全 文 ：第 50 卷 第 3 期
2 0 1 4 年 3 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 3
Mar．，2 0 1 4
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20140321
收稿日期: 2013 － 04 － 15; 修回日期: 2013 － 09 － 21。
基金项目: 新疆维吾尔自治区科技计划项目“特色林果重大病虫持续高效绿色防控技术研究”(201130102-3) ; 新疆维吾尔自治区重点学
科森林培育资助项目; 新疆维吾尔自治区林业有害生物防治检疫局项目“枣实蝇快速检测和监测技术研发”。
* 阿地力·沙塔尔为通讯作者。
枣实蝇 4 个地理种群的线粒体 Cytb基因序列分析*
程晓甜1 阿地力·沙塔尔1 张 伟2 李新泉1
(1. 新疆农业大学林学与园艺学院 新疆教育厅干旱区林业生态与产业技术重点实验室 乌鲁木齐 830052;
2. 新疆出入境检验检疫局技术中心 乌鲁木齐 830083)
关键词: 枣实蝇; Cytb;进化树; 亲缘关系
中图分类号: Q965 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)03 － 0144 － 07
Sequence Analysis of Mitochondrial Cytb Gene of Four Geographic
Populations of Carpomya vesuviana
Cheng Xiaotian1 Adil Sattar1 Zhang Wei2 Li Xinquan1
(1. Key Laboratory of Forestry Ecology and Industry Technology in Arid Region，Education Department of Xinjiang College of Forestry and
Horticulture，Xinjiang Agricultural University Urumqi 830052; 2. Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Urumqi 830083)
Abstract: In this study，PCR amplification and sequencing techniques were used to compare and analyze mitochondrial
Cytb gene sequences of four geographic populations (KSS，Turpan，HSX and HMS) of Carpomya vesuviana ，to explore
the genetic relationship among them． 469 bp fragments were obtained． The composition，specific site and base transition /
transversion frequency of the partial sequences of Cytb gene were analyzed． The frequencies of codon usage were calculated
and the phylogenetic tree was reconstructed． The results showed that KSS population has a relatively far genetic
relationship with Turpan population，HSX population and HMS population．
Key words: Carpomya vesuviana; Cytb; phylogenetic tree; genetic relationship
新入侵重大检疫性害虫枣实蝇 ( Carpomya
vesuviana )于 2007 年首次在吐鲁番地区发现，对该
地区枣 (Zizyphus jujuba)产业造成了毁灭性损失，且
疫情有向其他地区扩散的趋势。枣实蝇原产印度，
现已扩散至阿富汗、塔吉克斯坦、泰国、意大利等国
家(张润志等，2007)。枣实蝇以成虫产卵和幼虫蛀
食危害枣果，成虫产卵于果实表面，致使产卵孔周围
组织发育停止，形成凹陷或畸形。幼虫孵化后蛀食
果肉导致枣果早熟和腐烂，严重影响枣果品质及产
量。在印度枣实蝇是枣树最具毁灭性的害虫，已成
为影响枣树成功种植的限制因子 ( Lakra et al．，
1983)。国内最早由陈乃中(1998)对枣实蝇形态进
行了初步报道，张润志等 ( 2007 ) 以及吴佳教等
(2008) 对枣实蝇以及咔实蝇属的形态特征作了详
尽报道。然而有关枣实蝇分子方面仅有阿地力·沙
塔尔等(2012)对枣实蝇不同地理种群的亲缘关系
研究。因此对枣实蝇 4 个地理种群的线粒体 Cytb
基因序列分析，再次分析枣实蝇不同地理种群的亲
缘关系，从而更有力地说明枣实蝇 4 个不同地理种
群的亲缘关系，并为进一步设计特异性引物及研究
枣实蝇快速鉴定奠定基础。
动物 mtDNA 属母系遗传，为双链闭环结构，基
因序列组成相对保守，无重组和单拷贝，并易于检
测。昆虫 mtDNA 平均进化速率是单拷贝核 DNA 的
1 ～ 2 倍，长度为 1 514 ～ 1 613 kb，包括 12 ～ 13 个编
码蛋白质的基因。由于其结构和进化上的特点，
mtDNA 多被作为研究物种进化的重要分子标记(张
亚平等，1992; 施伟等，2004; Moritz et al．，1987)。
Cytb 基因在线粒体基因组中进化速度适中，一个较
短的片段就可以将种下水平以及科的水平的系统发
育信息包含在内，适合研究种内到种间甚至科间的
系统发育关系(Meyer et al．，1990)。在 mtDNA 各基
因中，Cytb 基因的结构和功能研究的比较清楚
(Moritz et al．，1987)，因其碱基序列稳定性较高而常
第 3 期 程晓甜等: 枣实蝇 4 个地理种群的线粒体 Cytb 基因序列分析
用于动物类群的系统进化和分类鉴定研究(任竹梅
等，2003)。在研究瓜实蝇等 8 种实蝇在 COⅠ与
Cytb 基因上的同源性时发现，总体在 COⅠ基因上
的同源性高于 Cytb 基因，COⅠ基因比 Cytb 基因要
保守，Cytb 基因的进化突变速率要快于 COⅠ基因
(胡剑，2008)。
本研究以吐鲁番市、KSS、HSX 和 HMS 4 个地方
枣实蝇作为研究对象，对 4 个不同地理种群的枣实
蝇 mtDNA Cytb 的序列特征及各种群间的遗传分化
水平和进化关系进行了分析，探讨了利用 Cytb 基因
序列开展枣实蝇分子鉴定的可行性，为下一步构建
枣实蝇的快速分子鉴定和检测技术积累了基础
资料。
1 材料与方法
1. 1 标本来源 试验材料为用 100% 酒精浸泡的
标本(蛹)，并进行形态鉴定。标本的采集地点、个
体数量和时间见表 1。
表 1 枣实蝇不同地理种群的标本采集地点、
个体数量以及采集时间
Tab. 1 Sampling locations，numbers of individuals
examined and sampling time of C． vesuviana
地点
Location
个体数量
Number
日期
Date
吐鲁番市 Turpan 30 2009 － 08
HSX 40 2010 － 09
KSS 30 2009 － 08
HMS 32 2010 － 09
1. 2 供试试剂 1) 引物参照 Simon(1994)设计的
通用引物，并由北京华大中生科技发展有限公司负
责合成，引物如表 2 所示。
表 2 枣实蝇 mtDNA Cytb 基因 PCR 和
测序引物(从 5到 3端)
Tab. 2 Primers used for PCR and sequencing of
mtDNA Cytb of C． vesuviana ( from 5 to 3 end)
引物
Primers
序列
Sequences
CB1 TATGTACTACCATGAGGACAAATAC
CB2 ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT
2) 酶及其他试剂 动物组织基因组 DNA 提取
试剂盒、琼脂糖、PCR 反应体系试剂 (10 × buffer、
dNTP 和 Mg2 + )、2 000 bp Ladder Marker Taq、酶、EB
均购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
1. 3 主要仪器 Biometra 定量梯度 PCR 仪 (华
粤)、TGL-1613 台式高速离心机 (上海)、DYY-12C
多功能电泳仪(北京市六一仪器厂)、D56-26M 型数
字图 像 分 析 仪 ( 北 京 市 六 一 仪 器 厂 )、Thermo
Nanodrop2000 超微量紫外分光光度计(北京科誉兴
业科技发展有限公司)、SANYOMLS-3750 全自动高
压灭菌仪 (上海中庸检验设备有限公司)、XMTD-
4000 水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)、超低温冰
箱 MDF -382 E (N)SANYO(上海中庸检验设备有限
公司)。
1. 4 试验方法 1) 枣实蝇基因组 DNA 的提取
应用北京庄盟国际生物基因科技有限公司研发的动
物组织基因组 DNA 提取试剂盒的相应方法来提取
基因组 DNA，按操作技术指南的步骤进行提取(阿
地力·沙塔尔等，2012)。
2) 目标片段 PCR 扩增 用引物 CB1 /CB2 对 4
个地区枣实蝇进行 PCR 扩增。
PCR 反应体系: DNA200 ng，TaqDNA 酶 2 U，
10 × PCR buffer5 μL，2. 5 mmol·L － 1 dNTP 3 μL，
25 mmol·L － 1 Mg2 + 4 μL，5. 0 mmol·L － 1正反引物各
1. 0 μL，加水至总体积 50 μL，阴性对照为 ddH2O。
PCR 扩增条件: 先 94 ℃预变性 3 min，再94 ℃
变性 1 min，44 ℃退火 1 min，72 ℃，90 s，36 个循
环，最后 72 ℃，6 min。在数字图像分析仪上取 PCR
产物 5 μL 在含溴化乙锭的 1. 5% 琼脂凝胶上电泳
30 min(90 V)检测结果(朱振华等，2005)。
3) 序列测定及数据分析 (1) 测序 将扩增
带亮度好、清晰且无非特异扩增的 PCR 产物进行测
序，正反链双向同时测定。测序由北京华大中生科
技发展有限公司完成。
(2 ) 枣实蝇 Cytb 基因序列比较分析 用
Chromas 软件校对测序之后序列的正反双链，根据
测序的荧光图谱对其进行修正。所得 Cytb 基因片
段来源于线粒体的编码区，通过无脊椎动物密码子
－反密码子系统对其进行翻译，未发现终止密码子，
所以所测序列不是假基因。用 Clustal X 多序列对
位排列程序对同源序列进行排序，并人工核对校正。
分子遗传学分析采用软件 MEGA4:不同地理种群枣
实蝇的进化分歧矩阵根据 Kimura 2-paramter 模型计
算得出; 构建分子系统发育树用未加权组对算术平
均法(UPGMA)和邻接法(NJ)，其中遗传距离用 P-
distance 模型。系统树各分支的置信度 ( boostrap)
均进行1 000次的重复检验(张长禹，2007)。
2 结果与分析
2. 1 PCR 扩增 Cytb 基因 由图 1 可见，有一清晰、
明亮的约 500 bp 的电泳条带，没有出现杂带，与预
期的结果相符合，从而说明 PCR 产物与引物设计的
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要求相符合。
图 1 CB1 /CB2 引物 PCR 模板 DNA 质量电泳分析
Fig． 1 Agarose gel electrophoresis analysis (GEA) of the quality
of DNA template with primer set CB1 /CB2
M: DL2000 DNA Marker; 1: 阴性对照 Control; 2: HSX 枣实蝇
HSX C． vesuviana;3: HMS 枣实蝇 HMS C． vesuviana;4: 吐鲁番市
枣实蝇 Turpan C． vesuviana;5: KSS 枣实蝇 KSS C． vesuviana．
2. 2 测序 对 Cytb 基因序列采用双向测序，并且
重复测定样品。从序列图分析可看出，在 500 bp 的
范围内的信号稳定、清晰，由此可说明送测的样品效
果较好。
2. 3 数据处理及分析 1) Cytb 基因序列的校正
4 个地理种群枣实蝇个体的 Cytb 基因序列用软件
Clustal X 和 DNAMAN 加以排序比较，从 474 bp 中
可以得到 469 bp 比较完整的序列片段。为了验证
Cytb 基因片断的正确性，将转换成 FASTA 格式后的
序列在 NCBI 数据库中( http: / /www． ncbi． nih． gov /
BLAST /)进行 Blastn 同源相似性搜索。分析结果表
明，试验所测得的序列为 Cytb 基因的部分序列(张
长禹，2007)。
2) 4 个地区枣实蝇 Cytb 基因序列 利用引物
CB1 /CB2 分别测定了 KSS、吐鲁番市、HMS 及 HSX
4 个地区枣实蝇的 mtDNA Cytb 基因约 500 bp 片段
序列，共获得 Cytb 基因序列 4 条，片段长度为 469
bp，其中吐鲁番市枣实蝇 Cytb 基因序列已录入
GenBank 数据库(序列号: JX101439)。
3) Cytb 部分序列组成的分析 用 Mega4. 0 软
件将比对结果进行格式转换后，然后分析 2 个引物
扩增所得的片段。其扩增获得的片段为 mtDNA
Cytb 编码区的片段，其长度为 468 bp。对所得的
Cytb 部分序列进行编码，可知前一氨基酸的第三位
密码子是 469 bp 序列的第 1 个碱基，所以将第 1 个
碱基去除再进行核苷酸序列翻译，从而进行分析的
有 468 个碱基(Simon et al．，1994)。扩增的 Cytb 部
分序列中，A + T 含量在第 3 位点占 55. 3%，在第 1
位点为 64. 8%，而在第 2 位点含量最高为 93. 1%，G
+ C 在第 2 位点含量最低仅占 6. 9%，而在第 3 位点
为 44. 7% (表 3)。
表 3 4 个不同地区的枣实蝇 Cytb 碱基组成百分比①
Tab. 3 The percent of base composition for the
Cytb gene of four places C． vesuviana
碱基
Bases
1 2 3 4 平均
Mean
T(U) 38. 5 38. 0 38. 5 38. 6 38. 3
C 17. 3 17. 3 17. 1 17. 3 17. 3
A 32. 9 33. 1 32. 9 32. 3 32. 8
G 11. 3 11. 5 11. 5 11. 8 11. 5
Total 468 468 468 468 468
T-1 42. 3 41. 7 42. 3 41. 7 42. 0
C-1 24. 4 24. 4 24. 4 24. 4 24. 4
A-1 23. 7 23. 7 22. 4 23. 1 23. 2
G-1 9. 6 10. 3 10. 9 10. 9 10. 4
#1 156 156 156 156 156
T-2 46. 2 45. 5 45. 5 44. 9 45. 5
C-2 5. 8 5. 8 5. 1 7. 7 6. 1
A-2 46. 8 48. 1 49. 4 46. 2 47. 6
G-2 1. 3 0. 6 0. 0 1. 3 0. 8
#2 156 156 156 156 156
T-3 27. 1 26. 9 27. 6 29. 5 27. 7
C-3 21. 9 21. 8 21. 8 19. 9 21. 3
A-3 27. 7 27. 6 26. 9 27. 6 27. 6
G-3 23. 2 23. 7 23. 7 23. 1 23. 4
#3 155 156 156 156 156
①1． HSX 枣实蝇 HSX C． vesuviana; 2． HMS 枣实蝇 HMS C．
vesuviana; 3．吐鲁番市枣实蝇 Turpan C． vesuviana; 4． KSS 枣实蝇
KSS C． vesuviana．
4) Cytb 基因碱基组成及特殊位点的分析 对
4 条已经测序的 Cytb 基因蛋白编码区 468 bp 进行
排列，其 Cytb 基因序列碱基组成如表 4 所示。由表
可知: 4 个地方枣实蝇 DNACytb 片段长度均为 468
bp。mtDNA Cytb 基因的碱基 T，C，A，G 的平均含量
分别为 38. 4%，15. 3%，32. 6%，11. 7%，KSS 枣实蝇
的 A + T 含量最低为 70. 8%，吐鲁番市枣实蝇和
HSX 枣实蝇的 A + T 含量最高达 71. 2%。总体来
讲，A + T 含量较高，G + C 的含量偏低，A + T 的平
均含量为 71. 0%，G + C 的平均含量为 29. 0%。
表 4 4 个不同地区的枣实蝇 Cytb 基因碱基组成
Tab. 4 Basic composition of mtDNA Cytb gene
from four places C． vesuviana
来源
Source
碱基组成 Base composition(% )
T C A G A + T C + G
合计
Total / bp
吐鲁番 Turpan 38. 4 17. 1 32. 8 11. 7 71. 2 28. 8 468
HSX 38. 5 17. 3 32. 7 11. 5 71. 2 28. 8 468
KSS 38. 6 17. 3 32. 2 11. 9 70. 8 29. 2 468
HMS 38. 0 17. 3 33. 0 11. 7 71. 0 29. 0 468
平均 Mean 38. 4 15. 3 32. 6 11. 7 71. 0 29. 0 468
Mega4. 0 软件的分析结果如表 5 所示: 在 Cytb
641
第 3 期 程晓甜等: 枣实蝇 4 个地理种群的线粒体 Cytb 基因序列分析
基因序列中有 41 个总变异位点，有 428 个保守位
点，有 2 个简约信息位点。但在第 2 位点发生的变
异占多数，是总变异位点的 62. 85%。共编码了 156
个氨基酸，其中发生变异的有 27 个，占氨基酸总数
的 17. 31% (孙娜等，2010)。
表 5 Cytb 基因的特殊位点
Tab. 5 The codon position-specific dynamics of the Cytb gene
碱基位置
Base position
变异位点
Variable sites
简约信息位点
Parsim-information sites
保守位点数
Conserved sites
自裔位点数
Singleton sites
第 1 位点 First site 3 1 154 3
第 2 位点 Second site 27 0 129 26
第 3 位点 Third site 11 1 145 10
总计 Total 41 2 428 39
5) 4 个不同地区的枣实蝇 Cytb 基因碱基转换和
颠换频率 如表 6 所示，在长度为 468 bp 的 Cytb 基
因序列中平均有 21 个位点发生了替换，其中转换数
为 15 个，颠换数为 6 个，其中 C 与 T 之间的转换率
(85. 7% )大于 A 与 G 之间的转换率(14. 3% )，而 T
与 A 之间的颠换率(80% )远大于其他碱基之间的颠
换率，T 与 G 之间的颠换率 0，A 与 C 之间的颠换率
20%。转换和颠换主要发生在第 2 和第 3 位点。
表 6 4 个不同地区的枣实蝇 Cytb 基因
碱基转换和颠换频率①
Tab. 6 Frequency of transition and transversion
from four places C． vesuviana
Domain Average 1st 2nd 3rd
ii 448 155 142 150
si 15 1 10 5
sv 6 1 4 1
R 2. 5 0. 7 2. 4 4. 7
TT 172 65 66 41
TC 6 0 3 2
TA 2 0 2 0
TG 0 0 0 0
CT 6 0 5 1
CC 74 38 5 32
CA 1 0 1 0
CG 0 0 0 0
AT 2 0 1 0
AC 0 0 0 0
AA 149 36 72 42
AG 1 0 0 1
GT 0 0 0 0
GC 0 0 0 0
GA 2 0 1 0
GG 53 17 0 36
Total 469 157 156 156
Positon Data 1st 2nd 3rd
① ii:相同碱基 The same base;si:转换碱基 Transition bases;sv:颠
换碱基 Transversion bases; R:si / sv．
6) Cytb 基因序列密码子的使用和氨基酸的组
成分析 通过 Mega4. 0 使用无脊椎动物线粒体密
码表，统计 4 个不同地区的枣实蝇的密码子使用频
率，从而推断 mtDNA Cytb 编码区的密码子的使用频
率(表 7)以及氨基酸组成 (表 8)。从表 7 和 8 可
知，密码子 UUC，UUG，CAG 等使用频率较高，分别
是 13. 5%，9. 0%，9. 0%。GUU，GUC，GUA，UCC，
CCU 等未出现。由氨基酸片断的分析数据可知，
Arg 和 Cys 使用频率为 0，Phe，Leu，Gln 等使用频率
较高分别是 12. 06%，22. 70%，12. 77%，这与孙娜
等(2010)的研究结果相符。
7) 4 个地区枣实蝇遗传距离 遗传距离最近
的是 HMS 和 HSX 枣实蝇，为 0. 011;遗传距离最远
的为 KSS 枣实蝇与吐鲁番市的枣实蝇，为 0. 082。
通过 BLAST 方法检索国外有代表性的咔实蝇属
mtDNA Cytb 基因序列，其标本名称及其登录号分别
为樱桃绕实蝇 Rhagoletis cerasi FJ571369. 1，蔷薇咔
实蝇 C． schineri R141 FJ571370. 1，蔷薇咔实蝇 C．
schineri R248 FJ571371. 1，与本试验中 4 个地区的枣
实蝇进行比对，结果见表 9 (阿地力·沙塔尔等，
2012)。
8) 聚类分析 以同属于双翅目的樱桃绕实蝇、
蔷薇咔实蝇 isolate R141 和蔷薇咔实蝇 isolate R248
为外群，利用邻接法(NJ)和未加权组对算术平均法
(UPGMA)构建分子系统聚类图 (图 2，3)。由聚类
分析可知: 由 2 种方法得到的聚类图的拓扑结构基
本一致，相同种类不同个体的实蝇都各自聚为一支，
一般都在 90% 以上，置信度较高。在系统树中，吐
鲁番市、HSX 和 HMS 枣实蝇先聚在一起，然后与分
别来自 2 个不同地方的蔷薇咔实蝇聚为一支，再与
KSS 枣实蝇相聚。最后，整个咔实蝇属的这 2 种实
蝇再与樱桃绕实蝇聚在一起。对外群分析发现，2
种方法构建的聚类图均能够把樱桃绕实蝇与枣实蝇
分开，且外群亲缘关系基本符合其阶元划分，从而可
知外群选择的正确性。2 种聚类图表明 KSS 枣实蝇
与吐鲁番市、HSX、HMS 枣实蝇亲缘关系较远。
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林 业 科 学 50 卷
表 7 Cytb 基因片段的密码子频率①
Tab. 7 Codon frequency in Cytb gene %
UUU(F) 3. 5(0. 41) | UCU( S) 1. 0(2. 00) | UAU(Y) 7. 5(1. 07) | UGU(C) 0. 0(0. 00) |
UUC(F)13. 5(1. 59) | UCC( S) 0. 0(0. 00) | UAC(Y) 6. 5(0. 93) | UGC(C) 0. 0(0. 00) |
UUA(L) 8. 0(1. 55) | UCA( S) 1. 0(2. 00) | UAA( * ) 8. 0(1. 12) | UGA(W) 0. 0(0. 00) |
UUG(L) 9. 0(1. 74) | UCG( S) 1. 3(2. 50) | UAG( * ) 6. 3(0. 88) | UGG(W) 0. 0(0. 00) |
CUU(L) 8. 0(1. 55) | CCU(P) 0. 0(0. 00) | CAU(H) 5. 5(2. 00) | CGU(R) 0. 0(0. 00) |
CUC(L) 2. 8(0. 53) | CCC(P) 0. 3(1. 33) | CAC(H) 0. 0(0. 00) | CGC(R) 0. 0(0. 00) |
CUA(L) 3. 3(0. 63) | CCA(P) 0. 3(1. 33) | CAA(Q) 8. 8(0. 99) | CGA(R) 0. 0(0. 00) |
CUG(L) 0. 0(0. 00) | CCG(P) 0. 3(1. 33) | CAG(Q) 9. 0(1. 01) | CGG(R) 0. 0(0. 00) |
AUU( I) 7. 3(1. 07) | ACU(T) 1. 0(0. 76) | AAU(N) 2. 8(1. 47) | AGU( S) 0. 0(0. 00) |
AUC( I) 6. 3(0. 93) | ACC(T) 1. 8(1. 33) | AAC(N) 1. 0(0. 53) | AGC( S) 0. 0(0. 00) |
AUA(M) 6. 5(1. 53) | ACA(T) 2. 5(1. 90) | AAA(K) 3. 5(1. 56) | AGA( S) 0. 0(0. 00) |
AUG(M) 2. 0(0. 47) | ACG(T) 0. 0(0. 00) | AAG(K) 1. 0(0. 44) | AGG( S) 0. 8(1. 50) |
GUU(V) 0. 0(0. 00) | GCU(A) 0. 3(4. 00) | GAU(D) 6. 5(1. 68) | GGU(G) 0. 0(0. 00) |
GUC(V) 0. 0(0. 00) | GCC(A) 0. 0(0. 00) | GAC(D) 1. 3(0. 32) | GGC(G) 0. 0(0. 00) |
GUA(V) 0. 0(0. 00) | GCA(A) 0. 0(0. 00) | GAA(E) 1. 0(0. 30) | GGA(G) 0. 3(2. 00) |
GUG(V) 1. 0(4. 00) | GCG(A) 0. 0(0. 00) | GAG(E) 5. 8(1. 70) | GGG(G) 0. 3(2. 00) |
①使用的序列有 4 条 4 sequences is used: 吐鲁番市枣实蝇 Turpan C． vesuviana，HSX 枣实蝇 HSX C． vesuviana，HMS 枣实蝇 HMS C．
vesuviana; KSS 枣实蝇 KSS C． vesuviana．
表 8 Cytb 基因部分片段氨基酸组成①
Tab. 8 AA composition in Cytb gene
AA 1 2 3 4 平均 Mean
Ala 0. 00 0. 00 0. 00 0. 70 0. 18
Cys 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
Asp 5. 67 5. 63 5. 63 4. 93 5. 47
Glu 5. 67 3. 52 4. 93 4. 93 4. 76
Phe 12. 06 11. 97 11. 97 11. 97 11. 99
Gly 0. 00 0. 70 0. 00 0. 70 0. 35
His 4. 26 4. 23 3. 52 3. 52 3. 88
Ile 9. 22 9. 86 9. 15 9. 86 9. 52
Lys 2. 84 3. 52 3. 52 2. 82 3. 17
Leu 22. 70 22. 54 22. 54 19. 72 21. 87
Met 5. 67 5. 63 5. 63 7. 04 6. 00
Asn 2. 84 2. 11 2. 82 2. 82 2. 65
Pro 0. 00 0. 70 0. 70 0. 70 0. 53
Gln 12. 77 12. 68 12. 68 11. 97 12. 52
Arg 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
Ser 1. 42 2. 11 2. 11 5. 63 2. 82
Thr 4. 26 4. 23 4. 23 2. 11 3. 70
Val 0. 71 0. 70 0. 70 0. 70 0. 71
Trp 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
Tyr 9. 93 9. 86 9. 86 9. 86 9. 88
Total 141 142 142 142 141. 8
①所有频率都以百分比表示 All frequencies are given in percent．
AA: 氨基酸名称 Name of amino acids． 1 ． 吐鲁番市枣实蝇 Turpan C．
vesuviana;2． HSX 枣实蝇 HSX C． vesuviana;3． HMS 枣实蝇 HMS C．
vesuviana;4． KSS 枣实蝇 KSS C． vesuviana．
3 小结与讨论
3. 1 对序列组成及变异位点的讨论 本研究测定
的 4 个不同地理种群的枣实蝇 mtDNA Cytb 部分序
列基因的 碱 基 T，C，A，G 的平均含量 分别为
表 9 4 个地区枣实蝇遗传距离①
Tab. 9 Genetic distance of four areas of
C． vesuviana (Kimura 2-parameter)
1 2 3 4 5 6 7
1
2 0. 022
3 0. 024 0. 011
4 0. 052 0. 038 0. 026
5 0. 052 0. 038 0. 026 0. 000
6 0. 082 0. 072 0. 070 0. 072 0. 072
7 0. 152 0. 140 0. 125 0. 126 0. 126 0. 133
① 1． 吐鲁番市枣实蝇 Turpan C． vesuviana; 2． HSX 枣实蝇
HSXC． vesuviana; 3． HMS 枣实蝇 HMS C． vesuviana; 4． KSS 枣实蝇
KSS C． vesuviana; 5． FJ571369. 1 樱 桃 绕 实 蝇 Rhagoletis cerasi;
6． FJ571370. 1蔷薇咔实蝇 C． schineri; 7． FJ571371. 1 蔷薇咔实
蝇C． schineri．
图 2 利用 NJ 法构建 mtDNA Cytb 基因序列的聚类图
Fig． 2 Dendrogram based on NJ analysis of mtDNA Cytb
1．吐鲁番市枣实蝇 Turpan C． vesuviana; 2． HSX 枣实蝇 HSX C．
vesuviana; 3． HMS 枣实蝇 HMS C． vesuviana; 4． KSS 枣实蝇 KSS C．
vesuviana; 5． FJ571369. 1 樱 桃 绕 实 蝇 Rhagoletis cerasi; 6．
FJ571370. 1 蔷薇咔实蝇 C． schineri; 7． FJ571371. 1 蔷薇咔实蝇 C．
schineri．下同 The same below． ．
841
第 3 期 程晓甜等: 枣实蝇 4 个地理种群的线粒体 Cytb 基因序列分析
图 3 利用 UPGMA 法构建 mtDNA Cytb 基因序列的聚类图
Fig． 3 Dendrogram based on UPGMA analysis of mtDNA Cytb
38. 4%，15. 3%，32. 6%，11. 7%，吐鲁番市枣实蝇和
HSX 枣实蝇的 A + T 含量最高为 71. 2%，KSS 枣实
蝇的 A + T 含量最低为 70. 8%，A + T 的平均含量为
71. 0%，而 G + C 的平均含量为 29. 0%，从而可以看
出 A + T 的含量明显地高于 G + C 的含量，这与昆虫
线粒体 DNA 的 A + T 偏倚性结论(Lunt et al．，1996)
一致。
在特异性位点上 Cytb 序列 A + T 含量在第 3 位
点占 55. 3%，而在第 2 位点最高含量到 93. 1%，在
第 1 位点为 64. 8% ;G + C 在第 3 位点占 44. 7%，在
第 2 位点含量最低，仅 6. 9%。所以，密码子的碱基
使用频率存在明显的偏向性，与典型的昆虫线粒体
DNA 碱基组成一致(Simon et al．，1994)。Cytb 基因
序列的总变异位点为 41 个，简约信息位点为 2 个，
428 个保守位点，但在第 2 位点发生变异的为多数，
占总变异位点 62. 85% ;共编码 156 个氨基酸，其中
有 27 个发生变异，占总氨基酸的 17. 31%。
3. 2 对碱基替换的讨论 替换现象会发生在 DNA
序列 进 化 过 程 中，包 括 转 换 和 颠 换。转 换
( transition) 是指一个嘌呤被另一个嘌呤，或者是一
个 嘧 啶 被 另 一 个 嘧 啶 替 代; 而 碱 基 颠 换
( transversion) 则是在碱基置换中嘌呤与嘧啶之间
的替代。
在长度为 468 bp 的 Cytb 基因序列中平均有 21
个位点发生了替换，其中转换数为 15 个，颠换数为
6 个，其中 C 与 T 之间的转换率(85. 7% )大于 A 与
G 之间的转换率(14. 3% );而 T 与 A 之间的颠换率
(80% )远大于其他碱基之间的颠换率，T 与 G 之间
的颠换率 0，A 与 C 之间的颠换率 20%。颠换和转
换主要发生的部位是第 2 及第 3 位点。颠换主要以
T 与 A 之间为主，转换主要以 T 与 C 之间为主，且
颠换率低于转换率，在密码子第 3 位点发生的颠换
占绝大多数，这与密码子第 3 位点的 A + T 含量高
可能有关。这也与脊椎动物普遍结论相一致，是进
化分歧时间较短的表现( IrWin et al．，1991)。关于
氨基酸序列变异与高 A + T 含量是否存在显著的相
关性仍存在着争议(刘运强等，2001; Hugall et al．，
1997)。
3. 3 氨基酸组成和密码子使用频率特征 对 4 个
不同地区的枣实蝇的密码子使用频率进行统计，推
断出密码子 UUC，UUG，CAG 等使用频率较高，分别
是 13. 5%，9. 0%，9. 0%。GUU，GUC，GUA，UCC，
CCU 等未出现。在氨基酸片断的分析数据中 Arg
和 Cys 使用频率为 0。Phe，Leu，Gln 等使用频率较
高，分别是 12. 06%，22. 70%，12. 77%。
3. 4 遗传距离 遗传距离最近的是 HMS 和 HSX
枣实蝇，为 0. 011，遗传距离最远的为 KSS 枣实蝇与
吐鲁番市的枣实蝇，为 0. 052。
3. 5 建树方法 以同属于双翅目的樱桃绕实蝇、蔷
薇咔实蝇 isolate R141、蔷薇咔实蝇 isolate R248 为
外群，利用未加权组对算术平均法(UPGMA)和邻接
法(NJ)构建分子系统聚类图 (图 2，3)。由聚类分
析可知 2 两种方法得到的聚类图的拓扑结构基本一
致。在系统树中，吐鲁番市，HSX 和 HMS 枣实蝇先
聚在一起，然后与分别来自 2 个不同地方的蔷薇咔
实蝇聚为一支，整个咔实蝇属的 2 种实蝇再与樱桃
绕实蝇聚在一起。对外群分析发现，2 种方法构建
的聚类图均能够把樱桃绕实蝇与枣实蝇分开，且外
群亲缘关系基本符合其阶元划分，可以看出本试验
所选的外群是正确性。2 种聚类图表明 KSS 枣实蝇
与吐鲁番市、HSX、HMS 枣实蝇亲缘关系较远，这与
阿地力·沙塔尔等(2012)的研究结果一致。
在 Cytb 基因上的遗传分化及进化突变速率要
比 COI 基因上的快一些，这与 Simon 等(1994)的研
究结果一致。因此，在研究枣实蝇的地理种群结构
中，以 Cytb 基因作为分子标记比 COI 基因可能要灵
敏，但区分不会太大。要探测枣实蝇种群因地理条
件、寄主、气候等因素而呈现出的进化上的细微分
化，仍需结合 SSR(简单序列重复)等方法。
参 考 文 献
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(责任编辑 朱乾坤)
中国林学会开展第五届梁希青年论文奖评选活动
(申报截止日期:2014 年 5 月 30 日)
为进一步激发广大林业青年科技工作者的积极性和创造性，鼓励科技创新，促进科技人才成长，推动林
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