全 文 ：第 50 卷 第 4 期
2 0 1 4 年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 4
Apr．，2 0 1 4
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20140409
收稿日期: 2013 － 06 － 10; 修回日期: 2013 － 12 － 09。
基金项目: 新疆维吾尔自治区科技计划项目“特色林果重大病虫持续高效绿色防控技术研究”(201130102 － 3) ; 新疆维吾尔自治区自治
区重点学科森林培育资助项目; 新疆维吾尔自治区林业有害生物防治检疫局项目“枣实蝇快速检测和监测技术研发”。
* 阿地力·沙塔尔为通讯作者。
SYBＲ Green实时荧光 PCＲ快速鉴定枣实蝇技术*
程晓甜1 阿地力·沙塔尔1 张 伟2 李新泉1 玛依拉1
(1．新疆农业大学林学与园艺学院 新疆教育厅干旱区林业生态与产业技术重点实验室 乌鲁木齐 830052;
2．新疆出入境检验检疫局技术中心 乌鲁木齐 830083)
摘 要: 应用 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 技术，建立 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 快速鉴定枣实蝇的方法。利用枣
实蝇(mtDNA)中 COⅠ基因序列，设计筛选出 1 对种的特异引物 CarF /CarＲ。引物的特异性分别用桔小实蝇、瓜实
蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果实蝇 5 种实蝇来验证。SYBＲ Green PCＲ 实时荧光反应的灵敏度用 40，20，10，1，
0. 1，0. 01，0. 001 ng·μL － 17 个浓度枣实蝇 DNA 模板来检测。结果表明: SYBＲ Green PCＲ 的检测限度达 0. 01 ng·
μL － 1以下，最适模板 DNA 浓度为 1 ～ 20 ng·μL － 1。SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 的可靠性可用枣实蝇不同虫态(幼
虫、蛹、成虫)的扩增曲线、熔解曲线及 PCＲ 产物的琼脂糖凝胶电泳来检验。成虫、幼虫和蛹 3 种不同虫态的枣实蝇
有一致的扩增曲线，熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳条带分别用来确认实时荧光 PCＲ 产物的特异性;其平均熔解
温度为(75. 3 ± 0. 1) ℃，并获得一段长为 205 bp 的特异性目标片段，说明在枣实蝇成虫为模板的基础上建立的
SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 方法同时适用于幼虫、蛹的快速鉴定，可将不同虫态的枣实蝇与近似种类区分开来。
关键词: 枣实蝇; SYBＲ Green; 实时荧光 PCＲ; 溶解曲线; 鉴定
中图分类号: Q965 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)04 － 0060 － 06
Ｒapid Identification of Carpomya vesuviana by Ｒeal-Time PCＲ with
SYBＲ Green Chemical
Cheng Xiaotian1 Adil Sattar1 Zhang Wei2 Li Xinquan1 Mayila1
(1 ． Key Lab． of Forestry Ecology and Industry Technology in Arid Ｒegion，Education Department of Xinjiang
College of Forestry and Horticulture，Xinjiang Agricultural University Urumqi 830052;
2 ． Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Urumqi 830083)
Abstract: The technique of a real-time PCＲ with SYBＲ Green I dye was used in this study． A SYBＲ Green real-time
PCＲ was developed to rapidly obtained identify Carpomya vesuviana BIOEＲ FQD － 48A sequence detection system． A
C． vesuviana specific PCＲ primers set was designed based on mtDNA COⅠ gene of C． vesuviana． Five Bactrocera fruit
flies，B． dorsalis，B． cucurbitae，B． tau，B． correcta and B． zonata，were used to determine the specificity of the primers
set CarF /CarＲ． A series of genomic DNA dilutions of C． vesuviana，40，20，10，1，0. 1，0. 01，0. 001 ng·μL － 1，were used
to detect the sensitivity of SYBＲ Green PCＲ． The results showed that the detection limit of SS-PCＲ was less than 0. 01 ng
·μL － 1 ． The template DNA concentration was one of the sources of variability in cycle threshold values ( CT) and the
optimum DNA concentration was between 1 ng·μL － 1 and 20 ng·μL － 1 in SYBＲ Green PCＲ． The template DNA isolated
from the larva，pupa and adult specimens of C． vesuviana respectively were used to detect the reliability of SYBＲ Green
PCＲ． Melting curve analysis (MCA) and agarose gel electrophoresis ( AGE) was then used to confirm the specificity
reliability of PCＲ products，respectively． The similar amplification plots were obtained in three different stages of C．
vesuviana． The average melting temperature ( Tm) of the PCＲ product from B． latifrons was 75. 3 ℃ ± 0. 1 ℃，and a
205 bp length fragment target was amplified． Except for the adult of fruit flies，the molecular techniques established in this
study can also rapidly identify the larva and pupa．
Key words: Carpomya vesuviana; SYBＲ Green; real-time PCＲ; melting curve; rapid identification
第 4 期 程晓甜等: SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 快速鉴定枣实蝇技术
枣实蝇(Carpomya vesuviana)是我国 2007 年新
增补的进境植物检疫性有害生物，其入侵可能对我
国枣产业生产构成毁灭性危害。枣实蝇目前主要分
布在意大利、高加索、毛里求斯、巴基斯坦、泰国、阿
富汗等国家和地区，在我国仅分布在新疆的吐鲁番
地区，且疫情有向其他地区扩散的趋势(张润志等，
2007; 阿地力·沙塔尔等，2008)。在口岸检疫中截
获的枣实蝇以幼虫和蛹等虫态为主。实蝇类害虫种
的鉴定主要依据成虫的形态特征，因而很难保证鉴
定的准确度。即使枣实蝇的幼虫能依据形态学进行
鉴定，但很大程度上还依赖鉴定人员丰富的鉴定经
验，这就制约了不同地区相关工作的进一步开展。
口岸检疫中通常要将枣实蝇的幼虫和蛹培养到成虫
再进行鉴定，整个检疫鉴定过程时间长达 20 天，无
法适应实际工作需要。显然，仅仅依靠形态学分析
进行枣实蝇的鉴定研究，不能与日益增长的水果蔬
菜贸易发展相协调，从而给检疫和防控工作造成相
当大的困难。因此，非常有必要研究枣实蝇快速鉴
定的新方法，特别是幼虫、蛹等未成熟虫态的快速鉴
定方法。近些年来，AFLP 和 ＲFLP 等分子诊断技术
已先后应用于实蝇的分类鉴定 (吴佳教等，2005;
Naeole et al．，2003; Muraji et al．，2002; Nakahara et
al．，2002)。
SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 技术是在 PCＲ 反应
体系中加入过量的 SYBＲ Green 荧光染料，在 PCＲ
每个循环结束时，利用荧光信号积累实时监测整个
PCＲ 反应的进程。SYBＲ Green 是一种小分子 DNA
染料，游离时不会发射任何荧光信号，但当与双链
DNA(dsDNA)特异地结合时，荧光染料掺入 DNA 双
链，发射出强烈的荧光信号(Giulietti et al．，2001)，
同时 PCＲ 产物的特异性可以用熔解曲线分析进一
步确认。近年来，SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 技术
已广泛应用于科学研究和医学临床诊断分析中
(Ponchel et al．，2003; Giolio et al．，2003; Tanriverdi
et al．，2002 )。余道坚 ( 2005 ) 分别建立了 SYBＲ
Green 实时荧光 PCＲ 鉴定辣椒实蝇 ( Bactrocera
latifrons)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)、杨桃实蝇
(B． carambolae)、番石榴实蝇 ( B． correcta)、桔小实
蝇(B． dorsalis)、芒果实蝇(B． occipitalis)、木瓜实蝇
(B． papayae)、菲律宾实蝇(B． philippinensis)、瓜实蝇
(B． cucurbitae)和南瓜实蝇(B． tau)的方法。然而，
自从枣实蝇发生以来，除了形态学鉴定之外，目前国
内外还没有一套枣实蝇 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ
鉴定技术。
本研究应用 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 技术，
建立了 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 快速鉴定枣实蝇
的方法。利用枣实蝇 (mtDNA)中 COⅠ基因序列，
筛选出种特异引物 CarF /CarＲ。引物的特异性分别
用桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果
实蝇 5 种实蝇来验证，并分别从引物特异性验证、
SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 反应的灵敏度和在枣实
蝇幼虫、蛹的快速鉴定上的应用 3 个方面进行研究。
实时荧光 PCＲ 产物的特异性通过溶解曲线分析和
琼脂糖凝胶电泳来验证，从而建立 SYBＲ Green 实时
荧光 PCＲ 快速鉴定枣实蝇方法。该技术打破了常
规上仅仅依靠形态学鉴定枣实蝇的方法，建立了从
分子方面快速检测枣实蝇的技术，为该虫的检疫提
供了一种新的方法。本研究建立的分子生物学方法
不仅能鉴定枣实蝇的成虫而且能快速鉴定幼虫、蛹
和卵等虫态，使枣实蝇的鉴定周期从传统的形态学
鉴定所需 20 天时间缩短到 4 h 以内，在植物检疫性
枣实蝇的日常鉴定中有极大的优势。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
枣实蝇(幼虫、蛹和成虫)采自新疆吐鲁番。桔
小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇为
成虫，由福建农林大学提供。所有试验材料都是经
专家鉴定的新鲜标本。用于分子生物试验的实蝇标
本用 100%酒精浸泡并保存于 4 ℃冰箱。
1. 2 供试试剂
动物组织基因组 DNA 提取试剂盒、2 × SYBＲ
Green MasterMix、琼脂糖、EB、DL2000DNA Marker 均
购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，设计的
引物交至北京华大中生科技发展有限公司合成。
1. 3 主要仪器
荧光定量 PCＲ 检测仪 ( BIOEＲ FQD-48A) (杭
州博日科技有限公司 )、超微量紫外分光光度计
(Thermo NANODＲOP 1000)、金属浴(HB-1000) (杭
州博日科技有限公司)、TGL-1613 台式高速离心机
(上海)、DYY-12C 多功能电泳仪(北京市六一仪器
厂)、D56-26M 型数字图像分析仪(北京市六一仪器
厂)、Thermo Nanodrop2000 超微量紫外分光光度计
(北京科誉兴业科技发展有限公司)、SANYO MLS-
3750 全自动高压灭菌仪(上海中庸检验设备有限公
司)、XMTD-4000 水浴锅 (北京市永光明医疗仪器
厂)、MDF -382 E (N) SANYO 超低温冰箱(上海中
庸检验设备有限公司)。
1. 4 试验方法
1. 4. 1 基因组 DNA 和测序 实蝇基因组 DNA 采
16
林 业 科 学 50 卷
用动物组织基因组 DNA 提取试剂盒提取。DNA 浓
度通过超微量紫外分光光度计(Thermo NANODＲOP
1000)测定的 OD260 值来换算得到。引物 Uea7 /
Uea10(余道坚，2005)用来 PCＲ 扩增实蝇 COⅠ基
因约 670 bp 的片段和 DNA 序列分析。PCＲ 反应在
BIOEＲ FQD-48A 荧光定量 PCＲ 检测系统上进行，反
应条件为: 预变性 94 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s，48 ℃
30 s，72 ℃ 1 min，重复 35 个循环，72 ℃ 7 min。测
序交至北京华大中生科技发展有限公司，每个样品
上下游引物各测 1 次，序列用 Seqman 软件拼接。
1. 4. 2 引物设计 以枣实蝇线粒体 DNA(mtDNA)
中 CO Ⅰ 基 因 部 分 序 列 ( GenBank 序 列 号:
HQ687210 )为目标序列，Mega4 软件(DNASTAＲ 公
司，美国) 中 CLUSTAL 方法，与蔷薇咔实蝇 Ｒ248
FJ571371. 1、蔷薇咔实蝇 Ｒ141 FJ571370. 1、樱桃绕
实蝇( Ｒhagoletis cerasi) FJ571369. 1、具条实蝇 ( B．
scutellata) AY530890. 1、南瓜实蝇 AY 398753. 1、瓜
实 蝇 ( B． cucurbitae ) AY398758. 1、芒 果 实 蝇
AY39875 4. 1 等己知其他种类的实蝇的 COⅠ基因
序列(包括本研究和其他公开报道的序列) 进行比
较分析，人工设计引物，引物用 Primer 5 软件检查引
物错配、二聚体和发夹结构，并用 GenBank 中提供
的 Blast 程序检查同源序列(余道坚等，2006)。
1. 4. 3 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ SYBＲ Green
实时荧光 PCＲ 扩增反应在 BIOEＲ FQD-48A 荧光定
量 PCＲ 检测仪的 48 孔板上进行，PCＲ 反应总体为
50 μL，其中 25 μL 2 × SYBＲ Green MasterMix，上下
游引物(10 pmol)各 0. 5 μL，模板 DNA 1 μL(≈20
nng·μL － 1)，去离子水 23 μL。桔小实蝇、瓜实蝇、南
瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇 (B． zonata)等口岸
检疫中截获几率最高的 5 种实蝇用来验证引物
CarF /CarＲ 的特异性。为确定 SYBＲ Green 实时荧
光 PCＲ 反应的检测限度，40，20，10，1，0. 1，0. 01，
0. 001 ng·μL － 17 个浓度的枣实蝇成虫 DNA 作为模
板进行试验，同时分别以枣实蝇的幼虫、蛹和成虫
DNA 作为模板来验证 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 的
稳定性，所有 PCＲ 扩增反应用水作为空白对照。扩
增条件为: 95 ℃，10 s; 95 ℃，15 s; 55 ℃，30 s。35
个循环，空白设 2 个重复，每个样本重复 5 次。
1. 4. 4 熔解曲线分析 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ
产物的特异性可用熔解曲线分析来确定，实时荧光
PCＲ 反应结束后，直接在 BIOEＲ FQD-48A 荧光定
量 PCＲ 检测系统上再运行 Melting allias 程序进行
熔解曲线分析。程序的反应程序为: 目标温度
95 ℃，起始温度 60 ℃，恒温时间 20 s; 采集模式为
台阶，溶解曲线的程序每隔 0. 5 ℃读取 1 次。
1. 4. 5 琼脂凝胶电泳分析 将实时荧光 PCＲ 产物
过夜，等荧光信号散失之后，再次用琼脂糖凝胶电泳
检查扩增目标片段的大小。取 PCＲ 产物 5 μL 加入
溴酚蓝 1 μL，在含溴化乙锭(EB)的 1. 5%琼脂凝胶
上电泳分离，凝胶图像分析仪上检查结果。
1. 4. 6 数据分析 在 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ
扩增反应中，原始数据由 SDS 软件(Version 1. 7)自
动收集。CT 值是指荧光值开始达到指数增长时的
循环数。数据以 EXCEL 工作表形式导出，在 PC 机
上作出扩增曲线图。在熔解曲线分析程序中，在
PCＲ 产物缓慢从 60 ℃增至 95 ℃的同时，荧光信号
持续被仪器收集，荧光值数据由熔解软件 (Version
1. 0)转换成熔解曲线图和熔解峰值曲线( Tanriverdi
et al．，2002)。
2 结果与分析
2. 1 引物 CarF /CarＲ 特异性验证
SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 反应扩增曲线 (图
1A)显示了 6 种实蝇样品随反应循环数的增加荧光
值的变化关系，当 PCＲ 反应开始之初，SYBＲ GreenI
荧光染料信号很弱，ΔＲn 未超过仪器设定的基值，
所有样品的图形十分一致 (余道坚，2005)。到 15
个循环以后，荧光信号出现分化，枣实蝇样品出现荧
光信号的强烈增加，扩增曲线到达指数增长期，CT
值为 16，说明枣实蝇产生了特异性反应，PCＲ 产物
开始急剧增加，而其他实蝇样品和水空白对照没有
特异性 PCＲ 扩增。实时荧光 PCＲ 反应的产物熔解
曲线分析结果显示: 所有样品中只有枣实蝇样品出
现产物峰(Tm = 75. 5 ℃ )(图 1B)，同时 PCＲ 产物的
琼脂糖凝胶电泳结果进一步验证了 PCＲ 反应的特
异性，在 205 bp 处，枣实蝇样品有一条扩增电泳带，
而其他 6 种实蝇样品和水对照则没有(图 1C)。鉴
于枣实蝇的卵、幼虫、蛹与其他实蝇类害虫形态十分
相似而难以区分，分别以单头桔小实蝇、番石榴实
蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、桃果实蝇的 DNA 为模板，枣
实蝇为阳性对照，检验枣实蝇特异片段扩增引物
CarF /CarＲ 的种特异性。
2. 2 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 检测灵敏度
分别用枣实蝇成虫 7 个不同浓度的模板 DNA
用来确定 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 的检测灵敏
度。试验结果显示，所有枣实蝇样品均有扩增，CT
值与 DNA 模板浓度有关，模板浓度为 40，20，10，1，
0. 1，0. 01，0. 001 ng·μL － 1 时，CT 值分别为 9. 36，
10. 34，10. 77，15. 22，17. 06，29。在 50 μL 反应体系
26
第 4 期 程晓甜等: SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 快速鉴定枣实蝇技术
图 1 PCＲ 仪上引物 CarF /CarＲ 的特异性验证
Fig． 1 The specificity confirmation of primer CarF /CarＲ
A． SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 扩增曲线 Ｒeal-time fluorescent
PCＲ amplification curve; B．实时荧光 PCＲ 后的熔解曲线分析;
( a 为枣实蝇的峰值 ) Ｒeal-time fluorescent PCＲ melting curve
analysis( a is product peak of C． vesuviana) ; C． PCＲ 产物的琼脂
糖凝 胶 电 泳 结 果 Agarose gel electrophoresis result of PCＲ
products．
泳道 1 － 8 Lane 1 － 8: 桔小实蝇 B． dorsalis，桃果实蝇 B．
zonata，番石榴实蝇 B． correcta，瓜实蝇 B． cucurbitae，南瓜实
蝇 B． tau，枣实蝇 C． vesuviana，阴性对照 (模板为水 ) CK
Negative control CK; 阴性对照 (模板为水) CK Negative control
CK; M: DL2000 DNA．
下，SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 的检测限度可达
0. 01 ng·μL － 1 以下，模板 DNA 最适浓度为 1 ～
20 ng·μL － 1。所有扩增的 PCＲ 产物均在预期的熔
点处有相同的熔解曲线峰(图 2)。
2. 3 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 的可靠性
SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 的可靠性可用枣实
蝇不同虫态(幼虫、蛹、成虫)的扩增曲线、熔解曲线
及 PCＲ 产物的琼脂糖凝胶电泳来检验。图 3A 表
明: 枣实蝇的 3 种虫态均能扩增，CT 值分别是
10. 79，10. 56 和 11. 21，而阴性对照没有扩增反应。
枣实蝇成虫、幼虫和蛹的熔解曲线完全一致，均只有
单一产物峰，熔点分别为 75. 5，75. 5 和 75 ℃ (图
2B)，平均 (75. 3 ± 0. 1) ℃。上述试验说明在以枣
图 2 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 检测的灵敏度
Fig． 2 The sensitivity confirmation of SYBＲ Green
real-time fluorescent PCＲ
A． SYBＲ Green 实时荧光不同浓度的模板 DNA PCＲ 扩增曲线
Ｒeal-time fluorescent PCＲ amplification curve of template DNA
PCＲ with different concentrations; B．实时荧光 PCＲ 后的熔解曲
线分析 Ｒeal-time fluorescent PCＲ melting curve analysis; C． PCＲ
产物的琼脂糖凝胶电泳结果 Agarose gel electrophoresis result of
PCＲ products．
泳道 1 － 8 Lane 1 － 8: 40，20，10，1，0. 1，0. 01，0. 001 ng·μL － 1，
阴性对照(模板为水) CK: 40，20，10，1，0. 1，0. 01，0. 001 ng·
μL － 1 ; Negative control CK; M: DL2000 DNA Marker．
实蝇成虫 DNA 为模板基础上建立的 SYBＲ Green 实
时荧光 PCＲ 方法同样适用于幼虫和蛹的种类鉴定。
3 小结与讨论
SYBＲ Green 荧光染料能与所有的 DNA 双链相
结合，不必因模板不同而特别定制，试验设计简单，
成本低廉，可用于快速检测。通过熔解曲线分析可
以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特
异扩增(余道坚等，2006; 刘建越等，2006)。与常
规 PCＲ 相比，SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 具有灵敏
度高、特异性更强、自动化程度高和有效解决 PCＲ
污染问题等优点，其扩增反应灵敏度较常规 PCＲ
高，更为重要的是因不需凝胶电泳检查结果，避免了
溴化乙锭对环境和人体的危害。SYBＲ Green 实时
36
林 业 科 学 50 卷
图 3 枣实蝇不同虫态下的 SYBＲ Green
实时荧光 PCＲ 特异性检测
Fig． 3 SYBＲ Green real-time PCＲ specific detection of
C． vesuviana at different stages A． 实时荧光 PCＲ
扩增曲线 Ｒeal-time PCＲ amplification curve;; B． PCＲ 产物的熔解
曲线分析 Ｒeal-time PCＲ melting curve; C． PCＲ 产物的琼脂糖凝
胶电泳结果 Agarose gel electrophoresis result of PCＲ products．
1 ．幼虫 Larva; 2． 蛹 Pupa; 3． 成虫 Adult; 4． 阴性对照 (模板为
水)CK Negative control CK．
荧光 PCＲ 与另一种应用于医学基因诊断、环境微生
物和动植物病原真菌、细菌、病毒、转基因成分的检
测等领域中的 TagMan 探针实时荧光 PCＲ 技术相比
较，因后者在普通 PCＲ 原有的一对引物基础上，增
加了一条特异性的荧光双标记探针，可将非特异性
产物区分开(易建平等，2005; Weller et al．，2001)，
因此虽然 SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 的特异性不如
TagMan 探针实时荧光 PCＲ，但是溶解曲线分析技术
能有效地区分特异性 PCＲ 产物，较好地克服特异性
缺陷。由于检疫性实蝇种类很多，相对昂贵的
TagMan 探针，SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 不需要合
成探针，成本低廉，具广谱性，因此该方法更适用于
枣实蝇的快速鉴定。
该技术利用枣实蝇 (mtDNA) 中 COⅠ基因序
列，设计筛选出 1 对种的特异引物 CarF /CarＲ。引
物的特异性分别用桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番
石榴实蝇和桃果实蝇 5 种实蝇来验证。SYBＲ Green
PCＲ 实时荧光反应的灵敏度用 40，20，10，1，0. 1，
0. 01，0. 001 ng·μL － 17 个浓度枣实蝇 DNA 模板用来
检测。结果显示: SYBＲ Green PCＲ 的检测限度达
0. 01 ng·μL － 1以下，最适模板 DNA 浓度为 1 ～ 20 ng
·μL － 1。SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 的可靠性可用
枣实蝇不同虫态(幼虫、蛹、成虫)的扩增曲线、熔解
曲线及 PCＲ 产物的琼脂糖凝胶电泳来检验，从而建
立了国内外首次快速检测枣实蝇的技术; 首次筛选
出枣实蝇种的特异性引物，而且集六大优点于一
体———方便、适用、准确、快速、便宜、灵敏。其最大
的优点是将以往长达 20 天的鉴定缩短到4 h，结果
分析更加快捷方便，而且不受虫态的限制———4 个
虫态皆可(枣实蝇卵、幼虫、蛹、成虫)。本试验实蝇
材料为桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃
果实蝇 5 种我国口岸检疫中较常见的实蝇类害虫，
将这些种类作为检验引物特异性的阴性对照，虽然
引物设计过程中尽可能考虑到其他的一些近缘种的
同源序列，但试验材料仍有局限，因此以后要收集更
多的实蝇类群，对本研究中设计的枣实蝇特异性引
物的特异性作进一步验证。该技术可快速准确地鉴
定枣实蝇，为检疫性害虫枣实蝇的检疫提供了一种
新的方法。
参 考 文 献
阿地力·沙塔尔，何善勇，田呈明，等 ． 2008．枣实蝇在吐鲁番地区的发
生及蛹的分布规律 ．植物检疫，22(5) : 295 － 297．
刘建越，邓 欣，康 林，等 ． 2006． SYBＲ-Green 实时荧光 PCＲ 检测
转基因番木瓜 ．湖南农业大学学报:自然科学版，32(4) : 371 －
374．
吴佳教，胡学难，赵菊鹏，等 ． 2005． 9 种检疫性实蝇 PCＲ-ＲFLP 快速
鉴定研究 ．植物检疫，19(1) : 2 － 6．
易建平，刘素萍，印丽萍，等 ． 2005． TaqMan-MGB 探针在小麦印度腥
黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌鉴定上的应用 ． 植物检疫，19
(1) : 15 － 19．
余道坚 ． 2005．检疫性实蝇分子生物学快速鉴定技术的研究 ． 上海:
中国科学院上海生命科学研究院博士学位论文 ．
余道坚，章桂明，陈志粦，等 ． 2006. SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 快速
鉴定辣椒实蝇 ．植物检疫，20(1) : 10 － 14．
张润志，汪兴鉴，阿地力·沙塔尔 ． 2007． 检疫性害虫枣实蝇的鉴定与
入侵威胁 ．昆虫知识，44(6) : 928 － 930．
Giolio S，Monis P T，Saint C P． 2003． Demonstration of preferential
binding of SYBＲ Green I to specific DNA fragments in real-time
multiplex PCＲ． Nucleic Acids Ｒesearch，31 (22) : 136 － 137．
Giulietti A，Overbergh L，Valckx D，et al． ． 2001． An overview of real-
time quantitative PCＲ: applications to quantify cytokine gene
expression． Methods，25(4) : 386 － 401．
46
第 4 期 程晓甜等: SYBＲ Green 实时荧光 PCＲ 快速鉴定枣实蝇技术
Muraji M，Nakahara S． 2002． Discrimination among pest species of
Bactrocera (Diptera，Tephritidae) based on PCＲ-ＲFLP of the
mitochondrial DNA． Applied Entomology and Zoology，37 ( 3 ) :
437 － 446．
Naeole C K M，Haymer D S． 2003． Use of oligonucleotide arrays for
molecular taxonomic studies of closely related species in the oriental
fruit fly ( Bactrocera dorsalis) complex． Molecular Ecology Notes，
3(4) : 662 － 66．
Nakahara S，Kato H，Kaneda M， et al． 2002． Identification of the
Bactrocera dorsalis Complex ( Diptera: Tephritidae) by PCＲ-ＲFLP
Analysis． III． Discrimination between B． philippinensis and B．
occipitalis． Ｒes Bull Pl Prot Japan，38(4) : 73 － 80．
Ponchel F，Toomes C，Bransfield K，et al． 2003． Ｒeal-time PCＲ based
on SYBＲ-Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay
for a relative quantification of gene rearrangements， gene
amplifications and micro gene deletions． BMC Biotech，3: 18．
Tanriverdi S， Tanyeli A， Baslamish F， et al． 2002． Detection and
genotyping of oocysts of Cryptosporidium parvum by real-time PCＲ
and melting curve analysis． Journal of Clinical Microbiology，
40(9) : 3237 － 3244．
(责任编辑 朱乾坤)
56