全 文 ：第 !" 卷 第 #$ 期
% $ # $ 年 #$ 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1#$
2345!% $ # $
苹果属观赏海棠 H&1V(基因的克隆及
不同叶色品种间表达差异分析!
耿6慧6沈红香6姚允聪6田6佶6宋婷婷
"北京农学院植物科技学院6北京 #$%%$"#
摘6要!6以苹果属观赏海棠品种.王族/叶片提取的总 I*,为模板!通过 I+Y:’I与 I,’)扩增!获得 # 条 ""$ TR
的查尔酮异构酶"’\(#基因的全长 3D*,序列!编码 %#7 个氨基酸!命名为 H&1V($ 该基因 D*,序列全长 # #@$
TR!由 8 个内含子和 ! 个外显子组成!具有 1V(基因的典型结构$ 采用实时荧光定量 :’I和紫外可见光分光光度
计法!对 8 类不同叶色类型的观赏海棠品种 .火焰/ "绿色类叶片#(.绚丽/ "新叶有色类红色叶片#(.高原之火/
"新叶有色类红色叶片#和.王族/"常色叶类紫色叶片#幼叶和功能叶中的 H&1V(表达及其花色苷含量进行测定分
析!结果表明% H&1V(在 ! 个品种的幼叶和功能叶中均有表达!其表达量与花色苷积累随品种不同和叶龄不同表现
出明显差异$
关键词%6苹果属观赏海棠& 叶片& H&1V(& 基因表达& 花色苷含量
中图分类号! &?#@1!"’ B7!81%666文献标识码!,666文章编号!#$$# =?!@@"%$#$##$ =$$!% =$@
收稿日期% %$$7 =$@ =%!& 修回日期% %$$7 =$7 =%!$
基金项目% 国家自然科学基金项目"8#$?#?@A# & 北京市人才强教+++拔尖创新人才计划项目":mX%$$?s$#!%$?s$!!A"$# & 北京市农业科
技项目"%$$?$#$## & 北京市科技新星人才培养项目"%$$"F%A# $
!姚允聪为通讯作者$
I*#/-/9 #40%!:;X(/(#40"#)*I5&,&%%*(&/32’$QU%5($$-#/;/&*0$-$-/
’"(I+*’-K&5$>-’"Y-44(5(/’B0%(Z#*-&5I#*#5
WMN<\JH6&LMN \/N"J6$)*F&+")&"$)? U"&’)-6-501-6"5"!3"+4+)5 I)+G"%#+*0-.25%+&,6*,%"63"+4+)5 #$%%$"#
;,$’5&<’%6iH4L 4LM4/490I*,>S/;0M9[MP/>H$6,#3S9T9RR0M.I/V904V/ 9P4LM4M;R094M!9>J03D*,/>1V("3L903/NM
HP/;MS9PM# 9;R0H>H394H/N />3D*,MNUP"I,’)#5+LM%#7 9;HN/93HUP5+LM
3/SSMPR/NUHN1V(MQRSMPPH/N />H&1V(9NU 4LM3/N4MN4/>9N4L/3V9NHN ZMSMUM4MS;HNMU TVSM90Y4H;M]J9N4H494H[M:’I9NU PRM34S/RL/4/;M4MS
SMPRM34H[M0VHN 4LM;94JSM9NU V/JN<0M9[MP/>HM.a09;M/ "#! HM.I9UH9N4/ "SMU V/JN<0M9>
9NU #! HM.:S9HSH>HSM/ "SMU V/JN<0M9>9NU #! HM.I/V904V/ " RJSR0MV/JN<9NU ;94JSM
0M9>#5+LMSMPJ04PPL/ZMU 4L94H&1V(Z9PMQRSMPPMU HN T/4L ;94JSM0M9[MP9NU V/JN<0M9[MP/>4LM9T/[M>/JS3J04H[9SP!
TJ44LMMQRSMPPH/N 0M[M0PZ9PMSMN494UH>MSMN40M9>9=(0 >#53$%6 H$6,#3S9T9RR0MP& 0M9>& H&1V(&66蔷薇科 "I/P93M9M#苹果属 "H$6,##观赏海棠
"H$6,#3S9T9RR0M#!是由起源于中国的山荆子 "HM
8$&&$*$#(多花海棠 "HM.6-%+8,)?$ #(海棠花 "HM
#:"&*$8+6+##等和起源于北美的奥涅海棠"HM.,#&$#(
草原海棠"HM+-")#+##(野香海棠 "HM&-%-)$%+$#等
为亲本选育而成$ 其树形紧凑(叶花果色彩多样(部
分品种冬果宿存!抗逆性强!是一类极具观赏价值的
园林植物资源!其叶色有绿色类(新叶有色类和常色
紫叶类 8 大类品种资源$ 研究表明!植物的色泽发
育和植物类黄酮代谢及花青素合成紧密相关"韩科
厅等!%$$@ #$ 查尔酮异构酶 "3L903/NMHP/;MS9PM!
’\(# 是 类 黄 酮 代 谢 途 径 中 继 查 尔 酮 合 成 酶
"3L903/NMPV4L9PM!’\&#后的第 % 个关键酶!它催化
黄色的苯基苯乙烯酮 " TMNKV0HUMNM93M4/RLMN/NM#转
变成无色的黄烷酮">09[9N/NM#!进而衍生出该途径
中所有的类黄酮化合物$ XMLUV等 "#7@?#采用抗
体技术从法国豌豆"T+&+$ )$%8-)")#+##中分离出 1V(
基因$ [9N +JNMN 等"#7@@#以相同的方法在矮牵牛
6第 #$ 期 耿6慧等% 苹果属观赏海棠 H&1V(基因的克隆及不同叶色品种间表达差异分析
"J"*,)+$ ’08%+?$#中得到 1V($ 后来!研究者用同源
克隆的方法相继在拟南芥"2%$8+?-:#+#*’$6+$)$#(菜
豆"J’$#"-6,#G,65$%+## "i//U "*$65! #77! #(苜蓿
"H"?+&$5-#$*+G$#(翠菊 "1$6+#*":’,#&’+)")#+##(橙
"1+*%,##+)")#+##(烟草 "Y+&-*+$)$ *$8$&,9#和玉米
"["$ 9$0##等多种植物中克隆得到该基因的全长序
列!并对其结构特征和表达特性进行了研究 "吴冰
等!%$$@#$ 然而!在多色型观赏海棠植物中还未见
到该基因的相关报道$ 本文在克隆获得苹果属观赏
海棠叶片查尔酮合成酶"H&1VF#(黄烷酮 8 "羟化
酶"H&/8V#和花色素合成酶"H&2YF#基因的基础
上"WMNF9N^ 登陆号分别为% aG@#?!@A!aG@#?!@" 和
aG@#?!@@ #! 拟从常色紫叶类品种 .王族 / "H5
.I/V904V/#中克隆获得查尔酮异构酶基因!并对该
基因及其编码蛋白序列进行分析!同时!采用实时荧
光定量 :’I技术和分光光度计技术分别对不同叶
色类型品种叶片中查尔酮异构酶基因表达量和花色
苷含量进行检测和分析!以期为苹果属观赏海棠叶
色形成的分子机制研究提供理论基础$
#6材料与方法
?@?A试验材料
以苹果属观赏海棠品种中具有典型叶色的 ! 个
品种为试验材料!叶片为绿色类的 .火焰 / "H5
.a09;M/#& 幼叶红色(功能叶为绿色的新叶有色类
.绚 丽 / "H M.I9UH9N4/# 和 .高 原 之 火 / " H5
.:S9HSH>HSM/#& 叶片为紫色的常色叶类.王族/$ 这 !
个品种均是从美国直接引进的品种!其亲本不详$
于 %$$@ 年春季!选取树势和生长势相似的植株!采
枝条顶端萌芽后 ? 天的幼叶和枝条 A+" 节处萌芽
A$ 天的功能叶!液氮速冻后! =@$ d条件下保存
备用$
?@DA总 1];的提取及 用改良热硼酸法"陆旺金等!%$$8#提取.王族/
幼叶 总 I*,! 以 提 取 的 总 I*, 为 模 板! 利 用
’0/N4M3L &X,I++X-HTS9SV试剂盒 "购自 ’0/N4M3L 生
物有限公司#合成 8/I,’)和 A/I,’)3D*,第 #
链$ 采用 ’+,F法"iH0H9;P/N "*$65!#77!#提取.王
族/叶片总 D*,$
?@EA观赏海棠 0%!:;基因序列的克隆
以上述提取得到的.王族/叶片 3D*,为模板!
根据 WMNT9N^ 上登录的近缘植物查尔酮异构酶基因
保守区段序列!设计 8 /端引物 ’\(:#% ’,’’WWW
OW’’+’+,++’+!扩增 H&1V(基因的 8/端序列& 设
计 A / 端引物 ’\(:%% ’,+++,’,’’’W++’,,+,
W++W!扩增 H&1V(基因的 A/端序列$ b:X通用引
物由 I,’)试剂盒提供!根据试剂盒说明!转录产物
的 8/末端用 ’\(a8 和 b:X引物扩增!其 :’I反应
条件为% 7! d预变性 A ;HN& 7! d变性 # ;HN!AA d
退火 8$ P!?% d延伸 % ;HN!8$ 个循环& ?% d延伸
A ;HN$ 转录产物的 A/末端使用 ’\(I8 和 b:X引
物扩增!其 :’I反应条件为% 7! d预变性 A ;HN&
7! d变性 # ;HN!AA d退火 8$ P!?% d延伸 # ;HN!
8$ 个循环& ?% d延伸 A ;HN$ :’I产物经回收(纯
化!与 RXD#7Y+.M34/S"购自宝生物工程公司#连
接!转化 D\A4感受态细胞!蓝白斑筛选后测序"上
海生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 #$ 用
D*,X,*A1%1% 软件拼接以上序列得到苹果属观赏
海棠查尔酮异构酶基因全长 3D*,序列$
?@FA观赏海棠 0%!:;基因 列的获得
设计全长引物 ’\(a% ,+WW’+’’,’’,’’,+
’W’+和 ’\(I% +’,+++,’,’’’W++’,,+,W++W
WW!以上述提取得到的 .王族/叶片 3D*,和 D*,
为模板! 扩 增查 尔酮 异 构酶 基因 的 全 长 序 列
"X3EL9NN "*$65!#77!#$ :’I反应条件为% 7! d预
变性 A ;HN& 7! d变性 # ;HN!"# d退火 8$ P!?% d
延伸 % ;HN!8$ 个循环& ?% d延伸 A ;HN$ :’I产物
经回收(纯化!与 RXD#7Y+.M34/S"购自宝生物工程
公司#连接!转化 D\A4感受态细胞!蓝白斑筛选后
测序"上海生工生物工程技术服务有限公司#$
?@GA实时荧光定量 !I1分析
分别提取 .绚丽/( .火焰/( .高原之火/( .王
族/ ! 个品种的幼叶和功能叶 I*,"陆旺金等!
%$$8#!使用 XYXJ-.aHSP43D*,&VN4LMPHPEH4"购自
:S/;M<9公司#合成第 # 链 3D*,备用$
按照 IM90X9P4MSXHQ"&OFIWSMMN# :’I试剂
盒"购自天根生化科技有限公司#操作指南!采用实
时荧光定量 :’I"SM90Y4H;M]J9N4H494H[M:’I!I+Y
]:’I#的方法!检测基因的相对表达量$ 扩增目标
基因 H&1V(引 物 为 ’\(Ya% ’’W++’,,+,W++W
WW,+,,和 ’\(YI% +’’+,,,WW,+’,’+’,’W!预
测产物 长度 是 #@# TR& 以 H$6,#?-9"#*+&$ #@&
%+8-#-9$6!Y2基因"WMNF9N^ 序列号%DB8!#8@%#作
为内 参 基 因! 其 引 物 #@&IYa% ,’,’WWWW,WW
+,W+W,’,, 和 #@&IYI% ’’+’’,,+WW,+’’+’
W++,!预测产物长度是 @$ TR$
对反转录所得的 3D*,按体积分别进行 A 个梯
度稀释"#!#h#$!#h#$$!#h# $$$!#h#$ $$$#!实施荧
光定量反应!然后绘制相对标准曲线$ H&1V(基因
8!
林 业 科 学 !" 卷6
I+Y]:’I扩增的反应体系为 %$ 5-!包括%7 5-IM90
X9P4MSXHQ混合液!% 5-3D*,!# 5-a8\Ya" #$
5;/0’-=# #! # 5-a8\YI " #$ 5;/0’-=# #! ? 5-
UU\%2$ 反应程序为% 7! d预变性 % ;HN&7! d变
性 %$ P!A$ d退火 8$ P!?% d延伸 8$ P!!$ 次循环!
每次循环第 8 步进行荧光采集& 最后 7A d变性
# ;HN!退火至 AA d"每隔 #$ P上升 $1#A d#后保温
# ;HN$ 接着检测其荧光值!绘制熔点曲线$ 内参基
因的 #@& SI*,:’I扩增的反应体系为 %$ 5-!包
括% 7 5-IM90X9P4MSXHQ混合液!% 5-3D*,!# 5-
#@&IYa"#$ 5;/0’-=# #!# 5-#@&IYI " #$ 5;/0’
-=##!? 5-UU\%2$ 其反应程序同 H&1V(基因的反
应程序相同$ 标准品 3D*,和待测样品均设置 8 次
重复$
?@SA花色苷含量测定
花色苷相对含量的提取根据何亦昆等"#77A#的
方法略有改动$ 称取 #1$ <叶片剪碎"% ‘8 ;;#!置
于 A$ ;-离心管中!加入 #$ ;-# #的盐酸甲醇!常
温下浸泡 %$ L$ 取上清液!以提取液作空白!采用
b*(’2b.Y%#$$ 型紫外可见分光光度计在 A8$ N;
处测定吸光度$ 以每克鲜质量叶片的提取液的光密
度变化值 2DA8$ f$1# 作为 # 个花色苷单位$
%6结果与分析
D@?A0%!:;基因的克隆与序列比较
依据得到的保守片断设计 A / 和 8 / 末端的
I,’)引物$ 用引物对 b:Xh’\(:% 进行 H&1V(的
A/末端的扩增反应!在琼脂糖凝胶电泳中显现出
8$$ TR 和 AA$ TR 左右 % 条目的条带"图 #,!右#!将
AA$ TR 左右的条带回收(测序!获得 # 条 ’\(的 A/
3D*,末端$ Ao端 I,’)出现长度多态性现象主要
是由于转录起始位点多态性造成的$ 用引物 b:Xh
’\(:# 进行 H&1V(的 8 / 末端扩增!获得 # 条约
8$$ TR的带"图 #,!左#!克隆入 +=载体!挑选 " 个
长度有代表性单克隆测序!获得到 # 条 1V(的 8/
3D*,末端$ 以上述片断进行 F09P4分析!确认其与
其他植物 1V(基因同源$ 根据 8/I,’)和 A/I,’)
测序结果拼读出苹果属观赏海棠查尔酮异构酶基
因!全长序列为 ""$ TR!命名该基因为 H&1V("登陆
号 aG@#?!@A#$
基因组扩增得到约 # %$$ TR 的条带!拼接后得
到全长序列 # #@$ TR "图 #F#$ 分析发现!H&1V(存
在 8 个内含子!结果与大多数物种一致"图 #’#$ 将
起始 密 码 子 ,+W 定 义 为 C# 位! 分 别 位 于
C#$? TR ‘C%#$ TR"内含子 ##! C8?" ‘C?$! TR
"内含子 %#! C7%7 ‘C# $$7 TR"内含子 8#$ 内含
子 =外显子边界均符合)W+=,W*规则$ 第 # 个内
含子中没有任何重复序列& 第 % 个内含子中存在 !
个直接重复序列和 # 个镜像重复序列& 第 8 个内含
子同样没有任何重复序列!但是第 8 个内含子与大
豆">60&+)"9$=#的内含子有较高的同源性!而其他
内含子却保持了较高的物种特异性$
图 #6H&1V(基因的扩增结果及结构分析
aH<5#6+LM:’ISMPJ04P9NU P4SJ34JSM9N90VPHP/>H&1V(
,1H&1V(基因的 8/I,’)和 A/I,’):’I扩增结果& F1H&1V(基因 3D*,和 D*,全长 :’I扩增结果& ’1H&1V(基因 D*,序列的结构$
,1+LM:’ISMPJ04P/>8/I,’)9NU A/I,’)>/SH&1V(& F1+LM:’ISMPJ04P/>3D*,9NU D*,>J00MN<4L >/SH&1V(& ’1+LMD*,PM]JMN3M
P4SJ34JSM/>H&1V(5
66对该基因的序列进行分析表明!其含有 # 个编
码 %#7 个氨基酸的完整阅读框架!包括起始密码子
和终 止 密 码 子$ 利 用 D*,X,*A1%1% 软 件! 对
H&1V(编码的氨基酸序列分析!认为该基因具有起
始密码子",+W#和终止密码子"+W,#!是苹果属观
赏海棠查尔酮异构酶基因的 2Ia序列"图 %#$
根据 (N4MS:S/&39N 和 &X,I+在线软件对编码
氨基酸分子量(编码蛋白的结构域和功能位点进行
分析 表 明! H&1V(2Ia编 码 的 %#7 个 氨 基 酸
"R(A1AA#的分子量约为 %81! ^J!其编码的蛋白具有
典型的 ’\(蛋白保守结构域% 第 # 个是生物素和维
生素 F# 合成相关结构域"从 &MS?7到 :S/#!@ #$ 生物
!!
6第 #$ 期 耿6慧等% 苹果属观赏海棠 H&1V(基因的克隆及不同叶色品种间表达差异分析
素合成酶是一种同型二聚体!能促进生物素生物合
成途径中的最后一步反应!而硫胺素合成同样是一
个复杂的过程!涉及 U’+/F>V(U’+(和 U’+e等 " 个基
因产物$ 推测这 % 种反应可能由共同因素制约!在
1V(的这一相关结构域可能参与共同影响因子结合
或二聚作用$ 第 % 个是染色体结合区域"从 ,PN#@%
到 -MJ%#A#!发现这一区域是不同的核蛋白质参与染
色体组织活动的 D*,结合结构域$ 第 8 个是螺
旋 =发夹 =螺 旋 D*, 结 合 区 域 " 从 W0J#7# 到
,S<%#$#!该区域是原核和真核非序列特异性 D*,结
合蛋白中的 # 个约 %$ 个氨基酸结构域!尽管氨基酸
序列相似!但其螺旋结构是不同$ 螺旋 =发夹 =螺
旋结构之间的差异也反映在这一结构域的功能级别
上!其不同点可能主要表现在基因调控蛋白与 D*,
序列结合的具体方式上$
图 %6苹果属观赏海棠 H&1V(基因 3D*,的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
aH<5%6+LM3/;R0M4M3D*,PM]JMN3M/>H&1V(9NU H4PRSMUH34MU 9;HN/93HU PM]JMN3M
起始密码子和终止密码子用下划线表示!阴影和黑框表示保守域$ +LM4S9NP094H/N P49S4
3/U/N 9NU 4LMP4/R 3/U/N 9SMHNUH394MU HN JNUMS0HNM& +LMPL9U/Z9NU T093^ T/Q9SM>JN34H/N90
U/;9HN5
66用 &2:X,对 X3’\(蛋白的二级结构预测表
明!X3’\(蛋白也主要由4=螺旋"4YLM0HQ#(随机卷
曲 "S9NU/; 3/H0#( 6=转 角 "6Y4JSN # 和 延 伸 链
"MQ4MNUMU P4S9NU#组成"图 8#$ 在二级结构中!4=
螺旋均匀分布于蛋白的中部和 ’=端$ X3’\(蛋白
由 !858@_的 4=螺旋(%$1AA_的延伸链("1@A_的
6=转角和 %71%%_的随机卷曲组成$ 而已知结构
和功能的葡萄 "T+*+#G+)+."%$#’\(蛋白 .[’\(的二
级结构 " &2:X,显示 # 由 !!5@?_的 4=螺旋(
%$1A#_的延伸链("1@!_的 6=转角和 %?1?@_的
随机卷曲组成$ 由此可见!X3’\(与 .[’\(蛋白的
二级结构十分类似$
以 .[’\("m:s$$%%@%#$@ # 为模型!用 &ZHPPY
X/UM0对 X3’\(蛋白进行三级结构的同源建模!所
得到的结果都与已知结构和功能的葡萄 ’\(蛋白
的三级结构很类似"图 !#$ X3’\(蛋白的结构符合
%2WYaM((s2QV氧化酶的特征结构$ 二级结构预测
的结果支持三级结构的预测!*=末端及其中部的
多个 4=螺旋组成)果冻*结构的重要骨架!而延伸
链则主要位于内部!组成缺口的表面$ 由结构的相
似性可以推知 X3’\(可能具有与 .[’\(相似的生
物学功能$
D@DA苹果属观赏海棠 0%!:;的同源性及进化
分析
利用 D*,X,*A1%1% 软件进行多重序列比对
"图 !#发现!1V(基因的 2Ia有一定的特异性!但
功能结构域也高度保守!显示了查尔酮异构酶进化
的保守性$ 利用 X)W,!5$ 软件!对 H&1V(编码蛋
白与已知植物 ’\(结构域蛋白进行进化树"图 A#分
析!可以看出 H&1V(编码的氨基酸序列与其他物种
A!
林 业 科 学 !" 卷6
图 86X3’\(蛋白结构
aH<58 +LMRS/4MHN P4SJ34JSM/>X3’\(
4% 4=螺旋 4YLM0HQ& 6% 6=转角 6Y4JSN& )% 延伸链 )Q4MNUMU P4S9NU& I% 随机卷曲 I9NU/;3/H0& !’% 碳终端 ’Y4MS;HN94H/N& *% 氮终端 *Y
4MS;HN94H/N5,5预测的 X3’\(和 .[’\(二级结构% 4=螺旋(延伸链(6=转角和随机卷曲在图中分别用长(中长(短和最短竖线表示$ F5预
测的 X3’\(蛋白三级结构和 .[’\(蛋白结构% 4=螺旋(6=转角(随机卷曲(延伸链分别用红色(蓝色(灰色(黄色表示$ ,1&M3/NU9SVP4SJ34JSM
/>X3’\(9NU .[’\(RSMUH34MU% a/JS^ HNUP/>4LMT9SPHN UMP3MNUHNSMPRM34H[M0V5F1+LM4LSMMYUH;MNPH/N90;/UM0P/>.[’\(9NU 4LMUMUJ3MU X3’\(% 4YLM0HQHPHNUH394MU HN SMU!6Y4JSN HN T0JM!S9NU/;3/H0HN MQ4MNUMU P4S9NU HN VM0/Z5
图 !6苹果属观赏海棠 H&1V(基因中央编码区的氨基酸序列的多重比对分析
aH<5!6,0H4LMRSMUH34MU 9;HN/93HU PM]JMN3MP/>H&1V(;9HN 2IaHN H$6,#3S9T9RR0MP9NU 4L/PM/>PM[MS90/4LMSR09N4P
#1矮牵牛 J"*,)+$ p’08%+?$& %1草莓 /%$5$%+$ p$)$)$##$& 81茶 1$9"6+$ #+)")#+#& !1月季 !-#$ ’08%+?$& A1番薯 (:-9-"$ 8$*$*$#& "1观赏海棠
H$6,#3S9T9RR0M& ?1毛果杨 J-:,6,#*%+&’-&$%:$& @1杜鹃 !’-?-?")?%-) #+9#+& 71菊花 @")?%$)*’"9$ 9-%+.-6+,9& #$1萝卜 !$:’$),##$*+G,#& ##1
棉花>-##0:+,9’+%#,*,9& #%1拟南芥2%$8+?-:#+#*’$6+$)$& #81茄子 F-6$),99"6-)5")$& #!1水母雪莲 F$,##,%"$ 9"?,#$& #A1甜橙1+*%,##+)")#+#&
#"1向日葵 V"6+$)*’,#$)),,#5
"!
6第 #$ 期 耿6慧等% 苹果属观赏海棠 H&1V(基因的克隆及不同叶色品种间表达差异分析
具有 较 高 相 似 性$ 其 与 茶 " 1$9"6+$ #+)")#+#!
DB#%$A%##(番薯 "(:-9-"$ 8$*$*$#! ,F$@$?"@#(甜
橙 "(*%,##+)")#+#! ,F$##?7! # 和矮牵牛 "J"*,)+$
=’08%+?$! ,a%88"8? # 的 ’\(的 相 似 性 分 别 为
"71#8_! "#1?8_! ?$1!$_和 "$1A@_$
图 A6苹果属观赏海棠 X3’\(氨基酸序列与不同来源 ’\(氨基酸序列的系统进化树
aH<5A6:LV0/’\(>S/;[9SH/JPPRM3HMPHN30JUHND@EA0%!:;基因在不同叶色品种中的表达分析
由 H’V30MSHB+X自动测出的苹果属内参基因
_aF %!Y2的回归方程(:’I扩增效率和相关系数分
别为% X f=81!$7KC8A1@A?!7"1AR和 $177?! &
测出的苹果属 H&1V(的回归方程(:’I扩增效率和
相关系数分别为% Xf=$1%7AKC#1A7%!7717R和
$177"! $ 说明该试验具有良好的重复性和较高扩
增效率$ 熔点曲线分析出的 _aF %!Y2和 H&1V(均
有 # 个 U;值!分别为 @@ d和 @" d!表明 _aF %!Y2
和 H&1V(所用引物具有高度特异性!其 :’I扩增产
物均为目的片段!不含引物二聚体$
H&1V(基因在 ! 个苹果属观赏海棠品种叶片中
表达模式如图 "$ 以表达量最高的.火焰/幼叶的表
达量定为)#*$ 按照相对定量公式 % =7714作图$ 由
图 " 可以看出!H&1V(基因在 ! 个观赏海棠品种的
幼叶和功能叶中均有表达$ 就不同叶色类型品种而
言!绿色叶类品种 .火焰/幼叶的 H&1V(表达量最
高!而花色苷积累量最低& 常色叶类紫色叶品种的
花色苷含量始终较高!而 H&1V(的表达量却始终处
于中间状态& 新叶有色类品种.高原之火/幼叶花色
苷含量最高!而 H&1V(的表达量虽然高于常色叶类
紫色叶品种 .王族/!但却低于绿色叶类品种 .火
焰/$ 就不同发育时期的叶片而言!在绿色叶类品
种.火焰/的幼叶中 H&1V(表达量高于功能叶& 在
常色叶类紫色叶品种.王族/幼叶中其表达量相对
高于功能叶! 而花色苷积累则低于功能叶& 在新叶
有色类.绚丽/的幼叶中 H&1V(表达量相对低于功
能叶!花色苷积累无差别& 而.高原之火/幼叶基因
图 "6苹果属观赏海棠叶片中 H&1V(
相对表达量及对应花色苷的含量
aH<5"6IM094H[M3/RVNJ;TMSP/>H&1V(MQRSMPPH/N 0M[M0P
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#1.火焰/幼叶 O/JN<0M9>/>HM.a09;M/ & %5.绚丽/幼叶 O/JN<
0M9>/>HM.I9UH9N4/ & 85.高原之火 / 幼叶 O/JN<0M9>/>HM
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焰/功能叶 X94JSM0M9>/>HM.a09;M/ & "5.绚丽/功能叶 X94JSM
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.:S9HSH>HSM/ & @5.王族/功能叶 X94JSM0M9>/>HM.I/V904V/5
表达量近似于功能叶!花色苷积累无明显变化$ 这
?!
林 业 科 学 !" 卷6
说明 H&1V(表达量与花色苷积累随品种不同和叶
龄不同表现出较大差异!同时其基因表达量与花色
苷积累无明显对应关系$
86结论与讨论
在类黄酮代谢途径中!查尔酮合成酶 ’\& 催化
合成反应的第 # 步& 查尔酮异构酶 ’\(催化第 % 步
反应!即由 # 个香豆酰辅酶 ,和 8 个丙二酰辅酶 ,
在 ’\& 的作用下生成查尔酮$ 查尔酮再经过 ’\(
的作用形成二氢黄酮$ 二氢黄酮在 a8\等酶的催
化下转化为其他各种颜色类型的黄烷酮化合物$
1V(在植物中表达与否及表达量的高低都会影响黄
酮代谢的量!进而影响到植物器官色泽的形成
"X3^L9NN "*$65!#77!#$ 如缺乏’\(的玉米突变体!
查尔酮会出现积累!玉米粒呈古铜色"\MS0MP"*$65!
%$$!#$ 黄酮化合物的产量也受各种环境因子的影
响!如温度与金属离子会影响植物花色苷的积累&
增施镁盐可以预防温度提升和 ’\(活性下降!使植
物花色增强"-MM"*$65!%$$%& 李雪梅等!%$$!& 丛浦
珠等!%$$%& X9P9UM!#7?"#$ 这说明 ’\(在植物色
泽形成中具有关键的作用$
利用同源扩增和 I,’)方法!本研究克隆获得
了苹果属观赏海棠查尔酮异构酶基因 H&1V($ 图 "
表明 H&1V(基因在 ! 个观赏海棠品种的幼叶和功
能叶中均有表达$ 但对不同品种花色苷数据和
H&1V(表达量进行分析发现!叶色越红的品种!其花
色苷含量越高!而 H&1V(表达量却不一定高$ 绿色
叶类品种.火焰/幼叶的 H&1V(表达量最高!而花色
苷积累量最低& 新叶有色类品种.高原之火/幼叶花
色苷含量最高!而其 H&1V(表达量却低于.火焰/$
这表明 H&1V(表达量与花色苷积累随品种着色类
型不同表现出较大差异$ 就不同发育时期的叶片而
言!在绿色叶类品种.火焰/的幼叶中 H&1V(表达量
高于功能叶& 而在新叶有色类品种.绚丽/和.高原
之火/中!其幼叶中 H&1V(表达量相对低于功能叶$
这说明品种着色类型不同(叶片发育时期不同!
H&1V(表达量与花色苷积累量的对应关系各异$ 这
与苹果上的结果类似!虽然 1V(基因在花色苷代谢
中有着较为重要的作用 "于晓南等!%$$%#!但是其
与花色苷代谢的对应关系不明显$
纵观近几年来对 1V(的研究可以发现!对酶催
化机制方面的研究比较深入!而对 1V(基因的研究
主要集中在草本植物的花色代谢调控这一领域$ 将
矮牵牛 1V(基因转入番茄并获得了转基因番茄!表
达分析显示在其果皮中黄酮类含量比对照增加了
?@ 倍(果肉中黄烷醇增加了 %# 倍!而在其表现型上
和对照相比没有什么差别"XJHS"*$65!%$$##$ 由 IH
质粒介导将水母雪莲 " F$,##,%"$ 9"?,#$#1V(基因
转入雪莲花 " F$,##,%"$ +)G-6,&%$*$#!诱导雪莲花发
根!在转 1V(基因雪莲花发根中芹菜素含量比对照
组提高了 #% 倍!总黄酮量提高 ! 倍"-H"*$65!%$$"&
&LH;9U9"*$65!%$$8#$ 这些结果表明!应用基因工
程技术将 1V(基因导入到植物中!其表达产物可以
促进有益于人体健康的黄酮类化合物的生物合成$
运用植物组织培养(分子生物学等技术将 1V(等目
标酶基因在植物中过量表达来提高植物中黄酮含
量!已成为目前植物学及药学领域中重点研究内容
之一$ 将 1VF 和 1V(基因导入矮牵牛并获得了超
表达!转基因植株花的颜色发生了改变 "祝钦泷!
%$$!#$ 应用直接导入外源基因 1V(或者利用共抑
制和反义抑制的技术来改变植物花色!可以大大提
高花卉的观赏性$ 1V(基因的应用前景已经被逐渐
认识!将会得到越来越广泛的应用$
由于目前对 1V(基因表达调控机制(’\(的活
性基团(稳定性(环境影响因子以及合成途径中各种
酶之间相互协同或抑制等方面还缺乏全面的认识!
所以!1V(基因的相对表达量在整个叶片的发育过
程中对花色苷积累的作用及其机制以及对叶色形成
的作用有待于大量的研究去证实$
参 考 文 献
丛浦珠!李笋玉5%$$%5天然有机质谱学5北京% 中国医药科技出版
社!?@8 =7$$5
韩科厅!胡6可!戴思兰5%$$@5观赏植物花色的分子设计5分子植
物育种!""## % #" =%!5
何亦昆!代庆阳!苏学辉5#77A5雁来红叶色转变与超微结构及色素
含 量 的 关 系5 四 川 师 范 学 院 学 报% 自 然 科 学 版!
#""8# % #7A =#7?5
李雪梅!周6谨!张晓龙5%$$!5超临界 ’2% 流体萃取与常规提取方
法制备芹菜籽油的比较5精细化工!%# "@# % A@# =A@A5
陆旺金!蒋跃明5%$$85荔枝果实两个膨大素基因的克隆与序列分
析5中国农业科学!8" "#%# % #A%A =#A%75
吴6冰!祝钦泷!郭余龙!等5%$$@5查尔酮异构酶基因的分子特征及
其在基因工程中的应用5植物生理学通讯!!$"## % #?A =#@#5
于晓南!张启翔5%$$%5观赏植物的花色素苷与花色5林业科学!
8@"8# % #!? =#A85
祝钦泷5%$$!5转查尔酮异构酶"1V(#基因矮牵牛花色改变及其花
器官变异的研究5西南农业大学硕士学位论文5
\MS0MP’!FS9JNM,!F09J4X5%$$!5aHSP4T934MSH903L903/NMHP/;MS9PM
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6第 #$ 期 耿6慧等% 苹果属观赏海棠 H&1V(基因的克隆及不同叶色品种间表达差异分析
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