全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % # % 年 # 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01 !"，*/1 #
2345，$ % # %
梨 ! 个 !"##$!基因的分离及遗传多态性分析
乌云塔娜#，$ 6 李洪果# 6 李振国7 6 包梅荣# 6 谭晓风#，$
（#5中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 6 长沙 !#%%%!；
$1 中南林业科技大学林学院 6 长沙 !#%%%!；71 内蒙古克什克腾旗林业局黄冈梁林场 6 克什克腾旗 %$878%）
关键词：6 梨属；自交不亲和性；!"## 9 !基因
中图分类号：&:#;5 !"；<=!75 $6 6 6 文献标识码：,6 6 6 文章编号：#%%# 9 :!;;（$%#%）%# 9 %#!: 9 %8
收稿日期：$%%; 9 #% 9 %"。
基金项目：湖南省科学研究项目（#%# 9 !8;"）；湖南省科技计划项目（8%#!）；教育部科学技术研究重点项目；国家公益性行业科研专项
（$%%=%!%!=）。
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35"&0%,&：6 G@ ?LA4C M’NOP3LFQ R/0FS?03I RFTE/Q，K/?I 4FU VF3I !"##0! CF4FL UFIF AL/03TFQ KI/R ; VF3I S?0TAW3IL X4/U4
3L &OCF4/T@VFL5 -F4CTE /K M’N VI/Q?STL KI/R FACET VF3I S?0TAW3IL U3L 3I/?4Q # $%% PV5 &FY?F4SA4C TEF LVFSAKAS M’N
KI3CRF4TL IFWF30FQ K/?I 4FU !"##0! CF4FL TE3T UFIF IFLVFSTAWF0@ 43RFQ 3L !"###" 0!（)Z!$$=8"），!"###:O!（)Z!$$=8:），
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P/\ IFCA/4 34Q W3IA3P0F IFCA/4 #，34Q 0/UFI A4 W3IA3P0F IFCA/4 $ T/ !1 ME@0/CF4FTAS 3430@LAL LE/UFQ TE3T TEFIF U3L 3 EACE
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6+. 7#0)"：6 4&+53 ；LF0KOA4S/RV3TAPA0AT@；!"##0!CF4F
6 6 茄科（ &/0343SF3F）、芸苔属（ #+(3396(）、蔷薇科
（N/L3SF3F）植物多数属于配子体自交不亲和型，即
雌蕊和花粉自交不亲和基因的产物相互作用而控制
自交亲和性的发生。$% 世纪 =% 年代分离鉴定了雌
蕊自交不亲和基因及编码产物（ +3/ %, (;5，#==:；
ZLEA]AR3 %, (;5，#==;），而近几年才分离鉴定花粉自
交不亲和基因，配子体自交不亲和植物的花粉自交
不亲和基因具有 [OP/\ 基因的特点。如茄科植物中
&-[（& 0/S?L [OP/\ CF4F）基因控制花粉自交不亲和
特异性状（HS’0?IF %, (;5，$%%"）；蔷薇科核果类自
交不亲和基因和自交亲和基因的研究中提出了核果
类花粉自交不亲和基因为 &[G（ & E3V0/T@VFLVFSAKAS
[OP/\ CF4F ）基 因 （ &/44FWF0Q %, (;5， $%%8；
&?TEFI034Q %, (;5，$%%;）；仁果类果树苹果（E(;53 ^
2*8%3,96(）和日本沙梨（4&+53 F&+9-*;9(）中也已分离
鉴定了控制花粉的自交不亲和基因———& 0/S?L [O
P/\ PI/TEFIL（!"##）（&3LL3 %, (;5，$%%:；BAI/@?XA %,
(;5，$%%:； &?IP34/WLXA %, (;5，$%%:）。日本沙梨
!"## 基因的克隆过程中发现，在 & 位点上 [OP/\ 基
因存在很高的遗传多态性，在 # 个 & 位点上存在 7
个基因 3，P，!，且连锁在 &ON*3LF 的两侧（ &3LL3 %,
(;5，$%%:；BAI/@?XA %, (;5，$%%:）。但目前尚未清楚
哪些是假基因，哪些真正决定梨自交不亲和性的发
生。这为梨 !"## 基因的功能研究和梨自交不亲和
机制研究带来了很大的困难。我国梨资源丰富，但
中国梨属（4&+53）植物的花粉自交不亲和基因分离
鉴定少见报道。本文通过特异性 M’N 扩增、目的片
段的克隆测序及生物信息学分析方法分离克隆中国
沙梨（4A F&+9-*;9(）和新疆梨（4A 39/C9(/@%/393）的花
粉自交不亲和基因，并进行遗传多态性分析，为梨花
粉 !"## 基因的功能研究、中国梨自交不亲和机制
研究以及遗传改良提供基础。
林 业 科 学 !" 卷 #
!" 材料与方法
$% $# 试验材料 # $）植物材料 # 中国沙梨品种‘黄
冠’、‘壁山二号’、‘新雅’、‘雅青’、‘早美酥’、‘中
梨一号’和新疆梨品种‘早熟句句’、‘魁克句句’采
集于中国农业科学院郑州果树研究所。每个品种采
集叶片 & ’ 左右，保存于 ( )* +备用。
&）,-. 引物 # 利用梨 !"## 基因的保守区
/01 序列，设计合成较特异的 !"## 基因扩增引物
（引物的位置见图 $），引物由上海生工生物技术有
限 公 司 合 成。 ,$：2345656561166-16565-16
55473；,&：23465511-5666---6-11-6-473。
图 $# 梨的 !"## 基因一级结构及引物位置
89’: $# 6;< =>?@A>@?< BCD E?9F9GC GH EI$ ( I!：可变区 IB?9BJK< ?<’9GC；,$，,&：引物 ,?9F7）药品试剂 # 总 /01 提取试剂盒购自北京三
博远志生物技术有限责任公司；! ( 巯基乙醇、6?9=
购自上海生工生物技术公司；$** JE /01 LBDDEM/$)46 载体购自大连宝生物工程公司；,-.
MB=> 和 5 购自北京天根生
物技术有限责任公司。/Q" 大肠杆菌（ $%&’()*&’*+
&,-*）由中南林业科技大学国家林业局经济林育种与
栽培重点实验室保存。其他生化试剂和常规试剂均
为超纯或分析纯。
$% &# 试验方法 # $）梨叶片 /01 的提取、纯度浓度
测定 # 叶片 /01 的提取参照北京三博远志生物技
术有限责任公司总 /01 提取试剂盒的说明书进行；
纯度浓度测定采用 /R S "!* 核酸蛋白分析仪。
&）,-. 扩增反应体系和循环条件 # 参考 ,-.
MB=> 的说明书，稍做改动（反应体系中 M9N
为说明书推荐的 $ T &）。
7）回收克隆 # 目的片段的回收和克隆分别依
5 和 EM/$)46 载体的说明书进行。
!）/01 序列测定 # 由于 ,-. 产物中存在 & 个
等位基因的扩增片段，故回收克隆后随机挑选 $* 个
单菌落进行 /01 双向测序，委托上海生工生物技术
有限责任公司完成。
2）/01 序列分析 # 用 /01U>B? 软件将双向测
序 /01 序列拼接后，与 5序列进行比较分析，用 -K@=>BK X 软件对相应的氨基
酸序列进行分析，用 M<’B& 软件的 R,5M1 法构建
系统进化树。
#" 结果与分析
&% $# !"##.!基因特异性引物 ,-. 分离 # 用 !"##.!
基因的特异性引物对‘黄冠’等 ) 个梨品种的基因
组 /01 进行 ,-. 扩增，均扩增出 $ 条 $ &2* JE 左
右的条带（图 &）。
图 &# !"##.!基因的 ,-. 扩增
89’: &# ,-. GH >;< !"##.!
$ ( ":沙梨 /0 12)*3,-*+0 $:‘黄冠’‘Q@BC’’@BC’；&:‘壁山二
号’‘V9=;BC‘早美酥’‘\BGF<9=@’；":‘中梨一号’‘ \;GC’K9[9;BG’: ]，): 新
疆梨 /0 %*45*+46(4%*%0 ]:‘早熟句句’‘\BG=;@^@^@’；):‘魁克句
句’‘O@9W<^@^@’:
&% &# 梨新 !"##.!基因的分离 # ‘黄冠’和‘壁山二
号’的 U 基因型均为 U! U$"（乌云塔娜等，&**]）。对
‘黄冠’和‘壁山二号’的 !"## 基因进行克隆后分
别挑选了 $* 个单克隆进行测序。结果表明，‘黄
冠’的 $ 个 !"## 基因序列和‘壁山二号’的 $ 个
!"## 基因序列相似性达 $**_，且与 !"##! .!基因
（1V&]*]‘‘）在 /01 序列上具有 $& JE 的差异，在
推导氨基酸序列上具有 7 个氨 基 酸 的 差 异。
5因与 !"##$&B.!基因（aR*)$)‘*）的相似性最高，但在
/01 序列上具有 ] 个碱基的差异，推导氨基酸序列
上具有 ! 个氨基酸的差异。因此，将该基因命名为
!"##$" .!基因（aR!&&‘2"）。
‘新雅’和‘雅青’的 U 基因型均为 U! U$]（乌云
塔娜等，&**]）。克隆片段的测序结果表明，‘新雅’
的 2 个单克隆和‘雅青’的 7 个单克隆的 /01 序列
完全一致，属于同一个基因片段，而且这些基因的
/01 片段与 !"##! .!基因（1V&]*]‘‘）有 $& 个碱基
和 7 个氨基酸的差异。进一步比对分析表明，该基
因与 5似性最高，但在 /01 序列上具有 ) 个碱基的差异，
推导氨基酸序列上具有 & 个氨基酸的差异。因此，
将该基因命名为 !"##$]4!基因（aR!&&‘2]）。
新疆梨品种‘早熟句句’和‘魁克句句’的 U 基
因型均为 U&& U&)（待发表）。分别挑选 $* 个单克隆
进行测序，结果表明，‘早熟句句’的 $ 个单克隆和
‘魁克句句’的 & 个单克隆的 /01 序列完全一致，
属于同一个基因片段，而且该基因的 /01 序列与
)!$
! 第 " 期 乌云塔娜等：梨 # 个 !"##$!基因的分离及遗传多态性分析
!"##$$%!基因（&’()"))*）在 +,- 序列和推导氨基
酸序列上分别有 .( /0 和 "" 个氨基酸的差异。与
其他 !"## 基 因 的 比 对 分 析 表 明，该 基 因 与
1234536 中的 !"##".%!基因（&’()")78）的相似性最
高，但在 +,- 序列上具有 "* 碱基的差异，推导氨基
酸序列上具有 ) 个氨基酸的差异。故将该基因命名
为 !"##$)%!基因（&’#$$79(）。
‘早美酥’和‘中梨一号’的 : 基因型分别为
! ! !
图 .! 梨的 :;44 基因的氨基酸序列的比对
;<=> .! -?<=3@23A BC 0DA5A直线 422?<32：;%4BI；双线 JK2E2?：L">
沙梨 %* +&’,-./,0! !"##"：-4$7*7..；!"##$：-4$7*7.#；!"##.：-4$7*7.8；!"###：-4$*(*77；!"##8：-4$*()($；
!"##9：-4$7*7.9；!"##*：-4$7*7.*；!"##)：-4$7*7.)；!"##7：-4$7*7.7> 白梨 %* 1’23)4562,72’,! !"##"$5：&’()")7(；
!"##".：&’()")78；!"##"8：&’()")7.；!"##"9：&’#$$789；!"##"*：&’#$$78*；!"##")：&’()")79；
!"##.8：&’#$$78)> 新疆梨 %* ),68,06926),)! !"##$$：&’()"))*；!"##$)：&’#$$78)>
下同。MN2 H5@2 /2?BO>
7#"
林 业 科 学 !" 卷 #
$% $%&和 $! $%&（乌云塔娜，’(()）。‘早美酥’的 *( 个
单克隆的测序结果表明，其中 ! 个克隆的 +,- 序列
与 !"##%.!基因有差异，在 +,- 和推导氨基酸上分
别相差 *) /0 和 1 个氨基酸；‘中梨一号’的 *( 个
克隆的测序结果表明，其中 " 个克隆与 !"##!.!基因
有差异，在 +,- 和氨基酸序列上分别有 ’& /0 和 2
个氨基酸的差异；而‘早美酥’和‘中梨一号’中与
!"##%.!基因和 !"##!.!基因有差异的片段的序列相
似性达 *((3，属于同一个基因。进一步分析表明，
该基因与 4567869 中的 !"##*%8.!基因（:;(2*21&）
的相似性最高，但在 +,- 序列上具有 " 个碱基的差
异，推导氨基酸序列上具有 ’ 个氨基酸的差异。因
此，将它命名为 !"##%&.!基因（:;!’’1&2）。
’< %# 梨 !"## .!基因的推导氨基酸序列分析 # 梨
!"## .!基因推导氨基酸序列比对见图 %。!"## .!基
因由 * 个 =.7>? 区域、! 个可变区（@*，@’，@%，@!）
组成（$8AA8 $% &’(，’(()）。=.7>? 区域在 B * C B *&(
/0 间，氨 基 酸 序 列 是 从“ D$E@ F DG F H:”到
“=@-IJK”。在这个区域中，不同 !"## 基因的变
异较多，具有 ) 个氨基酸序列产生突变。其中新分
离的 !"##*".!基因和 !"##*).!基因中‘ $’（第 ) 个）
被‘4’替换；第 *( 个氨基酸，!"##*".!基因为‘L’而
!"##*).!基因为‘K’；!"##’2.!基因中‘@’（第 ! 个）
被‘D’替换、‘D’（第 *! 个）被‘I’替换；!"##%&.!
基因中‘$’（第 ) 个）被‘ M’替换。
可变区 @*（图 % 的双线部分）中 !"##*".!基因和
!"##*).!基因未发生突变，而 !"##’2.!基因和 !"##%&.!基
因发生氨基酸的替换，即‘M’（第 *("）被‘,’替换，‘4’
（第 **%）被‘+’或‘,’替换。可变区 @’、可变区 @%、可
变区 @! 中 !"##*".!、!"##*).!、!"##’2.!和 !"##%&.!基因
均未发生氨基酸的替换（图省略）。
’< !# 梨花粉 !"## 基因的聚类分析 # 梨 !"## .!基
因在推导氨基酸序列上的差异见表 *。可看出，不
同的 !"## .!基因间差异不大，只有 * C *’ 个氨基酸
的区别，其中 !"##’’.!基因和 !"##%&.!基因间的差异
最大，具有 *’ 个氨基酸的差异。新分离的 !"##*".!
基因和 !"##*).!基因与其他 !"## 基因之间具有
* C 2个氨基酸的差异，差异相对较小，而 !"##’2.!基
因与其他 !"## 基因之间具有 & C ** 个氨基酸的差
异，!"##%&.!基因与其他 !"## 基因之间具有 ) C *’
个氨基酸的差异。日本沙梨中分离鉴定的 !"## 基
因（!"##* N !"##2）间差异较少，只有 * C " 个氨基
酸的差异。而日本沙梨 !"## 基因（如 !"##* N
!"##2）（$8AA8 $% &’O，’(()；@P5PQ8 $% &’O，’((2）和新
疆梨（如 !"##’2）或白梨（ )( *+$%,-./$01$+0）（如
!"##*% N !"##’2）基因 !"## 差异更大，具有 2 C **
个氨基酸的差异。
通过 HRSAT8R? 和 D5U8’ 软件对梨 !"## .!基因聚
类分析结果见图 !。从图中可以看出，根据 !"## 基
因的序列可以划分出 % 类：新疆梨（如‘早熟句句’、
‘魁克句句’）基因 !"##’2.!基因为一类；第 ’ 类为
中国白梨（如‘早美酥’、‘鹅梨’）基因，!"##%&.!和
!"##*%.!；其他基因聚到一起，包括日本沙梨（如‘丰
水’、‘幸水’、‘二十世纪’）和中国沙梨（‘苍溪雪
梨’、‘桂冠’、‘黄花’、‘宝珠’）!"## 基因。这和物
种分类规律基本相符。
表 !" 梨 !"##$!基因的推导氨基酸序列差异!
#$%& !" #’( )*++(,(-.( /+ -01%(, /+ $1*-/ $.*) $1/-2 3’( !"##$! 2(-(4
!’ !% !! !& !" !) !2 !1 !*’8 !*% !*& !*"! !*)! !*2 !’’! !’2 !%&! !2
!* ’ ’ ’ ’ % * ’ % ’ 2 ’ % * * ! 2 2 ’
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!*) ’ & 1 2 %
!*2 & 1 1 %
!’’ *( *’ !
!’2 2 *(
!%& *(
" ! V !"##；!9：-7’1)1!(< !：新分离的基因 ,5WRX PA>R8T5Y U565O
(&*
! 第 " 期 乌云塔娜等：梨 # 个 !"##$!基因的分离及遗传多态性分析
图 #! 梨的 !"## 基因的聚类图
$%&’ #! ()*+,-.%/& 012., 34 %&’() !"## &-/-+
!" 讨论
配子体型自交不亲和植物的花粉自交不亲和基
因如茄科植物的 !*"、蔷薇科核果类果树的 !"# 基
因已经被确定（ 53//-6-)7 +, -.’，899:；5*.;2/36+<%
+, -.’，899=；5*,1-.)2/7 +, -.’，899>；?%-%.2 +, -.’，
899>）。仁果类果树梨和苹果中也已经确定 !"##
基因是控制花粉自交不亲和基因，但分离克隆过程
中发现 !"## 基因以高度的遗传多态性的形式存
在，如梨的 !"## 基因包括 2、;、! 等。对于这些基
因哪个是真正的梨花粉自交不亲和基因目前尚不清
楚，目前日本千叶大学和神户大学的学者正在开展
梨 !"## 基因的功能鉴定研究。因此，梨 !"## 基
因的分离克隆及遗传多态性分析为梨花粉 !"## 基
因的准确确定提供了理论依据。梨 !"## @!基因一
级结构包括 " 个 $@A3B 区域和 # 个可变区（?"，?8，
?C，?#）（ 52++2 +, -.’，899=）。本试验克隆的 !"##
基因的 $@A3B 区域氨基酸的变异较多，可达 = 处，#
个可变区中 ?"，?C，?# 中具有氨基酸的变异，而 ?8
中均未发现氨基酸变异。这和日本梨 !"##" D
!"##E 基因的序列规律基本一致。
!"## 基因序列变异因梨种不同有明显的差
异。如日本沙梨中分离鉴定的 !"## 基因（ !"##"
D !"##>）间差异较少（ 52++2 +, -.’，899=；?%-%.2 +,
-.’，899>），只有 " F G 个氨基酸的差异。而日本沙
梨 !"## 基因（如 !"##" D !"##>）和新疆梨（如
! ! !
!"##8>）或白梨 !"##（如 !"##"C D !"##8>）基因差
异更大，具有 > F "" 个氨基酸的差异。这可能与日
本沙梨与新疆梨或白梨之间的遗传差异较大，亲缘
关系相对远有关。梨 !"## 基因是花粉自交不亲和
基因，控制花粉的自交不亲和性。该基因存在很大
的多态性，随着不同梨品种不同 !"## 基因的遗传
多态性的更深入的研究，为梨自交不亲和机理及遗
传改良提供良好的理论基础。
参 考 文 献
乌云塔娜，谭晓风，李秀根，等 ’ 899=H "C 个‘新世纪’梨后代品种 !
基因型的鉴定 ’ 林业科学，#C（E）：""G D "88H
I%.3J*<% K，L2<-+1% L，L2<2,3 K’ 899=H M3)JN3.O1%+N 34 !"## D ! 2/7
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（责任编辑 ! 徐 ! 红）
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