作 者 :周珊;虞方伯;郭明;单胜道;邸玉翠;徐少娟;李松华;郑圣丰
期 刊 :林业科学 2011年 47卷 9期 页码:114-118
关键词:竹炭 ;固定化 ;紫外诱变 ;假单胞菌 ;间甲酚 ;
Keywords:bamboo-carbon , immobilization , UV mutation , Pseudomonas sp. , m-cresol ,
摘 要 :
用紫外光对假单胞菌株进行诱变,以竹炭为载体,将紫外诱变假单胞菌固定在竹炭上,用竹炭固定化紫外诱变假单胞菌处理间甲酚水样。考察竹炭固定化紫外诱变假单胞菌投加量和水样pH值对间甲酚去除的影响以及进水浓度随反应时间的变化关系,研究竹炭固定化紫外诱变假单胞菌去除间甲酚的反应动力学。结果表明: 相对于原菌株,菌株经紫外诱变后,生长周期缩短了6 h。经紫外照射120 s的假单胞菌可以在竹炭表面及内部孔隙形成明显菌胶团,诱变菌在竹炭上所成的生物量明显较未经诱变菌增加。竹炭固定化紫外诱变假单胞菌能有效地去除水样中间甲酚。竹炭固定化紫外诱变假单胞菌投加量和水样pH值影响到间甲酚的去除效果,pH值在4~6时,间甲酚的去除效果较好。20 g竹炭固定化紫外诱变假单胞菌处理100 mL初始浓度50,100,120,150,180 mg·L-1 间甲酚模拟水样42 h,去除率依次为90.9%,76.4%,72.9%,64.6%和49.7%。竹炭固定化紫外诱变假单胞菌对间甲酚的去除能较好地符合零级反应方程。
Abstract:
Pseudomonas sp. was mutated by ultraviolet (UV). Then the UV mutated Pseudomonas sp. was immobilized on bamboo-carbon to investigate its effect in the removal of m -cresol. The effects of various parameters, such as amount of immobilized mutant Pseudomonas sp. and pH, on m -cresol removal were examined. Meanwhile, the m -cresol removal kinetics and the relationship between concentration and reaction time were obtained. The results show that compared with wild strain, the growth cycle of the strain which is treated by UV mutation is shortened by 6 h. Pseudomonas irradiated by UV for 120 s can form obvious zoogloea on the bamboo-carbon surface area and inner pore, and the biomass generated by the mutant on the bamboo-carbon is significantly larger than that by the wild strain. Parameters such as immobilized biomass and pH affect the removal of m -cresol. The removal effect is better with pH at the range of 4 to 6. When 20 g of bamboo-carbon immobilized UV mutated Pseudomonas sp. is used to treat 100 mL of simulated m -cresol water sample, with its initial concentration being 50, 100, 120, 150, 180 mg·L-1 , removal effect is respectively 90.9%,76.4%,72.9%,64.6% and 49.7% after 42 h and the removal of m -cresol follows zero-order kinetics.
全 文 :第 !" 卷 第 # 期 $ % & & 年 # 月 林 业 科 学 ’()*+,)- ’)./-* ’)+)(-* /012!"!+02# ’345!$ % & & 竹炭固定化紫外诱变假单胞菌处理 间甲酚废水的研究 周<珊<虞方伯<郭<明<单胜道<邸玉翠<徐少娟<李松华<郑圣丰 "浙江农林大学环境科技学院<临安 =&&=%%$ 摘<要!<用紫外光对假单胞菌株进行诱变!以竹炭为载体!将紫外诱变假单胞菌固定在竹炭上!用竹炭固定化紫 外诱变假单胞菌处理间甲酚水样% 考察竹炭固定化紫外诱变假单胞菌投加量和水样 4R值对间甲酚去除的影响以 及进水浓度随反应时间的变化关系!研究竹炭固定化紫外诱变假单胞菌去除间甲酚的反应动力学% 结果表明& 相 对于原菌株!菌株经紫外诱变后!生长周期缩短了 I D% 经紫外照射 &$% 9的假单胞菌可以在竹炭表面及内部孔隙 形成明显菌胶团!诱变菌在竹炭上所成的生物量明显较未经诱变菌增加% 竹炭固定化紫外诱变假单胞菌能有效地 去除水样中间甲酚% 竹炭固定化紫外诱变假单胞菌投加量和水样 4R值影响到间甲酚的去除效果!4R值在! GI 时!间甲酚的去除效果较好% $% T竹炭固定化紫外诱变假单胞菌处理 &%% E.初始浓度 C%!&%%!&$%!&C%! &H% ET’.F&间甲酚模拟水样 !$ D!去除率依次为 #%2#]!"I2!]!"$2#]!I!2I]和 !#2"]% 竹炭固定化紫外诱变 假单胞菌对间甲酚的去除能较好地符合零级反应方程% 关键词&<竹炭# 固定化# 紫外诱变# 假单胞菌# 间甲酚 中图分类号! ,q=C&* K"%=<<<文献标识码!-<<<文章编号!&%%& F"!HH"$%&%# F%&&! F%C 收稿日期& $%%# F&$ F$$# 修回日期& $%&% F%# F% 基金项目& 国家自然科学基金项目"$%H""%"$$ !浙江省科技厅项目"$%&%(==%"%$ !浙江省自然科学基金项目"U=&%%%&H$ % F-%’,&B’)5ZA/-"’Bc&"#-=-/+< :%%’+$B$I$(. fE80#-1 !&,/.%5%2(&"9@’(2&%+’’ZA&/+’( OD0L ’D67
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D% 然后将 接种斜面上的菌种!挑取一环接入 $C% E.装有 $% E.液 体 培 养 基 的 三 角 瓶 中% =% r 下 摇 床 "&"% B’EM7 F&$培养 &I D 后!离心!用生理盐水离心 洗涤 $ 次后加生理盐水至总体积 $% E.!再分别取 C E.菌液到 " 个直径 I WE的灭菌培养皿中!将培养 皿置于磁力搅拌器上!用紫外灯"&C e!灯距 $H WE$ 分别照射 %!&%!=%!I%!#%!&$% 和 &C% 9!然后将菌液 在黑暗条件下培养 &$ D% 液 体 培 养 基& +R!(1C%% ET’. F&! i$R>n! !%% ET’.F&! (6(1$ ’ $R$n C%% ET’. F&! ;T’n! C% ET’.F&! 3^’n!’"R$n &% ET’. F&!U369:*m:B6W: $%% ET’.F&% 液体培养基加入融化琼脂!制备斜面 培养基% &2!2$<细菌生长曲线的测定<筛选单个菌落接种 于 C% E.预先配置好的液体培养基中!=% r下振荡 "&"% B’EM7 F&$培养 $! D!然后取菌液!将其按照体 积 &y&%% 的接种量分别接种于 = 瓶 C% E.预先配置 好的液体培养基上!在相同条件下振荡培养!并分别 于培养 $!!!I!H!&%!&$!&!!&I!&H!$%!$$!$!!$I!$H! =% D 后取菌体培养悬液 &% E.!以未接种的原液体 培养基校正 "C$ 型紫外可见分光光度计的零点!在 波长 I%% 7E处测定菌液的 nQI%%值% 以菌液的吸光 度值"nQI%%$为纵坐标!以培养时间作为横坐标!绘 制假单胞菌的生长曲线"钱存柔等! $%%=$% C&& 林 业 科 学 !" 卷< &2!2=<假单胞菌的驯化<分别将紫外诱变后菌液( 未经诱变假单胞菌液灭菌后接入装有 C .上述液体 培养基的反应器中!在常温下曝气培养!曝气量控制 在%2$ +E=’D F&左右 "曝气量太大或太小都会影响 微生物的正常生长$% 当反应器底部出现污泥时! 开始投加间甲酚进行驯化% 第一次间甲酚的投加浓 度为 &% ET’.F&!然后间甲酚投加浓度逐步递增 至$%% ET’.F&% &2!2!<竹炭固定化菌的制备<以 C EE的竹炭"比 表 面 积 " 为 =IC E$’TF&! 孔 比 容 积 [4 为 %2=! E.’TF&$为载体!分别将未经诱变假单胞菌和 紫外诱变假单胞菌吸附固定在竹炭上!制得竹炭固 定化假单胞菌和竹炭固定化紫外诱变假单胞菌% 具 体制备方法见参考周珊等"$%%H$% &2!2C<竹炭固定化诱变假单胞菌对间甲酚的降 解<室温下!用竹炭固定化紫外诱变假单胞菌处 理 &%% E.初始浓度为&%% ET’.F&的间甲酚模拟 水样! 考 察 固 定 化 诱 变 菌 的 投 加 量 " &C! $%! $C T$ (4R" 约 $! !! I! H! &% $ 对 间 甲 酚 去 除 的影响% << 室温下!分别用 $% T竹炭固定化紫外诱变假单 胞菌处理不同初始浓度的间甲酚模拟水样 &%% E.! 定时取样!进行竹炭固定化紫外诱变假单胞菌去除 间甲酚的动力学研究% $<结果与分析 JK>?紫外光照射时间的影响 取经紫外光照射一定时间后的菌液 %2C E.!加 盐水稀释后!采用平板稀释计数法测定不同稀释度 下的平均菌落数!再根据平板稀释计数法规则选取 最合理的平均菌落数值乘以稀释倍数得假单胞菌总 数"陈声明等! $%%"# 张胜华! $%%C$% 从表 & 中可知& % G#% 9时菌落总数随着紫外灯 照射时间的增长而减少!#% G&$% 9时菌落总数趋于 稳定!&C% 9时菌落总数又开始减少% 因此!本试验范 围内假单胞菌紫外诱变的最佳照射时间为 &$% 9% 表 >?不同紫外照射时间下假单胞菌总数 5&+@>?!&,/.%5%2(&"9K7’B’(< (0%+-/0(1-/1$))-/-(#0B#/&,$’B-#/&1$$’(#$%- 照射时间 J68M6:M07 :ME3b9 不同稀释度的平均菌落数 (0107Z7LE[3B0V8MV3B37:8M1L:M07 &% F$ &% F= &% F! &% FC &% FI &% F" 菌落总数 ,0:61W0107Z 7LE[3Bb" (^ h’E.F& $ % 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z H"$ H% H2% a&%H &% 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z !$% C# "= C2# a&%" =% 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z #&= H$ C= " H2$ a&%I I% 无法计数 )7W61WL16[M1M:Z & $&% &!= &%C C ) &2! a&%I #% & HC% $%= &!" # ) ) $2% a&%C &$% HI% ="= $! && ) ) $2! a&%C &C% &C" $& = ) ) ) &2I a&%! JKJ?假单胞菌诱变前后生长曲线的比较 用紫外光照射假单胞菌 &$% 9!然后分别测定紫 外诱变菌株和未经过诱变菌株的生长曲线% 诱变菌株达到稳定生长期只要 $% D!比未经诱 变菌株的稳定生长期快了 I D"图 $$% 这表明& 菌 株经紫外诱变后!菌株生长繁殖的速度有了一定的 提高!有效缩短了菌株的生长周期% Q+-具有强烈 吸收紫外光的能力!尤其是核酸链上的碱基对!其中 嘧啶比嘌呤更敏感% 小剂量紫外线可引起 Q+-突 变!缩短育种时间"张胜华! $%%C$% JKL?竹炭固定化紫外诱变假单胞菌与竹炭固定化 假单胞菌扫描电镜图对比 将假单胞菌株用紫外诱变 &$% 9后!进行驯化! 驯化期内间甲酚投加浓度逐步递增至$%% ET’.F&! 图 $<假单胞菌诱变前后生长曲线 M^T5$0V!3.41%-%)03945 然后制得竹炭固定化紫外诱变假单胞菌% 相同条件 I&& <第 # 期 周<珊等& 竹炭固定化紫外诱变假单胞菌处理间甲酚废水的研究 下!将未经诱变假单胞菌驯化后制得竹炭固定化假 单胞菌% 图 = 为竹炭固定化紫外诱变假单胞菌与竹 炭固定化假单胞菌的扫描电镜图% 从电镜照片不难 看出!假单胞菌体能够耐受浓度小于$%% ET’.F&的 间甲酚!并在载体竹炭表面定殖(成膜% 未经紫外诱 变假单胞菌株在竹炭表面形成的菌胶团量明显少于 诱变菌"图 =6![$!未经紫外诱变假单胞菌株在竹炭 的内部孔隙仅形成一层薄薄的生物膜# 而诱变菌在 竹炭的内部孔隙!细胞间有胞外聚合物搭桥相连!细 胞紧密地聚合成絮凝状!形成明显菌胶团!诱变菌在 竹炭上所成的生物量明显较未经诱变菌对照增加 "图 =W!8$% 可以初步判定紫外诱变处理使得原始 菌株耐受间甲酚的能力得以强化% 理论上讲!菌体 着生于载体表面或其间!形成生物膜或絮状体会产 生更高的基因转移可能性!而这可能导致具有更高 降解效率的*结合+菌株产生"A099M3B./0&5! #I$% 此外!越来越多的研究表明菌体密度对实现某些生 理功能至关重要!如质粒的结合(转移等% 在菌体密 度超过一定的阀值后! 诸如群体感应 " SL0BLE 9379M7T! q’$一类的生理活动才能进行 " L^TL6./ 0&5! #!$% 图 =<扫描电镜照片" a& %%%$ M^T5=<’*;" a& %%%$ 62固定紫外诱变假单胞菌后竹炭表面 A6E[00@W6B[07 9LBV6W3 6V:3BMEE0[M1MfM7TEL:67:!3.41%-%)03942# [5固定假单胞菌后竹 炭表面 A6E[00@W6B[07 9LBV6W36V:3BMEE0[M1MfM7T!3.41%-%)03945# W5固定紫外诱变假单胞菌后竹炭内部孔隙 )773B40B30V[6E[00@ W6B[07 6V:3BMEE0[M1MfM7TEL:67:!3.41%-%)03945# 85固定假单胞 菌后竹炭内部孔隙 )773B40B30V[6E[00@W6B[07 6V:3BMEE0[M1MfM7T !3.41%-%)03945 JKM?反应条件对间甲酚降解的影响 室温下!分别向 &%% E.初始浓度为&%% ET’.F& 的间甲酚模拟水样中添加不同量的竹炭固定化紫外 诱变假单胞菌!不调节水样 4R值% 考察竹炭固定 化紫外诱变假单胞菌的投加量对间甲酚去除效果的 影响% 竹炭固定化紫外诱变假单胞菌的投加量影响到 间甲酚的去除% 当竹炭固定化紫外诱变假单胞菌的 投加量增至 $C T时!反应 $% D 后!间甲酚的去除率 反而低于投加量为 $% T时的"图 !$% 可见竹炭固 定化紫外诱变假单胞菌的投加量过大!会导致反应 到一定时间后!残余的间甲酚作为竹炭固定化紫外 诱变假单胞菌的碳源量不足!相对过剩的微生物对 营养的吸收利用产生了竞争!大量细胞会处于贫营 养状态!细胞活性降低!从而降低了降解效率% 本试 验!竹炭固定化紫外诱变假单胞菌的最适宜投加量 为 $% T!后续试验均采用该投加量% 图 !<竹炭固定化紫外诱变假单胞菌的 投加量对间甲酚去除的影响 M^T5!<*V3W:0V6E0L7:0V[6E[00@W6B[07 MEE0[M1Mf38 h/EL:6:38 !3.41%-%)0394507 -@WB3901B3E0Y61 图 C<4R对间甲酚去除的影响 M^T5C<*V3W:0V4R07 -@WB3901B3E0Y61 调节水样至不同 4R值!考察水样 4R值对竹炭 固定化紫外诱变假单胞菌对间甲酚去除的影响% 由 图 C 可以看出& 4R值对间甲酚的去除有明显影响% 4R值在 ! GI 时!竹炭固定化紫外诱变假单胞菌对 间甲酚的去除效果较好!4R大于或小于该范围!间 甲酚去除率明显降低% 这是因为微生物生长过程中 "&& 林 业 科 学 !" 卷< 机体内以酶促反应为主!4R值对酶促反应速率有显 著影响% 酶促反应存在的最适 4R值范围!4R值高 于或低于适宜范围时!酶和底物分子结合的有关基 团解离状态会发生改变!使酶的活性明显降低!微生 物代谢活力下降!影响到对有机物的降解能力 "陈 声明等! $%%"# 张胜华! $%%C$% JKN?动力学分析 室温下!分别用 $% T竹炭固定化紫外诱变假单 胞菌处理不同初始浓度的间甲酚模拟水样 &%% E.% 本试验范围内!间甲酚去除率随间甲酚浓度的增大而 减小% 间甲酚初始浓度为C% ET’.F&时!间甲酚去除 率最高!!$ D 后去除率可达 #%2#]!而初始浓度为 &H% ET’.F&的水样 !$ D 后去除率仅为 !#2"]% 当间 甲酚浓度"&C% ET’.F&时!间甲酚去除量随间甲酚浓 度增大而增大!!$ D 后最高可达 #2"% ET!间甲酚浓度 p&C% ET’.F&时则迅速降至 !2#" ET"图 I$% 图 I<不同初始浓度间甲酚的去除 M^T5I<-@(B3901B3E0Y61[Z901L:M0790V8MV3B37: M7M:M61W07W37:B6:M079 从表 $可以看出& 竹炭固定化紫外诱变假单胞菌 对间甲酚的去除能较好地符合零级反应方程% 当间甲 酚浓度"&C% ET’.F&时!间甲酚去除速率 U% 随间甲酚 浓度的增大而增加!间甲酚浓度 p&C% ET’.F&!速率常 数U% 明显降低% 说明过高的底物浓度在一定程度上 抑制了诱变假单胞菌对间甲酚的降解% 表 J?间甲酚去除的动力学方程 5&+@J?;$(-#$7-T0$’(’)5Z7/-"’B/-%’,&B 间甲酚初始 浓度 -@WB3901 W07W37:B6:M07 ?% b"ET’. F& $ 动力学回归方程 QZ76EMWB3TB399M07 3SL6:M07 反应速率常数 J36W:M07 B6:3W079:67: U% b"ET’. F& D F& $ , C% ?dF&2%HI/c!$2"&$ &2%HI %2#=H &%% ?dF$2&&=/c&%&2#$ $2&&= %2#"H &$% ?dF$2=%&/c&$!2%# $2=%& %2#HI &C% ?dF$2"&"/c&C%2$C $2"&" %2#IH &H% ?dF&2$%%/c&"&2C! &2$%% %2#&H =<结论 本试验范围内!紫外诱变可以提高假单胞菌株 的生长繁殖速度% 假单胞菌的最佳诱变时间为紫外 照射 &$% 9% 紫外诱变假单胞菌可在竹炭表面及内 部孔隙形成菌团!紫外诱变处理使得原始菌株耐受 间甲酚的能力得以强化% 水样 4R值和竹炭固定化 紫外诱变假单胞菌的投加量影响到间甲酚的去除效 果% &%% E.初始浓度为&%% ET’.F&的间甲酚水样 中竹炭固定化紫外诱变假单胞菌的投加量为 $% T 时最佳% 4R值在 ! GI 时!竹炭固定化紫外诱变假 单胞菌对间甲酚的去除效果较好!4R大于或小于该 范围!间甲酚去除率明显降低% 竹炭固定化紫外诱 变假单胞菌对间甲酚的去除能较好地符合零级反应 方程!间甲酚浓度大于&C% ET’.F&时!诱变假单胞菌 对间甲酚的降解受到抑制% 参 考 文 献 陈声明!张立欣5$%%"5微生物学研究技术5北京& 科学出版社5 钱存柔!黄仪秀5$%%=5微生物实验教程5$ 版5北京& 北京大学出 版社5 张胜华5$%%C5水处理微生物学5北京& 化学化工出版社5 周<珊!胡泽友!喻景权5$%%H5竹炭固定化假单胞菌处理含酚废水的 研究5高校化工学报! $$"C$ & HH# FH#!5 -:6T676R)5$%%!5AM083TB686:M07 0V4D3701! %@WB3901! -@WB3901678 C@ WB3901[ZM78MT370L990M1VL7TMM7 90M1W07:6EM76:38 XM:D WB3090:35 e0B18 j0LB7610V;MWB0[M010TZ678 AM0:3WD7010TZ! $% " H $ & HC& FHCI5 A3BT6L3B>! 0^7:3Z73>-! +016B8 +! ./0&5$%%C5AM083TB686:M07 0V 4D3701678 4D3701@B316:38 W0E40L789[Z49ZWDB04DM1MW678 W018@ :013B67:614M73Z369:95(D3E094D3B3! C#""$ & #%# F#&H5 A099M3B>! /3B9:B63:3e5#I5,BMTT3B9V0BEMWB0[M616TTB3T6:M07 M7 6W:MY6:38 91L8T35 -441M38 ;MWB0[M010TZ 678 AM0:3WD7010TZ! !C"& b$$ & & FI5 M^610Y-! A09WDk3 *! A13Z ,5 $%%!5J64M8 E07M:0BM7T 0V:D3 [M083TB686:M07 0V4D3701@1Mk3W0E40L789[Z:D3Z369:?0)1+10 -0&/%30 L9M7TAnQE369LB3E37:95)7:3B76:M0761AM083:3BM0B6:M07 678 AM083TB686:M07! C!"&$ & I# F"I5 L^TL6e(!eM7679’ (!PB337[3BT*>5#!5qL0BLE9379M7TM7 [6W:3BM6& :D3&4E2‘&4EVV6EM1Z0VW318379M:Z@B394079MY3:B679WBM4:M0761B3TL16:0B95 j0LB7610VA6W:3BM01! &"I"$$& $I# F$"C5 .M>j! e67TK! ’:6T7M:M^ ! ./0&5$%%C5Q3TB686:M07 0V4D3767@:DB373 678 4ZB373M7 91LBBZB36W:0B9XM:D MEE0[M1Mf38 [6W:3BM65%%7&%.0 945 *7YMB07E37:61*7TM733BM7T’WM37W3! $$"=$ & =#% F=##5 n16BML J)! i10:fA! A6B739)! ./0&5$%%$5^ ,@)J9:L8Z0V:D3BM7T@ B3:6M7M7T4B08LW:9VB0E:D3B36W:M07 0VnRB68MW619XM:D 4D3701!%‘! -‘!678 C@WB39015-:E09*7YMB07! =I"$$$ & =IHC F=I#"5 ’61E078 P>(! AZWB0V:Ae! ’:3X6B:P ’ -A! ./0&F#C5,D3 [6W:3BM61*37MTE6+ WB6WkM7T:D3W0830VW31@W31W0EEL7MW6:M075 ;013WL16B;MWB0[M010TZ! &I"!$ & I&C FI$!5 !责任编辑<石红青" H&&