度条件下袁 成功扩增率就有
远员郾 源猿豫 遥 基本成功扩增的均达到一半以上袁与李发
怨圆员
林 业 科 学 源怨 卷摇
图 员摇 部分 藻杂杂砸引物快速筛选结果
云蚤早郾 员摇 云葬泽贼 泽糟则藻藻灶蚤灶早 则藻泽怎造贼 燥枣 责葬则贼蚤葬造 藻杂杂砸 责则蚤皂藻则泽
酝院 酝葬则噪藻则曰 员袁圆袁猿袁源袁苑袁愿袁员园袁员员袁员圆袁员源袁员缘袁员远袁员愿袁圆园 泳道的条带为成功筛选出的引物扩增条带遥
员袁圆袁猿袁源袁苑袁愿袁员园袁员员袁员圆袁员源袁员缘袁员远袁员愿袁圆园 造葬灶藻 泽贼则蚤责藻泽 葬则藻 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠 泽糟则藻藻灶藻凿 葬泽 责则蚤皂藻则泽蒺 遭葬灶凿泽 蚤灶 贼澡藻 枣蚤早怎则藻援
图 圆摇 部分 早杂杂砸引物快速筛选结果
云蚤早郾 圆摇 云葬泽贼 泽糟则藻藻灶蚤灶早 则藻泽怎造贼 燥枣 责葬则贼蚤葬造 早杂杂砸 责则蚤皂藻则泽
酝院 酝葬则噪藻则曰 圆袁缘袁远袁怨袁员员袁员猿袁员缘袁员苑袁员愿袁圆园 泳道的条带为成功筛选出的引物扩增条带遥
圆袁缘袁远袁怨袁员员袁员猿袁员缘袁员苑袁员愿袁圆园 造葬灶藻 泽贼则蚤责藻泽 葬则藻 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠 泽糟则藻藻灶藻凿 葬泽 责则蚤皂藻则泽蒺 遭葬灶凿泽 蚤灶 贼澡藻 枣蚤早怎则藻援
表 猿摇 杂杂砸引物筛选结果
栽葬遭郾 猿摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼 燥枣 贼澡藻 责则蚤皂藻则 泽糟则藻藻灶蚤灶早
筛选轮次杂糟则藻藻灶蚤灶早 贼怎则灶泽
酝早圆 垣浓度
悦燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 酝早圆 垣 辕
渊皂皂燥造窑蕴 原员 冤
退火温度
栽皂 辕 益
筛选成功的引物数渊对冤杂怎糟糟藻藻凿 蚤灶 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶渊责葬蚤则泽冤 筛选成功率杂怎糟糟藻泽泽 则葬贼蚤燥 蚤灶 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶渊豫 冤
郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸 耘杂栽鄄杂杂砸 郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸 耘杂栽鄄杂杂砸
员 圆郾 园 缘远 员圆远 圆圆 缘员郾 源猿 员源郾 远苑
圆 缘园 愿 圆 猿郾 圆远 员郾 猿猿
猿 远园 圆圆 源 愿郾 怨愿 圆郾 远苑
源 员郾 缘 缘远 圆 员圆 园郾 愿圆 愿郾 园园
缘 缘园 远 员园 圆郾 源缘 远郾 远苑
远 远园 圆缘 员 员园郾 圆园 园郾 远苑
苑 圆郾 缘 缘远 远 愿源 圆郾 源缘 缘远郾 园园
愿 缘园 缘 员 圆郾 园源 园郾 远苑
怨 远园 源 园 员郾 远猿 园
合计 栽燥贼葬造 圆园源 员猿远 愿猿郾 圆远 怨园郾 远愿
园猿员
摇 第 圆 期 刘摇 果等院 桉树 郧藻灶燥皂蚤糟鄄杂杂砸和 耘杂栽鄄杂杂砸引物的快速筛选与通用性研究
根渊圆园员园冤和郭勇渊圆园园愿冤研究结果一致遥 与常规单
一模板引物筛选相比袁基于基因组 阅晕粤混合池技术
的第 员 轮引物筛选就降低了 愿猿郾 猿猿豫的工作量袁试
剂消耗量节约了 愿圆郾 愿远豫 遥
圆郾 猿摇 杂杂砸引物的通用性分析摇 与引物快速筛选相
同的 孕悦砸体系和循环条件下袁选出 远 对有效引物
进行通用性分析袁其中 早杂杂砸 引物 猿 对袁藻杂杂砸 引物
猿 对渊图 猿袁图 源冤遥 图 猿葬袁遭袁糟分别为引物
早杂杂砸鄄郧砸员员员 渊云院 悦栽郧栽栽粤栽悦栽郧粤栽郧栽悦悦悦粤悦栽 辕
砸院 栽悦悦粤悦栽郧粤悦栽栽悦悦悦栽郧栽栽冤袁
早杂杂砸鄄郧砸员猿远 渊云院 栽郧郧粤悦悦悦粤悦悦粤粤郧粤粤悦粤粤 辕
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早杂杂砸鄄哉砸园园怨 渊云院 郧郧郧郧栽栽栽郧栽郧悦栽粤郧栽郧郧粤 辕
砸院 郧悦栽悦粤郧悦郧郧栽粤郧粤粤栽郧郧粤冤
在 远个桉树基因组 阅晕粤 样品中的逐一扩增效果图遥
猿对引物在 员袁圆袁猿袁源袁远 号模板中特异性都比较好袁均
有单一明显条带曰 缘号样品渊柠檬桉冤只在引物 早杂杂砸鄄
郧砸员猿远中有单一明显条带袁表明柠檬桉与其他桉树样
品可能有较大遗传差异遥 图 源葬袁遭袁糟分别为引物
摇 藻杂杂砸鄄郧砸园圆怨 渊云院 悦粤粤郧悦粤郧粤悦栽粤栽栽悦悦郧栽郧粤郧 辕
砸院 悦粤栽粤粤郧悦粤粤悦悦粤郧悦郧粤栽悦冤袁
摇 藻杂杂砸鄄郧砸园猿缘 渊云院 栽悦粤粤郧郧悦粤悦郧悦栽郧粤粤粤悦栽 辕
砸院 粤郧栽悦悦栽悦悦栽栽悦粤栽悦悦悦粤栽栽冤袁
摇 藻杂杂砸鄄郧砸园苑源 渊云院 栽郧悦悦栽栽郧郧栽悦粤栽栽栽悦粤郧悦 辕
砸院 栽粤郧悦郧粤悦栽栽悦悦粤悦栽悦栽栽悦悦栽冤
在 远 个桉树基因组 阅晕粤样品中逐一扩增效果图遥 猿
对引物在 员袁圆袁猿袁远 号模板中都有比较理想的特异性
条带袁扩增效果好曰 源 号样品渊赤桉冤在引物 藻杂杂砸鄄
郧砸园圆怨 和 藻杂杂砸鄄郧砸园猿缘 中都有单一明显的扩增条
带袁在引物 藻杂杂砸鄄郧砸园苑源 中没有扩增条带曰 缘 号样品
渊柠檬桉冤则只在引物 藻杂杂砸鄄郧砸园猿缘 中有单一明显条
带袁其余 圆 对引物中均无扩增条带遥 早杂杂砸 和 藻杂杂砸
的检测结果表明所筛选的桉树 杂杂砸 引物具有较好
的多态性和通用性遥
图 猿摇 早杂杂砸鄄郧砸员员员渊葬冤袁早杂杂砸鄄郧砸员猿远渊遭冤袁早杂杂砸鄄哉砸园园怨渊糟冤猿 对引物单一模板的扩增效果
云蚤早郾 猿摇 早杂杂砸鄄郧砸员员员渊葬冤袁 早杂杂砸鄄郧砸员猿远渊遭冤袁 早杂杂砸鄄哉砸园园怨渊糟冤袁 贼澡则藻藻 责葬蚤则泽 燥枣 责则蚤皂藻则泽 泽蚤灶早造藻 贼藻皂责造葬贼藻 孕悦砸 凿藻贼藻糟贼藻凿 遭赠 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽
酝院 酝葬则噪藻则曰 员援 细叶桉 耘援 贼藻则藻贼蚤糟燥则灶蚤泽曰 圆援 巨桉 耘援 早则葬灶凿蚤泽曰 猿援 尾叶桉 耘援 怎则燥责澡赠造造葬曰 源援 赤桉 耘援 糟葬皂葬造凿怎造藻灶泽蚤泽曰
缘援 柠檬桉 悦援 糟蚤贼则蚤燥凿燥则葬曰 远援 粗皮桉 耘援 责藻造造蚤贼葬援 下同遥 栽澡藻 泽葬皂藻 遭藻造燥憎援
图 源摇 藻杂杂砸鄄郧砸园圆怨渊葬冤袁 藻杂杂砸鄄郧砸园猿缘渊遭冤袁 藻杂杂砸鄄郧砸园苑源渊糟冤 猿 对引物单一模板的扩增效果
云蚤早郾 源摇 藻杂杂砸鄄郧砸园圆怨渊葬冤袁 藻杂杂砸鄄郧砸园猿缘渊遭冤袁 藻杂杂砸鄄郧砸园苑源渊糟冤袁贼澡则藻藻 责葬蚤则泽 燥枣 责则蚤皂藻则泽 泽蚤灶早造藻 贼藻皂责造葬贼藻 孕悦砸 凿藻贼藻糟贼藻凿 遭赠 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽
猿摇 结论与讨论
本研究通过优化 杂杂砸鄄孕悦砸 条件袁对设计的 猿怨缘
对桉树 杂杂砸引物进行高效快速筛选袁筛选成功率达
愿远郾 园远豫 袁其中 早杂杂砸和 藻杂杂砸分别成功筛选 圆园源 对和
员猿远 对袁筛选成功率分别为 愿猿郾 圆远豫和 怨园郾 远苑豫 遥 进
一步的试验结果表明袁本研究设计的 杂杂砸 引物在桉
树中有很好的多态性和通用性袁能适用于各种桉树
的 杂杂砸标记的分析遥
猿郾 员摇 基因组 阅晕粤 混合池的构建摇 基因组 阅晕粤 混
合池选用的 远 个桉树基因组 阅晕粤 样品按照等量混
合袁保证了各个样品在混合池中的相同浓度袁使得构
员猿员
林 业 科 学 源怨 卷摇
建出来的 阅晕粤 混合池能够相等地代表其中的 远 个
样品遥 经电泳检测得到的浓度也充分显示出构建的
阅晕粤混合池与 远 个样品的浓度和片段大小都比较
一致袁可以作为模板进行 孕悦砸 扩增筛选引物遥 第 员
轮引物筛选中袁与单一模板的常规筛选引物相比袁基
于基因组 阅晕粤混合池技术筛选引物降低了 愿圆豫以
上的工作量和试剂消耗遥
猿郾 圆摇 桉树 杂杂砸信息的评估 摇 从下载的源缘 圆缘苑条桉
树基因组序列和最新 耘杂栽 序列袁经拼接而成的
员源 员源员条 悦燥灶贼蚤早泽 中有员 苑愿缘条渊员圆郾 远源豫 冤含有 杂杂砸
位点袁这个频率与 耘造造蚤泽和 月怎则噪藻渊圆园园苑冤以及 再葬泽燥凿澡葬
等渊 圆园园愿 冤 报道的桉树 杂杂砸 位点频率 员圆郾 猿豫 和
员圆郾 怨豫很接近曰 但与何旭东渊圆园员园冤报道的桉树 耘杂栽
序列中 杂杂砸位点的频率 圆缘郾 圆缘豫 袁砸葬遭藻造造燥 等渊圆园园缘冤
和 悦藻则藻泽蚤灶蚤等渊圆园园缘冤报道的桉树 杂杂砸 位点的频率
圆缘郾 缘豫和 圆缘郾 远豫 袁有一定的差异遥 这可能是由于本
试验利用的数据中基因组序列较多袁耘杂栽 序列只为
圆园员园 年和 圆园员员 年更新的数据遥
一般来说袁双子叶植物中二核苷酸重复序列最
多遥 本试验中袁桉树二核苷酸重复序列和三核苷酸
重复序列比较丰富袁分别占总类型中的 源源郾 源员豫和
猿圆郾 苑愿豫 曰 四核苷酸重复序列和五核苷酸重复序列
则相对很少袁分别为 猿郾 员远豫和 猿郾 圆员豫 遥 这些数据与
何旭东渊圆园员园冤在桉树 耘杂栽 序列中 杂杂砸 位点调查结
果非常接近遥
猿郾 猿摇 桉树 杂杂砸 引物的多态性与通用性 摇 经 怨 轮
孕悦砸体系优化的筛选后袁成功扩增的 猿源园 对 杂杂砸 引
物中袁员猿远 对为 藻杂杂砸 引物袁圆园源 对为 早杂杂砸 引物袁扩
增成功率达 愿远郾 园愿豫 遥 说明 杂杂砸引物在桉树中的通
用性较好袁在亲缘关系较近的种之间可以共享同一
杂杂砸标记袁与 悦怎责藻则贼蚤灶燥等渊圆园员员冤报道的基因组 杂杂砸
和 耘杂栽鄄杂杂砸 圆 种标记在桉树杂交种中没有显著性差
异的结论一致遥 耘造造蚤泽 等渊圆园园苑冤报道 杂杂砸 的片段长
度和其稳定性在不同物种间和同一物种内部的位点
间是有变化的袁来源于 早杂杂砸 比来源于 耘杂栽 的 杂杂砸
有较高的多态性袁早杂杂砸通用性相比较于 藻杂杂砸要差遥
本试验中袁藻杂杂砸 引物筛选成功率为 怨园郾 远苑豫 袁早杂杂砸
引物筛选成功率为 愿猿郾 圆远豫 袁低于 藻杂杂砸 引物筛选成
功率袁这可能是由于选用的 耘杂栽 序列只有基因组序
列的 缘苑郾 苑源豫 袁所以才会使得基因组序列的 杂杂砸 引
物筛选成功率较 耘杂栽序列的低遥
选用的 远 对有效引物对 远 个 阅晕粤 模板逐一进
行 孕悦砸扩增袁远 对引物在 员袁 圆袁 猿袁 远 号 阅晕粤 模板
渊细叶桉尧巨桉尧尾叶桉尧粗皮桉冤中特异性都比较理
想袁均有单一明亮的扩增条带袁有 缘 对引物在 源 号模
板渊赤桉冤中有较好的特异性袁有 圆 对引物在 缘 号模
板渊柠檬桉冤中有单一明显条带曰 统计得到适用率达
愿远郾 员员豫 袁其中 藻杂杂砸引物的适用率为 愿猿郾 猿猿豫 袁早杂杂砸
引物的适用率为 愿愿郾 愿怨豫 遥 缘 号柠檬桉表现为明显
的多态性袁这可能是柠檬桉渊伞房属冤与其他 缘 种桉
树渊桉属冤不属于同一属所致遥
参 考 文 献
陈少雄袁吴志华援 圆园园愿援 桉树分子育种研究进展援中南林业科技大学
学报院 自然科学版袁 圆愿渊源冤院 源圆 原 源愿援
郭摇 勇援 圆园园愿援 利用 耘杂栽鄄悦粤孕杂标记构建桉树遗传图谱援中国林业科
学研究院硕士学位论文援
何旭东援 圆园员园援 桉树杂种优势及其分子标记辅助选择研究援 南京林
业大学博士学位论文援
李发根援 圆园员园援 尾叶桉和细叶桉 杂栽杂标记连锁图谱构建及生长状况
匝栽蕴定位研究援 中国林业科学研究院博士学位论文援
刘摇 果袁谢耀坚援 圆园员圆援 分子标记技术在桉树育种中的应用研究援世
界林业研究袁 圆缘渊猿冤院 员怨 原 圆缘援
罗摇 冉袁吴委林袁张摇 旸袁等援 圆园员园援 杂杂砸分子标记在作物遗传育种中
的应用援基因组学与应用生物学袁 圆怨渊员冤院 员猿苑 原 员源猿援
欧阳乐军袁曾富华援 圆园园愿援 桉树分子育种研究进展援分子植物育种袁 远
渊远冤院 员员源远 原 员员缘圆援
祈述雄援 圆园园远援 中国桉树援 北京院 中国林业出版社袁 圆猿 原 圆源援
谭晓风袁陈鸿鹏袁张党权袁等援 圆园园愿援 油茶 云粤阅圆 基因全长 糟阅晕粤的克
隆和序列分析援林业科学袁 源源渊猿冤院 苑园 原 苑缘援
王豁然援 圆园员园援 桉树生物学概论援 北京院 科学出版社袁 缘 原 怨援
王摇 宇援 圆园园怨援 桉树 耘杂栽鄄杂杂砸标记开发及其遗传图谱构建援 南京林
业大学硕士学位论文援
谢耀坚援 圆园员员援 中国桉树育种研究进展及宏观策略援 世界林业研究袁
圆源渊源冤院 缘园 原 缘源援
张党权袁谭晓风袁陈鸿鹏袁等援 圆园园愿援 油茶 杂粤阅 基因的全长 糟阅晕粤 克
隆及生物信息学分析援林业科学袁 源源渊圆冤院 员缘缘 原 员缘怨援
张党权袁明付焕袁江摇 平袁等援 圆园员园援 绵毛优若藜冷诱导 杂杂匀 文库构
建研究援中南林业科技大学学报院 自然科学版袁 猿园渊圆冤院 远缘 原 远怨援
张亚东袁彭摇 婵袁李振芳袁等援 圆园员员援 基因组 杂杂砸 与 耘杂栽鄄杂杂砸 标记在
杨树 不 同 种 间 的 遗 传 差 异援 东 北 林 业 大 学 学 报袁
猿怨渊员圆冤院 愿 原 员圆援
粤则怎皂怎早葬泽怎灶凿葬则葬皂 杂袁 郧澡燥泽澡 酝袁 灾藻藻则葬泽葬皂赠 杂袁 藻贼 葬造援 圆园员员援 杂责藻糟蚤藻泽
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耘怎糟葬造赠责贼怎泽 糟葬皂葬造凿怎造藻灶泽蚤泽 葬灶凿 耘援 贼藻则藻贼蚤糟燥则灶蚤泽 怎泽蚤灶早 杂杂砸 皂葬则噪藻则泽援
孕蕴燥杂 韵灶藻袁远渊员圆冤院 藻圆愿圆缘圆援
月藻则怎遭藻 再袁在澡怎葬灶早 允袁砸怎灶早蚤泽 阅援 圆园园苑援 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 耘杂栽鄄杂杂砸 蚤灶
造燥遭造燥造造赠 责蚤灶藻 葬灶凿 泽责则怎糟藻援 栽则藻藻 郧藻灶藻贼蚤糟泽 葬灶凿 郧藻灶燥皂藻泽袁
渊猿冤院 圆缘员 原 圆缘怨援
月则燥灶凿葬灶蚤 砸 孕 灾袁 月则燥灶凿葬灶蚤 悦袁 栽葬则糟澡蚤灶蚤 砸袁 藻贼 葬造援 员怨怨愿援 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼袁
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悦藻则藻泽蚤灶蚤 孕 悦袁 杂蚤造增葬 悦 蕴 杂 孕袁 酝蚤泽泽蚤燥 砸 云袁 藻贼 葬造援 圆园园缘援 杂葬贼藻造造赠责贼怎泽院
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酝燥造 月蚤燥造袁 圆愿院 缘愿怨 原 远园园援
悦怎责藻则贼蚤灶燥 云 月袁蕴藻葬造 允 月袁悦燥则则藻葬 砸 载袁 藻贼 葬造援 圆园员员援 郧藻灶藻贼蚤糟 凿蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣
耘怎糟葬造赠责贼怎泽 澡赠遭则蚤凿泽 藻泽贼蚤皂葬贼藻凿 遭赠 早藻灶燥皂蚤糟 葬灶凿 耘杂栽 皂蚤糟则燥泽葬贼藻造造蚤贼藻
皂葬则噪藻则泽援 月蚤燥造蚤燥早蚤葬 孕造葬灶贼葬则怎皂袁 缘缘渊圆冤院 猿苑怨 原 猿愿圆援
阅藻灶蚤泽 酝袁月燥怎增藻贼 允 酝援 圆园员圆援 耘枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 泽藻造藻糟贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 皂燥凿藻造泽
蚤灶糟造怎凿蚤灶早 凿燥皂蚤灶葬灶糟藻 藻枣枣藻糟贼 蚤灶 贼澡藻 糟燥灶贼藻曾贼 燥枣 耘怎糟葬造赠责贼怎泽 遭则藻藻凿蚤灶早援
栽则藻藻 郧藻灶藻贼蚤糟泽 驭 郧藻灶燥皂藻泽袁 员园院 员 原 员缘援
阅韵耘 允燥蚤灶贼 郧藻灶燥皂藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻援 圆园园苑援 耘怎糟葬造赠责贼怎泽袁枣燥曾贼葬蚤造 皂蚤造造藻贼袁则藻凿 葬造早葬藻袁
葬灶凿 灶燥增藻造 皂蚤糟则燥遭蚤葬造 糟燥皂皂怎灶蚤贼蚤藻泽 葬凿凿藻凿 贼燥 早则燥憎蚤灶早 遭蚤燥藻灶藻则早赠 葬灶凿
糟葬则遭燥灶 糟赠糟造蚤灶早 责燥则贼枣燥造蚤燥援 咱圆园园苑 原 园远 原 园愿暂 援 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 躁早蚤援 凿燥藻援
早燥增 辕 晕藻憎泽 辕 灶藻憎泽赃远赃愿赃园苑援 澡贼皂造援
耘造造蚤泽 允 砸袁 月怎则噪藻 允 酝援 圆园园苑援 耘杂栽鄄杂杂砸泽 葬泽 葬 则藻泽燥怎则糟藻 枣燥则 责燥责怎造葬贼蚤燥灶
早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽藻泽援 匀藻则藻凿蚤贼赠袁 怨怨院 员圆缘 原 员猿圆援
郧怎责贼葬 孕 运袁 灾葬则泽澡灶藻赠 砸 运援 圆园园园援 栽澡藻 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 葬灶凿 怎泽藻 燥枣
皂蚤糟则燥泽葬贼藻造造蚤贼藻 皂葬则噪藻则泽 枣燥则 早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 葬灶凿 责造葬灶贼 遭则藻藻凿蚤灶早 憎蚤贼澡
藻皂责澡葬泽蚤泽 燥灶 遭则藻葬凿 憎澡藻葬贼援 耘怎责澡赠贼蚤糟葬袁 员员猿渊猿冤院 员远猿 原 员愿缘援
酝葬则择怎藻泽 悦袁月则燥灶凿葬灶蚤 砸袁郧则葬贼贼葬责葬早造蚤葬 阅袁 藻贼 葬造援 圆园园圆援 悦燥灶泽藻则增葬贼蚤燥灶 葬灶凿
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耘怎糟葬造赠责贼怎泽 泽责藻糟蚤藻泽援 栽粤郧 栽澡藻燥则蚤贼蚤糟葬造 葬灶凿 粤责责造蚤藻凿 郧藻灶藻贼蚤糟泽袁员园缘渊圆 辕
猿冤院 源苑源 原 源苑愿援
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责燥责怎造葬贼蚤燥灶泽 葬灶凿 遭葬糟噪援 栽则藻灶凿泽 蚤灶 耘糟燥造燥早赠 驭 耘增燥造怎贼蚤燥灶袁 员员 渊员园冤院
源圆源 原 源圆怨援
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早藻灶怎泽援 酝燥造 郧藻灶 郧藻灶燥皂蚤糟泽袁圆苑远院 源猿远 原 源源怨援
孕燥憎藻造造 宰袁酝葬糟澡则葬赠 郧 悦袁孕则燥增葬灶 允援 员怨怨远援 孕燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂泽 则藻增藻葬造藻凿 遭赠
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燥枣 皂蚤糟则燥泽葬贼藻造造蚤贼藻泽 蚤灶 耘怎糟葬造赠责贼怎泽 泽责责援 院 葬遭怎灶凿葬灶糟藻袁 造藻灶早贼澡 增葬则蚤葬贼蚤燥灶
葬灶凿 贼则葬灶泽责燥泽燥灶 葬泽泽燥糟蚤葬贼蚤燥灶泽援 郧藻灶 酝燥造 月蚤燥造袁 圆愿院 缘愿圆 原 缘愿愿援
栽葬怎贼扎 阅援 员怨愿怨援 匀赠责藻则增葬则蚤葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 泽蚤皂责造藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 葬泽 葬 早藻灶藻则葬造 泽燥怎则糟藻
枣燥则 责燥造赠皂燥则责澡蚤糟 阅晕粤 皂葬则噪藻则泽援 晕怎糟造藻蚤糟 粤糟蚤凿泽 砸藻泽袁
员苑渊员远冤院 远源远猿 原 远源苑员援
再葬泽燥凿澡葬 砸袁 杂怎皂葬贼澡蚤 砸袁 悦澡藻扎澡蚤葬灶 孕袁 藻贼 葬造援 圆园园愿援 耘怎糟葬造赠责贼怎泽
皂蚤糟则燥泽葬贼藻造造蚤贼藻泽 皂蚤灶藻凿 蚤灶 泽蚤造蚤糟燥院 泽怎则增藻赠 葬灶凿 藻增葬造怎葬贼蚤燥灶援 允 郧藻灶藻贼袁
愿苑渊员冤院 圆员 原 圆缘援
渊责任编辑摇 徐摇 红冤
猿猿员