全 文 ：第 50 卷 第 7 期
2 0 1 4 年 7 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 7
Jul．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140706
收稿日期: 2013 － 07 － 29; 修回日期: 2014 － 02 － 03。
基金项目: 国家“863”项目(2013AA102705) ; 国家自然科学基金项目(31170619) ; 教育部“新世纪优秀人才支持计划”; 江苏高校优势学
科建设工程资助项目(PAPD)。
* 陈金慧为通讯作者。
鹅掌楸属 SＲAP分子标记体系优化及遗传多样性分析*
赵亚琦1 成铁龙2 施季森1 王新民1 徐 阳1 刘伟东1 陈金慧1
(1．南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 南京 210037;
2．中国林业科学研究院科学技术处 北京 100091)
摘 要: 采用 L16 (4
5 )正交设计，对鹅掌楸属 SＲAP-PCＲ 反应的 5 个因素(Mg2 +、dNTPs、引物、Taq 酶和模板 DNA
浓度)在 4 个水平上进行优化试验，同时对 SＲAP 反应影响较大的 Mg2 +、Taq 酶、模板 DNA 浓度进行单因素分析。
建立鹅掌楸属植物 SＲAP-PCＲ 最适反应体系(20 μL)，反应条件为: Mg2 + 3. 0 mmol·L － 1，dNTPs 0. 3 mmol·L － 1，引物
浓度 0. 9 μmol·L － 1，Taq 酶 2. 0 μmol·min － 1，模板 DNA 90 ng，10 × PCＲ buffer 2 μL，不足部分以 ddH2O 补足。利用
优化的 SＲAP 体系对鹅掌楸属 10 个不同地理种源进行遗传多样性分析。筛选出 15 对条带清晰、多态性高的引物
共扩增出 182 个位点，其中 149 个为多态性位点，多态性比例为 81. 87%。应用 POPGEN 32 软件通过 UPGMA 法进
行聚类分析，从聚类图可以看出 10 个地理种源间的遗传距离及亲缘关系，表明 SＲAP 分子标记可以运用于鹅掌楸
属的遗传多样性研究。
关键词: 鹅掌楸属; SＲAP; 体系优化; 遗传多样性
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)07 － 0037 － 07
Optimization of a SＲAP-PCＲ System for Analysis of Genetic Diversity of Liriodendron
Zhao Yaqi1 Cheng Tielong2 Shi Jisen1 Wang Xinmin1 Xu Yang1 Liu Weidong1 Chen Jinhui1
(1 ． Key Laboratory of Forest Genetics and Biotechnology of Ministry of Education Nanjing Forestry University Nanjing 210037;
2 ． Science and Technology Department，CAF Beijing 100091)
Abstract: The SＲAP-PCＲ reaction system of Liriodendron was optimized with an orthogonal design to choose the most
proper concentrations of Mg2 +，dNTPs，primers，Taq polymerase and template DNA at four levels． The concentrations of
Mg2 +，Taq polymerase，template DNA were further fine-adjusted with a single-factor design． The optimized SＲAP-PCＲ
system ( total 20 μL ) was as follows: Mg2 + 3. 0 mmol·L － 1，dNTPs 0. 3 mmol·L － 1，primer 0. 9 μmol·L － 1，Taq
polymerase 2. 0 μmol·min － 1 and DNA template 90 ng，2 μL 10 × PCＲ buffer and ddH2O． With the system，genetic
diversity of 10 provenances of Liriodendron was analyzed． The results showed that，182 loci were generated from the 15
screened primer pairs， of which 149 loci were polymorphic． The percent of polymorphic loci was 81. 87% ． The
dendrogram of Liriodendron was constructed based on cluster analysis (UPGMA) with the Package of POPGEN 32． The
genetic distance and relative relationship of the 10 provenances of Liriodendron was shown by the dendrogram distinctly． It
indicated that SＲAP molecular marker could be widely used in genetic diversity analysis of Liriodendron．
Key words: Liriodendron; SＲAP; system optimization; genetic diversity
相 关 序 列 扩 增 多 态 性 ( sequence-related
amplified polymorphism，SＲAP)是一种基于 PCＲ 的
标记(Li et al．，2001)，该标记通过独特的双引物设
计对基因 OＲFs( open reading frames)的特定区域进
行扩增，上游引物对富含 GC 序列的外显子区域进
行特异性扩增，下游引物对富含 AT 序列的内含子、
启动子区域进行特异性扩增。因不同个体间乃至物
种间的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多
态性。相对于其他标记，SＲAP 标记具有简单、稳
定、得率中等、易测序、便于克隆等特点 ( Aneja et
al．，2012)，在各种植物的遗传研究中得到了广泛的
应用 ( Ferriol et al．，2003; Budak et al．，2004;
Esposito et al．，2007; 孙佳琦等，2010; 唐琴等，
2012)。
林 业 科 学 50 卷
鹅 掌 楸 属 ( Liriodendron ) 是 木 兰 科
(Magnoliaceae)古老属种植物，经第四纪冰期以后，
现仅存鹅掌楸 ( L． chinense ) 和北美鹅掌楸 ( L．
tulipifera)2 种。鹅掌楸曾经广泛分布于我国中南部
10 多个省(区)的丘陵山地和亚高山地带，以及越南
北部。由于大量的砍伐和人为破坏，现存的天然林
已少见，呈多地孤岛状零星分布。北美鹅掌楸现存
分布仍较广，在美国东部的 23 个州到加拿大安大略
省的大湖区呈连续分布。鹅掌楸属具有独特的分类
学地位，是研究系统进化、遗传多样性的理想材料。
近年来，针对鹅掌楸属植物开展了 ＲAPD，EST-SSＲ，
ISSＲ，SSＲ 等分子标记技术研究 (李周岐等，2002;
Xu et al．，2006; 张红莲等，2010; 占志勇等，2010;
Yang et al．，2012)，但有关鹅掌楸属的 SＲAP 分子标
记研究尚未见报道。本研究采用正交设计与单因素
分析的方法优化了鹅掌楸属植物 SＲAP-PCＲ 反应体
系，并利用筛选的引物对鹅掌楸和北美鹅掌楸的不
同地理种源，从分子水平上进行了遗传多样性水平
分析，对鹅掌楸属不同种源的遗传结构和亲缘关系
进行探讨，为进一步开展鹅掌楸属的种质创新和资
源的合理利用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
SＲAP-PCＲ 体系优化采用江西庐山种源材料。
遗传多样性分析选用了 5 个鹅掌楸地理种源(江西
庐山、福建武夷山、浙江松阳、浙江富阳、湖南桑植)
和 5 个北美鹅掌楸地理种源(密苏里、路易斯安娜、
佐治亚、北卡罗来纳、南卡罗来纳)。所有材料均采
自南京林业大学下蜀林场鹅掌楸种源试验林。选取
健康植株，采集其当年生鲜嫩叶储存于 － 80 ℃条件
下备用。本试验所用的 SＲAP 引物是从已公布的引
物( Li et al．，2001; 林忠旭等，2003; Ferriol et al．，
2003)中取正向引物和反向引物各 10 个(表 1)，共
100 对引物组合。
表 1 SＲAP 引物序列
Tab． 1 The primer sequences used in SＲAP analysis
编号
No．
正向引物
Forward primer 5→3
编号
No．
反向引物
Ｒeverse primer 5→3
Me1 TGAGTCCAAACCGGAAC Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me2 TGAGTCCAAACCGGACA Em2 GACTGCGTACGAATTATG
Me3 TGAGTCCAAACCGGACG Em3 GACTGCGTACGAATTCAT
Me4 TGAGTCCAAACCGGACT Em4 GACTGCGTACGAATTCCA
Me5 TGAGTCCAAACCGGAGA Em5 GACTGCGTACGAATTCGA
Me6 TGAGTCCAAACCGGAGG Em6 GACTGCGTACGAATTCTG
Me7 TGAGTCCAAACCGGTAA Em7 GACTGCGTACGAATTGAG
Me8 TGAGTCCAAACCGGTCC Em8 GACTGCGTACGAATTGCC
Me9 TGAGTCCAAACCGGTGT Em9 GACTGCGTACGAATTTAG
Me10 TGAGTCCAAACCGGTTG Em10 GACTGCGTACGAATTTCA
1. 2 基因组 DNA 提取
鹅掌楸属基因组 DNA 的提取采用 CTAB 法(罗
光佐等，2000)。经含溴化乙锭的 1% 的琼脂糖凝
胶电泳检测后用 NanoDrop-2000 分光光度计测定浓
度和质量，然后将部分 DNA 原液稀释至 30 ng·
μL － 1，－ 20 ℃保存备用。
1. 3 SＲAP 体系优化试验设计
以江西庐山种源鹅掌楸基因组 DNA 为模板，以
及经预试验表明能有效扩增的引物组合 Me2 /Em7
进行体系优化试验。优化试验采用正交设计(汪成
成等，2010)，选用 L16 (4
5 )正交表对影响反应结果
的 Mg2 +、dNTPs、引物、模板 DNA、Taq 酶等因素在 4
个水平上进行试验(表 2)。试验结果采用何正文等
(1998)的统计方法进行分析，同时对反应体系影响
较大的几个因素进行单因素分析。
PCＲ 扩增程序参考 Li 等 (2001)提出的 SＲAP
程序并略作修改: 94 ℃预变性 5 min; 前 4 个循环
为 94 ℃1 min，35 ℃1 min，72 ℃1 min; 随后进行的
29 个循环为 94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min;
最后 72 ℃延伸 8 min 并保存于 4 ℃。扩增反应产
物经 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后检测。
1. 4 SＲAP 引物组合筛选
使用 3 个不同地理种源的鹅掌楸属基因组
DNA 样品对 100 对引物组合通过优化过的反应体
系进行筛选，从中选取条带多、多态性好的引物组合
用于鹅掌楸属遗传多样性分析。
1. 5 遗传多样性分析
利用筛选出的引物在所建立的最佳反应体系下
对鹅掌楸属 10 个地理种源进行多样性分析。SＲAP
反应扩增出的图谱中每一条带的迁移位置记为 1 个
83
第 7 期 赵亚琦等: 鹅掌楸属 SＲAP 分子标记体系优化及遗传多样性分析
位点，相同迁移位置条带的有无分别记为 1 和 0，统
计 100 ～ 1 500 bp 区间的条带，形成 1 /0 矩阵。记录
结果采用 POPGEN 32 分析软件进行分析，建立聚类
树状图。
表 2 SＲAP-PCＲ 正交设计试验 L16 (4
5 )
Tab． 2 L16 (4
5 )orthogonal design for SＲAP-PCＲ
编号
No．
Mg2 + /
(mmol·L － 1 )
dNTPs /
(mmol·L － 1 )
引物
Primer /(μmol·L － 1 )
Taq 酶
Taq polymerase /(μmol·min － 1 )
模板 DNA
DNA template / ng
1 1. 25 0. 1 0. 3 0. 5 30
2 1. 25 0. 2 0. 5 1. 0 60
3 1. 25 0. 3 0. 7 1. 5 100
4 1. 25 0. 4 0. 9 2. 0 150
5 2. 50 0. 1 0. 5 1. 5 150
6 2. 50 0. 2 0. 3 2. 0 100
7 2. 50 0. 3 0. 9 0. 5 60
8 2. 50 0. 4 0. 7 1. 0 30
9 3. 75 0. 1 0. 7 2. 0 60
10 3. 75 0. 2 0. 9 1. 5 30
11 3. 75 0. 3 0. 3 1. 0 150
12 3. 75 0. 4 0. 5 0. 5 100
13 5. 00 0. 1 0. 9 1. 0 100
14 5. 00 0. 2 0. 7 0. 5 150
15 5. 00 0. 3 0. 5 2. 0 30
16 5. 00 0. 4 0. 3 1. 5 60
2 结果与分析
2. 1 鹅掌楸属植物 SＲAP-PCＲ 体系的优化
2. 1. 1 SＲAP-PCＲ 反应正交试验结果 引物组合
Me2 /Em7 对江西庐山种源鹅掌楸的正交试验 PCＲ
产物电泳结果如图 1 所示。按条带数量、清晰度及
背景对 PCＲ 结果从低到高打分。条带模糊或者无
条带的计 1 分，按顺序依次增加 1 分，分数越高，扩
增效果越好。分别独立统计 2 次重复试验的分数依
次为: 5，9，8，1，6，7，16，12，11，10，13，15，14，2，4，
3; 以及 4，7，8，1，6，7，16，11，12，10，14，15，13，2，
3，5。
根据打分结果统计出相同因素同一水平下的试
验值之和 Ki，并求出相同因素不同水平间平均值的
极差 Ｒ，根据每一因素同一水平下的试验值之和 K，
对反应体系组合选优。K 值越大，反应水平越好，反
之则越差。Ｒ 值的大小决定反应因素对反应体系影
响的大小。由表 3 可知，5 个因素中，Mg2 +影响程度
最大，其次为 Taq 酶、模板 DNA、dNTPs 引物。最优
组合与最高分值的 7 号组合相近，但是 Mg2 +、Taq
酶和模板 DNA 浓度等因素与其不匹配且影响程度
较高，所以有必要对 Mg2 +、Taq 酶和模板 DNA 浓度
进行单因素分析。单因素分析同样以江西庐山种源
鹅掌楸基因组 DNA 为模板和 Me2 /Em7 引物组合
进行。
图 1 引物 Me2 /Em7 对江西庐山种源鹅掌楸基因组
DNA 的 SＲAP 正交试验 PCＲ 产物电泳结果
Fig． 1 Electrophoresis result showing SＲAP-PCＲ orthogonal
experiment products from L． chinense genomic DNA of Lushan，
Jiangxi provenance with primer combination Me2 and Em7
M: 50 bp DNA Ladder; 泳道 1 － 16 分别与表 2 编号相对应
Lane code for 1 to 16 is corresponding with Tab． 2．
表 3 正交设计结果直观分析①
Tab． 3 The results of orthogonal design and visual analysis
结果
Ｒesults Mg
2 + dNTPs 引物
Primer
Taq 酶
Taq polymerase
模板 DNA
DNA template
K1 21. 50 35. 50 29. 00 37. 50 29. 50
K2 40. 50 27. 00 32. 50 46. 50 39. 50
K3 50. 00 41. 00 33. 00 28. 00 43. 50
K4 23. 00 31. 50 40. 50 23. 00 22. 50
k1 5. 38 8. 88 7. 25 9. 38 7. 38
k2 10. 13 6. 75 8. 13 11. 63 9. 88
k3 12. 50 10. 25 8. 25 7. 00 10. 88
k4 5. 75 7. 88 10. 13 5. 75 5. 63
Ｒ 7. 13 3. 50 2. 88 5. 88 5. 25
①Ki: 每一因素同一水平下的试验值之和; ki: 均值; Ｒ: 极差。
Ki: The level of each factor under the same experimental values; ki:
Average values; Ｒ: Ｒange values．
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林 业 科 学 50 卷
2. 1. 2 SＲAP-PCＲ 反应单因素分析 1) Mg2 +浓度
对反应体系的影响 由图 2 可以看出，当 Mg2 +浓度
为 1. 25 ～ 1. 75 mmol·L － 1时，扩增出的条带较少; 随
着浓度的升高，条带逐渐清晰; Mg2 +浓度为 2. 75 ～
3. 50 mmol·L － 1时，扩增条带丰富且清晰。综合稳定
性和经济考虑，反应体系中 Mg2 + 浓度确定为 3. 00
mmol·L － 1。
图 2 Mg2 +浓度对 SＲAP-PCＲ 反应的影响
Fig． 2 The effect of Mg2 + concentration on
SＲAP-PCＲ reaction systems
M: 50 bp DNA Ladder; 1 － 12: Mg2 + 浓度分别为 1. 25，1. 50，
1. 75，2. 00，2. 25，2. 50，2. 75，3. 00，3. 25，3. 50，3. 75，4. 00
mmol·L － 1 The concentrations of Mg2 + were 1. 25，1. 50，1. 75，2. 00，
2. 25，2. 50，2. 75，3. 00，3. 25，3. 50，3. 75，4. 00 mmol·L － 1 ．
2) Taq 酶浓度对反应体系的影响 由图 3 可
知，Taq 酶浓度在 0. 5 μmol·min － 1 和 1. 0 μmol·
min － 1时扩增出的条带较弱，在 1. 5 ～ 2. 5 μmol·
min － 1时能扩增出清晰稳定的条带，在 3. 0 μmol·
min － 1以上时背景逐渐加深且非特异性位点增多，所
以选择 2. 0 μmol·min － 1作为最佳 Taq 酶浓度。
3) 模板 DNA 对反应体系的影响 由图 4 可
知，模板 DNA 量在 45 ～ 135 ng 时均能扩增出丰富
稳定的条带，但是浓度过低或过高时，扩增出的条带
不清晰。通过比较发现，模板 DNA 浓度为 90 ng 时
条带最佳，所以选择 90 ng 作为反应体系的模板
DNA 量。
2. 2 鹅掌楸属植物遗传多样性分析
2. 2. 1 引物筛选 利用优化的 SＲAP-PCＲ 反应体
系，对合成的 100 对引物进行了筛选，53 对引物在 3
个鹅掌楸属地理种源样品上能扩增出条带。选取其
中 15 对扩增片段多、亮度大、重复性好的引物，用
于遗传多样性分析(部分扩增结果见图 5)。
2. 2. 2 PCＲ 扩增结果 用 15 对引物对 10 个鹅掌
楸属地理种源样品进行扩增，共得到 182 个位点
图 3 Taq 酶浓度对 SＲAP-PCＲ 反应的影响
Fig． 3 The effect of Taq polymerase on SＲAP-PCＲ reaction systems
M: 50 bp DNA Ladder; 1 － 12: Taq 酶浓度分别为 0. 5，1. 0，1. 5，
2. 0，2. 5，3. 0，3. 5，4. 0，4. 5，5. 0，5. 5，6. 0 μmol·min － 1 The
Taq polymerase were 0. 5，1. 0，1. 5，2. 0，2. 5，3. 0，3. 5，4. 0，4. 5，
5. 0，5. 5，6. 0 μmol·min － 1 ．
图 4 模板 DNA 浓度对 SＲAP-PCＲ 反应的影响
Fig． 4 The effect of template DNA on SＲAP-PCＲ reaction systems
M: 50 bp DNA Ladder; 1 － 11: 模板 DNA 量分别为 15，30，45，60，
75，90，105，120，135，150，165 ng The template DNA were 15，
30，45，60，75，90，105，120，135，150，165 ng．
(表 4)，其中有 149 个为多态性位点，多态性比例达
81. 87%。引物组合 Me8 /Em8 多态位点最多，为 13
个; 而引物组合 Me1 /Em7 的多态位点最少，为 6
个。平均位点数为 12. 13 个，平均多态位点数为
9. 90 个。所以选择的 SＲAP 引物在鹅掌楸属植物
上多态性丰富，能够进行遗传多样性分析。
2. 2. 3 遗传多样性水平 鹅掌楸属物种水平上的
等位基因数、有效等位基因数、Nei’s(1973)基因多
样度、Shannon 信息指数分别为 1. 818 7，1. 533 3，
0. 309 0 和 0. 457 3。鹅掌楸和北美鹅掌楸的遗传多
样性水平见表 5。鹅掌楸的遗传多样性各度量值均
值略高于北美鹅掌楸，但二者相差不大。这说明，鹅
掌楸和北美鹅掌楸都具有一定的遗传多样性水平。
2. 2. 4 聚类分析 采用 UPGMA 法对鹅掌楸属植
04
第 7 期 赵亚琦等: 鹅掌楸属 SＲAP 分子标记体系优化及遗传多样性分析
图 5 引物组合 Me5 /Em4(A) 和 Me10 /Em6(B)
在鹅掌楸属植物样品中的扩增结果
Fig． 5 Ｒesult of PCＲ amplification by SＲAP primer combination
Me5 /Em4(A) and Me10 /Em6(B) in samples of Liriodendron
M: 50 bp DNA Ladder; A1 － A10 ( B1 － B10) : 密苏里 Missouri，
USA; 路易斯安娜 Louisiana，USA; 佐治亚 Georgia，USA; 北卡罗
来纳 North Carolina，USA; 南卡罗来纳 South Carolina，USA; 江
西庐山 Lushan，Jiangxi; 浙江松阳 Songyang，Zhejiang; 福建武夷
山 Wuyishan，Fujian; 浙江富阳 Fuyang，Zhejiang; 湖南桑植
Sangzhi，Hunan．
物的不同地理种源利用获得的 SＲAP 多态标记进行
聚类分析(图 6)。从聚类图可知，鹅掌楸属 10 个地
理种源可分为 2 个聚类群: 一个类群是来源于我国
5 个地区的鹅掌楸;另一个类群是来源于美国密苏
里、路易斯安娜、南卡罗来纳、佐治亚和北卡罗来纳
的北美鹅掌楸。
表 4 不同引物组合扩增位点数和多态位点数
Tab． 4 Numbers of loci amplified and polymorphic
sites with different primer combinations
引物组合
Primer
combination
位点总数
Number
of loci
多态位点数
Number of
polymorphic loci
多态比例
Frequency of
polymorphic loci(% )
Me7 /Em1 12 11 91. 67
Me7 /Em3 13 10 76. 92
Me8 /Em7 15 12 80. 00
Me8 /Em8 16 13 81. 25
Me8 /Em10 12 11 91. 67
Me6 /Em6 13 11 84. 62
Me6 /Em5 11 10 90. 91
Me6 /Em4 10 7 70. 00
Me6 /Em7 11 8 72. 73
Me1 /Em7 11 6 54. 55
Me3 /Em3 11 9 81. 82
Me5 /Em1 13 11 84. 62
Me5 /Em4 14 12 85. 71
Me10 /Em6 11 9 81. 82
Me10 /Em5 9 9 100. 00
均值 Mean 12. 13 9. 90 81. 87
表 5 北美鹅掌楸和鹅掌楸遗传多样性各度量均值
Tab． 5 The mean parameters of genetic diversity of L． chinense and L． tulipifera
种
Species
等位基因数
Observed number of alleles
有效等位基因数
Effective number of alleles
Nei’s (1973)基因多样度
Nei’s (1973) gene diversity
Shannon信息指数
Shannon’s information index
鹅掌楸 Liriodendron chinense 1. 615 4 1. 457 8 0. 252 1 0. 365 5
北美鹅掌楸 Liriodendron tulipifera 1. 547 4 1. 412 3 0. 227 5 0. 329 3
图 6 鹅掌楸属 10 个不同地理种源的遗传距离聚类
Fig． 6 Dendrogram of genetic distance for 10 provenances of Liriodendron
14
林 业 科 学 50 卷
3 讨论
3. 1 鹅掌楸属 SＲAP-PCＲ 优化体系的建立
影响 SＲAP-PCＲ 反应的因素有很多，物种间的
差异以及各反应因素之间相互作用，使得在不同因
素水平间的扩增结果具有明显区别 (谭碧玥等，
2009)，所以建立一个最优的 PCＲ 反应体系是获得
高效、稳定的分子标记的前提。正交试验设计在
PCＲ 反应体系优化中的运用，可以发挥高效、经济、
直观的特点，但由于正交试验设计的试验水平较少，
通常不易找到最佳的试验组合(陈万胜等，2008);
单因素分析方法设置的试验水平较多，但是试验程
序较繁琐，忽视了各因素间的相互影响(陈海霞等，
2011)。2 种方法都难以快速独立地找出 PCＲ 反应
的最佳体系，所以正交设计与单因素分析相结合在
SＲAP-PCＲ 反应体系优化试验设计中是一种较好的
方法。
在反应体系中 Mg2 + 浓度变化对 SＲAP 条带影
响较大。Mg2 +浓度过高会产生非特异扩增，杂带较
多; 浓度过低会影响 Taq 酶的活性，降低引物与模
板的结合效率，扩增产物减少，条带较弱 (梁景霞
等，2005 )。本研究中，Mg2 + 浓度在 2. 75 ～ 3. 50
mmol·L － 1范围内，随着 Mg2 +用量的增多，条带逐渐
清晰丰富。反应体系中 Taq 酶用量过高会产生大量
非特异性条带且背景过深不利于读带; 用量过低则
扩增产物的产量较低且背景太淡(赵杨等，2012)。
本研究中，Taq 酶浓度在 1. 5 μmol·min － 1以下时扩
增出的条带很弱; 在 1. 5 ～ 2. 5 μmol·min － 1时能扩
增出清晰稳定的条带; 在 3. 0 μmol·min － 1以上时背
景逐渐加深且非特异性位点增多。而模板 DNA 浓
度对 PCＲ 反应扩增的结果有一定的影响，但是通常
有较宽的适用范围(李娟玲等，2011)。本研究中，
模板 DNA 量在 45 ～ 135 ng 时均能扩增出丰富稳定
的条带。综合各方面因素，最终确定了扩增产物多、
带型清晰、重复性好的鹅掌楸属 SＲAP-PCＲ 反应体
系: Mg2 + 3. 0 mmol·L － 1，dNTPs 0. 3 mmol·L － 1，引物
0. 9 μmol·L － 1，Taq 酶 2. 0 μmol·min － 1，模板 DNA 90
ng，10 × PCＲ buffer 2 μL，不足部分以 ddH2O 补足。
3. 2 鹅掌楸属遗传多样性分析
鹅掌楸属的 SＲAP 分子标记分析表明，鹅掌楸
属多态性比率为 81. 87%，高于红花 ( Carthamus
tinctorius) (江 磊 等，2013 )、蒜 ( Allium sativum )
(Chen et al．，2013)、红麻(Hibiscus cannabinus) (Xu
et al．，2013 ) 等 SＲAP 多态性比率，同时也高于
ＲAPD(李周歧等，2002; 李建民等，2002 )、EST-
SSＲ(胥猛等，2008)等分子标记对鹅掌楸、北美鹅
掌楸、杂交鹅掌楸的多态性比率。说明 SＲAP 分子
标记在鹅掌楸属植物具有较高的遗传多样性水平，
可以运用于鹅掌楸属的遗传多样性研究。
鹅掌楸和北美鹅掌楸的 Shannon 信息指数分别
为 0. 365 5 和 0. 329 3，说明鹅掌楸地理种源间的变
异略高于北美鹅掌楸。北美鹅掌楸在美国东南部成
片分布、数量众多，可能使得其种群内的遗传变异程
度较高，种群间的遗传分化程度相对较低。而在我
国，鹅掌楸分布星散，依照地理区域可划分为“一带
五岛”的分布形式，反映了一个走向濒危的物种在
数量上的减少过程(郝日明等，1995)。这种生境片
断化、距离隔离以及种群数量减少的分布情况有可
能造成鹅掌楸较高的种群间遗传分化程度。这与李
建民等(2002)得出的鹅掌楸种群内的遗传变异程
度降低、而种群间的遗传分化程度加大的研究结论
相符。保护一个具有复杂遗传结构的濒危物种，需
要阐明不同种源间的遗传关系(朱晓琴等，1997)。
SＲAP 分子标记有助于鹅掌楸属不同种源间遗传关
系的研究。
SＲAP 标记的聚类分析表明，鹅掌楸属的 10 个
不同地理种源可以聚成北美鹅掌楸和鹅掌楸 2 大
类。与罗光佐等 (2000)用 ＲAPD 标记的聚类结果
不同，SＲAP 标记的聚类可以很好地将鹅掌楸与北
美鹅掌楸区分开。SＲAP 标记对基因的重要组成部
分 OＲFs 进行扩增，而基因的多样性更能反映遗传
资源的多样性(林忠旭等，2004)。这体现了 SＲAP
分子标记在鹅掌楸属植物遗传多样性研究中的优越
性和有效性，本研究为 SＲAP 分子标记在鹅掌楸属
植物的进一步应用奠定了良好的基础。
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(责任编辑 徐 红)
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