全 文 ：第 49 卷 第 11 期
2 0 1 3 年 11 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 11
Nov．，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20131113
收稿日期: 2013 － 06 － 01; 修回日期: 2013 － 09 － 20。
基金项目: 新疆维吾尔自治区科技计划项目“特色林果重大病虫害持续高效绿色防控技术研究”(201130102-3) ;新疆维吾尔自治区重点
学科森林培育资助项目。
* 阿地力·沙塔尔为通讯作者。
枣实蝇特异引物 PCR鉴定技术*
程晓甜1 阿地力·沙塔尔1 张 伟3 温俊宝2 李新泉1 陈 梦4
(1. 新疆农业大学林学与园艺学院 新疆教育厅干旱区林业生态与产业技术重点实验室 乌鲁木齐 830052;
2. 北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室 北京 100083;
3. 新疆出入境检验检疫局技术中心 乌鲁木齐 830083;4．新疆维吾尔自治区林业有害生物防治检疫局 乌鲁木齐 830000)
摘 要: 在设计的枣实蝇 15 对引物中，利用种特异引物 PCR (SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳技术筛选出 1 对枣实
蝇的特异性引物，引物的特异性用桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果实蝇等 5 种实蝇来验证。
SS-PCR方法的检测灵敏度用 40，20，10，1，0. 1，0. 01，0. 001 ng·μL － 1等 7 个不同浓度系列的枣实蝇 DNA 模板来
检测。结果表明，SS-PCR 方法的检测限度达 0. 01 ng·μL － 1以下，最适模板 DNA 浓度为 1 ～ 20 ng·μL － 1。所设计的
引物对枣实蝇不同虫态均能进行特异性扩增，结果准确可靠。该技术体系可用于枣实蝇的鉴定识别与检测监测，
对阻止其进一步扩散蔓延具有重要意义。
关键词: 种特异引物 PCR; 枣实蝇; 琼脂糖凝胶电泳; 鉴定
中图分类号: Q965 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)11 － 0098 － 05
Species-specific PCR Primers for Identification of Carpomyia vesuviana
Cheng Xiaotian1 Adili Shataer1 Zhang Wei3 Wen Junbao2 Li Xinquan1 Chen Meng4
(1 ． Key Lab． of Forestry Ecology and Industry Technology in Arid Region，Education Department of Xinjiang
College of Forestry and Horticulture，Xinjiang Agricultural University Urumqi 830052;
2 ． Key Laboratory for Silviculture and Forest Conservation of Ministry of Education，Beijing Forestry University Beijing 100083
3 ． Xinjiang Entry- Exit Inspection and Quarantine Bureau Urumqi 830083;
4 ． Master Station of Prevention and Quarantine of Forestry Plant Diseases and Insect Pests in Xinjiang Urumqi 830000)
Abstract: In this study SS-PCR and agarose gel electrophoresis technique were used to select a pair of specific primers
from the 15 pairs of primers of designed for Carpomyia vesuviana． Five fruit fly species，Bactrocera dorsalis，B． cucurbitae，
B． tau，B． correcta and B． zonata，were used to determine the primer specificity． A series of genomic DNA dilution of C．
vesuviana，40，20，10，1，0. 1，0. 01，and 0. 001 ng·μL － 1，were used to detect the sensitivity of SS-PCR． The results
showed that the detection limit of SS-PCR was less than 0. 01 ng·μL － 1，and the optimum template DNA concentration was
between 1 ng and 20 ng·μL － 1 ． The designed primers could be used for amplifying the DNA of C． vesuviana at different
stages． The developed SS-PCR method can be used for identification，inspection and monitoring of C． vesuviana，which
would have an important significance in preventing the insect from spreading any further．
Key words: SS-PCR; Carpomyia vesuviana; agarose gel electrophoresis; identification
重大检疫性害虫枣实蝇(Carpomyia vesuviana)于
2007 年在吐鲁番地区发现，对该地区枣产业造成了
毁灭性损失，且疫情有向其他地区扩散的趋势(张润
志等，2007; 阿地力·沙塔尔等，2008; 2012)。随着
中国经济的高速发展，无论是国内地区间还是国际间
的商业贸易与人员往来都日渐频繁，枣实蝇的扩散风
险也越来越高。而一旦枣实蝇入侵新的区域，往往会
给入侵地的水果种植业和农业生产带来严重的后果，
有的甚至会造成毁灭性的打击。因此，枣实蝇的快速
检验检疫在农业安全与植物检疫中愈来愈重要。然
而，枣实蝇主要以幼虫蛀食果肉，成虫不危害枣果，通
常可造成的产量损失高达 20%以上，发生严重的可
以导致全部枣果受到危害，从而严重影响到红枣的产
品质量及其整体的商品价值 (阿地力·沙塔尔等，
第 11 期 程晓甜等: 枣实蝇特异引物 PCR 鉴定技术
2012)。迄今为止，实蝇类害虫的种的鉴定主要依据
成虫的形态特征，而卵、幼虫、蛹由于其特征差异小，
且有些特征在其不同的发育时期不够稳定，因此依据
形态学鉴定方法很难保证鉴定的准确度。即使枣实
蝇的幼虫能依据形态学进行鉴定，但很大程度上依
赖鉴定人员丰富的鉴定经验，这就制约了不同地区
相关工作的进一步开展。在口岸检疫工作中，通常
要将幼虫培养到成虫再进行鉴定，整个检疫鉴定过
程时间长达数周，无法适应实际工作需要(Nakahara
et al．，2002; Naeole et al．，2003; Muraji et al．，2002)。
显然，仅仅依靠形态学分析进行实蝇种类鉴定的研
究，不能与日益增长的水果蔬菜贸易发展相协调，也
不利于建立一个高效快速的检疫性实蝇的检测技术
体系，从而使检疫和防控工作具有相当大的困难(余
道坚等，2006)。
种特异引物 PCR ( species-specific PCR， SS-
PCR) 扩增技术是与通用引物 PCR ( universal-
primers PCR，UP-PCR)技术相区别而提出来的，种
特异引物常规 PCR 技术的原理与普通 PCR 扩增相
似，只是在根据靶序列进行引物设计时，需要充分考
虑引物的特异性，用特异性强的引物扩增未知模板，
通过检测目标片段的有无，达到把目标种与其他种
鉴别开来的目的(邓中平，2004)。余道坚(2005)分
别建 立 了 常 规 PCR 鉴 定 辣 椒 实 蝇 ( Bactrocera
latifrons)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)、杨桃实蝇
(B． carambolae)、番石榴实蝇 ( B． correcta)、桔小实
蝇(B． dorsalis)、芒果实蝇(B． occipitalis)、木瓜实蝇
(B． papayae)、菲律宾实蝇(B． philippinensis)、瓜实蝇
(B． cucurbitae)和南瓜实蝇(B． tau)的方法。然而，
自从枣实蝇发生以来，除了形态学鉴定之外，目前国
内外还没有一套枣实蝇特异引物 PCR 鉴定技术。
本研究在通过对枣实蝇 mtDNA 的 COI 基因片段
进行测序，设计了枣实蝇 15 对引物基础上，应用 SS-
PCR和琼脂糖凝胶电泳(AGE)技术，筛选出了 1 对枣
实蝇的特异性引物，并以瓜实蝇等 5 种我国口岸检疫
中较常见的实蝇类害虫(余道坚等，2004)为检验引物
特异性的阴性对照，证明在试验涉及到的这些近缘种
范围内，本研究设计的引物对枣实蝇的特异性，从而建
立了常规 PCR鉴定枣实蝇的方法，大大缩短了枣实蝇
的鉴定周期。采用 SS-PCR 进行快速鉴定枣实蝇技术
的研究，旨在有效阻截枣实蝇的进一步传播扩散。
1 材料与方法
1. 1 实蝇标本来源
枣实蝇(幼虫、蛹和成虫)采自新疆吐鲁番。桔
小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇
(B． zonata)为成虫，由新疆出入境检验检疫局提供。
所有实蝇标本均用体视显微镜鉴定，以确定种类。
用于分子生物试验的实蝇标本用 100%酒精浸泡并
保存于4 ℃冰箱。鉴于枣实蝇的卵、幼虫、蛹与其他
实蝇类害虫形态十分相似而难以区分，然而桔小实
蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇属于我
国口岸检疫中较常见的实蝇类害虫，所以将这些种
类作为检验引物特异性的阴性对照。
1. 2 供试试剂
动物组织基因组 DNA 提取试剂盒、PCR 反应体
系试剂 (Mg2 + 和 dNTP、10 × buffer)、Taq 酶、EB、
DL2000DNA Marker、琼脂糖均购自庄盟生物有限公
司(阿地力·沙塔尔等，2012)。
1. 3 主要仪器
Biometra 定量梯度 PCR 仪(华粤)、TGL － 1613
台式高速离心机(上海)、DYY － 12C 多功能电泳仪
(北京市六一仪器厂)、D56 － 26M 型数字图像分析
仪(北京市六一仪器厂)、Thermo Nanodrop2000 超微
量紫外分光光度计(北京科誉兴业科技发展有限公
司)、XMTD － 4000 水浴锅(北京市永光明医疗仪器
厂)、MDF － 382 E (N)SANYO 超低温冰箱(上海中
庸检验设备有限公司)、SANYOMLS － 3750 全自动
高压灭菌仪(上海中庸检验设备有限公司)。
1. 4 试验方法
1. 4. 1 枣实蝇基因组 DNA 的提取 本研究应用北
京庄盟国际生物基因科技有限公司研发的动物组织
基因组 DNA 提取试剂盒推荐的方法来提取基因组
DNA，提取方法按操作技术指南的步骤进行(阿地
力·沙塔尔等，2012)。
1. 4. 2 引物设计 以目标枣实蝇线粒体 DNA
(mtDNA ) 中 COI 基因 序列 (该 序 列 为 笔 者 在
GenBank 提交的序列，序列号 HQ687210)为目标序
列(阿地力·沙塔尔等，2012 )，借助 Mega4 软件
(DNASTAR 公司，美国)中 CLUSTAL 方法，与己知
其他种类的实蝇的 COI 基因序列(包括本研究和其
他公开报道的序列)进行比较分析，人工设计引物，
引物用 Primer5 软件检查引物错配、二聚体和发夹
结构，并用 GenBank 中提供的 Blast 程序检查同源序
列(Muraji et al．，2002)。本研究共设计了 15 对引
物，通过筛选获得能特异鉴定枣实蝇的引物 1 对，引
物筛选的原则是所有引物在标准的 SS-PCR 的反应
体系和反应条件下能特异地鉴定出枣实蝇。引物由
北京华大中生科技发展有限公司负责合成。
1. 4. 3 DNA 质量检查 枣实蝇 DNA 提取质量用
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林 业 科 学 49 卷
引物对 can-F / can-R 来检查。该引物对是专门用于
检查实蝇类昆虫模板 DNA 质量的通用引物，定量梯
度 PCR 仪反应体系包括 10 × Buffer(不含 Mg2 + )2. 5
μL，25 mmol·L － 1 Mg2 + 2. 5 μL，2. 5 mmol·L － 1 dNTP
2. 5 μL，10 μmol·L － 1上下游引物各 1 μL，1 UTaq
酶，模板 DNA 1 μL，加水至总体积 25 μL，反应条件
为 94 ℃ /5 min，95 ℃ /40 s，55 ℃ /30 s，72 ℃ / 1
min，30 个循环，最后 72 ℃延伸 7 min。PCR 反应结
束后，分别提取 PCR 产物 5 μL 在含溴化乙锭的
1. 5% 琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳 30 min ( 90
V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大
小和宽度，确切的 DNA 浓度通过核酸蛋白检测仪测
定(余道坚等，2004; 吴佳教等，2005; Jamnonglik et
al．，2003; 阿地力·沙塔尔等，2012)。
1. 4. 4 SS-PCR 引物的种特异性检验 分别以单头
桔小实蝇、番石榴实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、桃果实蝇
的 DNA 为模板，枣实蝇为阳性对照，检验枣实蝇特
异片段扩增引物 Car-F /Car-R 的种特异性。
SS-PCR 在定量梯度 PCR 仪(Biometra)上进行，
反应体系:0. 25 mmol·L － 1 Mg2 +，0. 25 mmol·L － 1
dNTP，10 mmol·L － 110 × Buffer，1 UTaq 酶(Takara)，
上下游引物各0. 1 μmol·L － 1，模板 DNA 1 μL，加水
至总体积 25 μL。反应条件为 94 ℃ /5 min，95 ℃ /
40 s，57 ℃ /30 s，72 ℃ / 1 min，33 个循环，最后 72
℃延伸 5 min。分别提取 PCR 产物 5 μL 在多功能
电泳仪上用含溴化乙锭的 1. 5% 琼脂凝胶电泳 30
min(90 V)，用数字图像分析仪检测结果，观察扩增
带的大小和宽度(余道坚等，2004; 阿地力沙塔尔
等，2012)。
1. 4. 5 SS-PCR 引物对不同虫态的扩增效果以及灵
敏度检测 分别以提取的不同虫态 (幼虫、蛹和成
虫)的枣实蝇 DNA 为模板，进行靶标片段扩增效果
检验，每种虫态分别检测 10 头。此外，取不同浓度
的成虫 DNA 模板即 40，20，10，1，0. 1，0. 01，0. 001
ng·μL － 1进行最低检出阈值的测定，每个浓度共计
检测 10 头(张桂芬等，2012)。
1. 4. 6 PCR 产物序列分析 将特异引物 PCR 扩增
产物分别用原 PCR 引物进行序列测定，获得的序列
与原模板的序列进行比较分析，检查所得到的 PCR
是否为特异性产物(余道坚，2005)。
2 结果分析
2. 1 DNA 质量检查
为了避免假阴性现象的出现，枣实蝇 DNA 提取
质量用引物 can-F / can-R 来检查(余道坚，2005)，6
种实蝇模板 DNA 扩增结果见图 1。由图可知: COI
基因通用引物对 6 种实蝇的 DNA 成功扩增，在600 ～
700 bp 之间目标片段的位置有一条扩增带，亮度差
异表示模板浓度的差异。DNA 确切浓度和纯度通
过核酸蛋白检测仪来测定 (阿地力·沙塔尔等，
2012)。
图 1 can-F / can-R 引物 PCR 模板 DNA 质量检查
Fig． 1 Agarose gel electrophoresis analysis (GEA) of the
quanlity of DNA template with primer set can-F / can-R
1．桔小实蝇 B． dorsalis; 2． 番石榴实蝇 B． correcta; 3． 瓜实蝇 B．
cucurbitae; 4．南瓜实蝇 B． tau; 5．桃果实蝇 B． zonata; 6． 枣实蝇
C． vesuviana; 7． 阴性对照 (模板为水) CK M: DL2000 DNA
Marker．下同 The same below．
2. 2 SS-PCR 鉴定枣实蝇
2. 2. 1 引物特异性验证 本研究共设计了 15 对引
物，最后通过筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异性
引物 1 对。为了检查常规 PCR 方法下该引物的特
异性，试验材料中除待鉴定区分的枣实蝇之外，还将
桔小实蝇、番石榴实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、桃果实蝇
等 5 种同源性较高的实蝇一起进行试验。经常规
PCR 反应，筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异性引
物 CarF /CarR，并进行常规 PCR 扩增，扩增产物经过
琼脂糖凝胶电泳，结果如图 2 所示:除了枣实蝇在
205 bp 处有一条特异性扩增的条带外，阴性对照和
其他 5 种实蝇均无特异性目标片段，从而证明该引
物在试验涉及到的这些近缘种范围内，能特异性地
鉴定枣实蝇。
2. 2. 2 SS-PCR 方法的检测灵敏度 SS-PCR 方法
的检测灵敏度分别用 40，20，10，1，0. 1，0. 01 和
0. 001 ng·μL － 1等 7 种不同浓度的枣实蝇 DNA 模板
来确定(图 3)。由图可知:当模板浓度为 0. 001 ng·
μL － 1时，没有扩增出特异性条带，当模板浓度为
0. 01 ng·μL － 1时仅出现了微量的目标条带，扩增带
十分弱，然而当模板浓度大于 0. 1 ng·μL － 1时，均能
001
第 11 期 程晓甜等: 枣实蝇特异引物 PCR 鉴定技术
图 2 特异性引物 PCR 检测枣实蝇的特异性
Fig． 2 Specificity of primer by SS-PCR
产生特异性条带，由本试验可知常规 PCR 方法鉴定
实蝇的最适模板浓度应该大于 0. 1 ng·μL － 1。
图 3 枣实蝇成虫不同浓度 DNA 模板常规 PCR 电泳结果
Fig． 3 Agarose gel electrophoresis analysis of SS-PCR
products with different template DNA concentrations of
C． vesuviana
1. 40 ng·μL － 1 ; 2. 20 ng·μL － 1 ; 3. 10 ng·μL － 1 ; 4. 1 ng·μL － 1 ;
5. 0. 1 ng·μL － 1 ; 6. 0. 01 ng·μL － 1 ; 7. 0. 001 ng·μL － 1 ;
8. 阴性对照(模板为水)CK;
M． DL2000DNA Marker．
2. 2. 3 SS-PCR 在枣实蝇快速鉴定上的应用 特异
性引物常规 PCR 的可靠性分别用枣实蝇幼虫、蛹和
成虫 3 种不同的虫态来验证。试验结果表明常规
PCR 不受虫态限制，不同虫态均能特异性扩增 (图
4)，说明特异引物常规 PCR 的特异性由引物的特异
性和模板的浓度决定，而与标本的虫态及存活状态
无关。
2. 2. 4 SS-PCR 产物测序 除了对 SS-PCR 产物进
行琼脂糖凝胶电泳，检查枣实蝇特异引物扩增的特
异片段大小是否有预期的一致外，同时分别对特异
图 4 枣实蝇不同虫态的常规 PCR 特异性检测
F ig． 4 Specificity of SS-PCR with different stages of C． vesuviana
1. 幼虫 Larval; 2．蛹 Pupa; 3．成虫 Adult; 4: 阴性对照
(模板为水)CK; M. DL2000DNA Marker．
引物的 SS-PCR 产物进行测序并进行序列分析，将
序列与原序列进行比较，进一步确认产物的特异性。
试验结果表明，PCR 产物的测序结果与原序列一
致，均为: CTCAACTAAATTATTCCCCAGCAATATTA
TGAGCTTTAGGATTTGTATTTTTATTTACAGTAGGAG
GATTAACAGGAGTAGTATTAGCAAATTCATCAGTTG
ATATTATTCTTCATGACACTTATTATGTAGTTGCTCA
TTTT CATTATGTACTATCAATAGGAGCTGTATTTGC
TATTATAGCTGGATTTGTGCATTGATACCC。
3 小结与讨论
一般情况下实蝇形态鉴定要将不成熟虫态
(卵、幼虫、蛹)饲养为成虫，其周期约需 20 天。由
于检测周期较长，这种方法不能满足贸易性果蔬快
速通关的需求。然而定性 PCR 检测可解决这一长
期困扰口岸检验检疫人员的问题，它不受虫态的限
制———成虫、幼虫、蛹、卵均能检测，而且只要获得微
量的 DNA，即使个体残缺也不影响准确性，同时能
大大缩短检测周期。笔者还将 PCR 检测与成虫饲
养互相验证，确认了 PCR 检测结果的准确性(余道
坚等，2004)。目前，国外利用实蝇的个体残肢也可
提取 DNA，并成功地进行 PCR 反应和基因序列分析
(余道坚等，2004; Muraji et al．，2002)。本研究建
立的检测方法，为新入侵的检疫性害虫枣实蝇的快
速鉴定提供了新途径，该技术平台同样适用于形态
较难区分的近缘种的检疫鉴定(余道坚等，2004)。
在实际应用中，枣实蝇幼虫往往随枣果传播，为实现
快速分子检疫鉴定的目的，不可能直接应用种特异
引物进行种类鉴定，而是要根据实蝇的背景知识
(如分布、寄主等)和多年来实蝇检疫积累的经验对
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实蝇的种类进行初筛，再通过属、亚属和种特异引物
等种的特异性引物进行 PCR 检测，才能准确鉴定是
否为枣实蝇。SS-PCR 对试验仪器的要求不高，因
此，该技术在实际工作中很容易推广应用。
本研究在设计的枣实蝇 15 对引物中，利用 SS-
PCR 和琼脂糖凝胶电泳技术筛选出了 1 对枣实蝇的
特异性引物，引物的特异性分别用桔小实蝇、瓜实
蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果实蝇 5 种我国口岸
检疫中较常见的实蝇类害虫来验证。SS-PCR 方法
的检测灵敏度用 40，20，10，1，0. 1，0. 01，0. 001
ng·μL － 17 个不同浓度系列的枣实蝇 DNA 模板来检
测。结果表明:SS-PCR 方法的检测限度达 0. 01 ng·
μL － 1以下，最适模板 DNA 浓度为 1 ～ 20 ng·μL － 1。
本研究所设计的引物能对不同虫态能进行特异性扩
增，结果准确可靠，表明在试验涉及到的这些近缘种
范围内对枣实蝇的特异性，从而建立了常规 PCR 鉴
定枣实蝇的方法。SS-PCR 分析技术操作简便快捷，
缩短了通关时间，提高了工作效率。因此，该技术体
系可以用于枣实蝇的检测鉴定工作，并在检疫性害
虫的检疫检验与检测监测中具有重要应用价值。然
而，我国检疫性实蝇类害虫种类较多，而且不同地理
种群之间的 COI 基因序列差异较大(阿地力·沙塔
尔等，2012)，从而造成种的特异性引物设计存在较
大困难。余道坚 (2005)以检疫性实蝇为研究对象
设计了亚属持异性引物及种特异性引物，这为以后
建立类似形态学的属、亚属和种分级分子检索表提
供了新思路，使实蝇鉴定分子检索表甚至是计算自
动化鉴定成为可能。但如用单一的 COI 基因标记
全部基因来设计所有果实蝇亚属种特异引物，还有
一定难度，因为目前己知的该亚属的 COI 基因序列
只是一些有比较重要经济价值的种类 (余道坚，
2005; Muraji et al．，2002)。因此，种特异性引物的
设计要有相当数量的相同片段的基因序列，特别是
属内同缘种要足够多。本试验引物设计过程中尽可
能考虑到其他的一些近缘种的同源序列，选取桔小
实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇 5 种
我国口岸检疫中较常见的实蝇类害虫为材料，将这
些种类作为检验引物特异性的阴性对照，证明了试
验涉及的近缘种范围内本研究设计引物的特异性，
从而建立了常规 PCR 鉴定枣实蝇的方法;但因实蝇
类害虫多为检疫性害虫，采样困难，因此今后将尽力
采集更多的实蝇种类，进一步验证本研究设计的
SS-PCR 引物的特异性。
同时，近几年越来越多的分子生物学快速检疫
鉴定技术已运用到实蝇类昆虫检疫鉴定中，比如
SYBR Green 实时荧光 PCR，TaqMan、Taq-Man-MGB
及分子信标 (molecular beacon)探针实时荧光 PCR
等。关于枣实蝇实时荧光 PCR 快速检疫鉴定技术
有待继续研究。
参 考 文 献
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(责任编辑 朱乾坤)
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