利用平板分离培养技术对卧龙自然保护区落叶阔叶天然林植被下不同层次土壤微生物区系进行研究。结果表明: 各样地不同土层细菌、真菌及放线菌数量均表现为FH层>A层>B层>C层,而各样地不同菌类的数量均表现为细菌>放线菌数>真菌。利用选择性培养基羧甲基纤维素钠筛选纤维素分解菌28株;利用苯胺蓝平板脱色法及愈创木酚变色圈法筛选具有木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的细菌2株、真菌25种、放线菌3种,具有漆酶的真菌5种; 在无机磷Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养基上筛选出97株溶磷菌;在无氮培养基上筛选出固氮菌2株; 溶磷菌无论种类还是数量均比纤维素分解菌、木质素分解菌及固氮菌多。
By using plate cultivation technique, the soil microbial community in different soil layers was studied under deciduous broad-leaved forest in Wolong Nature Reserve, Sichuan. The results showed that the number of bacteria, fungi and actinomycetes in the different soil layers was in the order as FH layer>A layer>B layer>C layer. The numbers of different microbes in all the sample plots were as the follows: bacteria>actinomycetes>fungi. With the selective media of sodium carboxymethyl cellulosea, 28 strains of cellulose-decomposing microorganisms were screened. By applying aniline plate decolorization method and guaiacol color ring method, we found 2 strains of bacteria, 25 strains of fungi and 3 actinomycetes that possess lignin peroxidase and manganese peroxidase, and 5 fungi with laccase. In the culture medium with Ca3(PO4)2 as the sole source of phosphur, 97 strains of phosphur-dissolving bacteria were screened. In the culture medium without nitrogen, 2 strains of nitrogen fixing bacteria were found. Both the number of strains and the amount of phosphur-dissolving bacteria were higher than that of lignocellulose decomposing microorganisms and lignin-decomposing microorganisms.
全 文 :第 49 卷 第 10 期
2 0 1 3 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49,No. 10
Oct.,2 0 1 3
doi:10.11707 / j.1001-7488.20131018
收稿日期: 2012 - 05 - 22; 修回日期: 2013 - 07 - 18。
基金项目: 中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室及林业研究所重点项目“卧龙自然保护区天然林土壤微生物资源研究及分
布规律”(ZD200912)。
* 焦如珍为通讯作者。
卧龙自然保护区落叶阔叶林土壤微生物分布规律
及功能菌的筛选*
韩 梅 焦如珍 董玉红
(中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091)
摘 要: 利用平板分离培养技术对卧龙自然保护区落叶阔叶天然林植被下不同层次土壤微生物区系进行研究。
结果表明: 各样地不同土层细菌、真菌及放线菌数量均表现为 FH 层 > A 层 > B 层 > C 层,而各样地不同菌类的数
量均表现为细菌 >放线菌数 >真菌。利用选择性培养基羧甲基纤维素钠筛选纤维素分解菌 28 株;利用苯胺蓝平
板脱色法及愈创木酚变色圈法筛选具有木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的细菌 2 株、真菌 25 种、放线菌 3 种,具
有漆酶的真菌 5 种; 在无机磷 Ca3 (PO4 ) 2 为唯一磷源的培养基上筛选出 97 株溶磷菌;在无氮培养基上筛选出固氮
菌 2 株; 溶磷菌无论种类还是数量均比纤维素分解菌、木质素分解菌及固氮菌多。
关键词: 落叶阔叶林; 微生物区系; 功能菌筛选
中图分类号: S718. 8 文献标识码: A 文章编号: 1001 - 7488(2013)10 - 0113 - 05
Distribution Pattern of Microbes in the Deciduous Broad-Leaved Forest Soil and
Screening of Functional Bacteria in Wolong Nature Reserve
Han Mei Jiao Ruzhen Dong Yuhong
(Research Institute of Forestry,CAF Beijing 100091)
Abstract: By using plate cultivation technique,the soil microbial community in different soil layers was studied under
deciduous broad-leaved forest in Wolong Nature Reserve,Sichuan. The results showed that the number of bacteria,fungi
and actinomycetes in the different soil layers was in the order as FH layer > A layer > B layer > C layer. The numbers of
different microbes in all the sample plots were as the follows: bacteria > actinomycetes > fungi. With the selective media of
sodium carboxymethyl cellulosea,28 strains of cellulose-decomposing microorganisms were screened. By applying aniline
plate decolorization method and guaiacol color ring method,we found 2 strains of bacteria,25 strains of fungi and 3
actinomycetes that possess lignin peroxidase and manganese peroxidase,and 5 fungi with laccase. In the culture medium
with Ca3 (PO4 ) 2 as the sole source of phosphur,97 strains of phosphur-dissolving bacteria were screened. In the culture
medium without nitrogen,2 strains of nitrogen fixing bacteria were found. Both the number of strains and the amount of
phosphur-dissolving bacteria were higher than that of lignocellulose decomposing microorganisms and lignin-decomposing
microorganisms.
Key words: deciduous broad-leaved forest; microflora; screening of functional bacteria
森林是陆地生态系统的主体,是人类和多种生
物赖以生存和发展的基础。第七次全国森林资源清
查结果(贾治邦,2009)显示:截至 2008 年,我国森
林面积为 1. 95 亿 hm2,其中天然林面积 1. 20 亿
hm2,占有林地面积的 65. 99% ;天然林中 98%为天
然次生林,在我国森林中占有很重要的地位。我国
人均森林面积 0. 145 hm2,不足世界人均占有量的
四分之一。长江上游防护林 50 年来已经损毁过半
(任海等,2002; 贾志邦,2009),严重影响我国长江
流域的生态环境。四川卧龙自然保护区是长江、岷
江上游重要的天然次生林分布地,被誉为“生物基
因库”、“天然动植物园”,物种丰富,森林植被带垂
直分布明显,森林土壤也呈明显的垂直分布。不同
类型的森林土壤具备丰富的生物多样性及特殊的地
林 业 科 学 49 卷
理环境,成为微生物多样性的富集地及功能微生物
的天然资源库。
土壤微生物是森林群落的重要组成部分之一,
对物质的循环和转化起着重要作用 ( 张海涵,
2008)。土壤微生物通过自身的生理生化活动将动
植物残体分解,促进有机物的矿物质化,进而增加土
壤肥力。我国对森林土壤微生物的研究始于 20 世
纪 50 年代末,在林地土壤微生物区系、根际微生物
区系、固氮作用、生态平衡,以及微生物在土壤养分
转化与循环、营林措施对土壤微生物的影响等许多
方面做了大量工作 (中国农业百科全书编辑部,
1996; 王岩等,1996; Carter,1986)。
土壤微生物群落在森林土壤的形成与发育、生
物元素循环、土壤团粒结构的形成以及食物链网的
组成等方面具有十分重要的作用和地位。同时,地
上植被通过植物根系的分泌物及凋落物的种类、数
量、质量和凋落时间等对土壤微生物群落的区系组
成、结构以及功能等产生显著影响(Hooper et al.,
2000),并且进一步影响土壤的物理结构、化学组成
和生物活性(Lucas et al.,1993)。植物通过对输入
到土壤中的有机物质的量和质的不同而对土壤微生
物过程产生巨大影响。同时,土壤微生物群落则通
过对植物残体的分解以及矿化作用而对植物生长发
育产生影响(杨万勤等,2006; 2008)。土壤微生物
数量与生物量是研究和评价土壤微生物调控功能的
重要参数 (刘满强等,2003; Harris,2003; 徐惠风
等,2004)。微生物的数量、分布与组成在很大程度
上影响并决定着土壤的生物活性,在有机质分解、腐
殖质合成、土壤团聚体形成以及土壤养分转化等方
面具有关键作用(徐惠风等,2004)。
本试验旨在对四川卧龙自然保护区落叶阔叶天
然林土壤微生物分布特征进行研究,获取纯培养菌
株,并利用选择性培养基筛选功能微生物,获得纤维
素分解菌、木质素分解菌、溶磷菌和固氮菌。研究
“林木 -微生物 - 土壤”系统中微生物的数量与类
群变化对评价森林生态功能有重要意义。
1 研究区域概况
四川省卧龙自然保护区位于岷江上游阿坝州汶
川县境内,总面积 2 000 km2,是四川省最大的自然
保护区之一。该区气候垂直变化明显。选择位于保
护区内核桃坪的天然落叶阔叶混交林作为样地。该
样地海拔1 900 ~ 2 100 m; 年最高温度 29. 2 ℃,最
低温度 - 8. 5 ℃ ; 年平均降水量 861. 8 mm,大多集
中在 5—9 月; 年平均相对湿度 80%左右。土壤为
山地棕壤。植被有山毛 榉科 ( Fagaceae )、樟科
( Lauraceae ) 等 科 的 常 绿 树 种,以 及 桦 木 科
( Betulaceae )、胡 桃 科 ( Juglandaceae )、槭 树 科
(Aceraceae)等科的落叶树种,局部地区有连香树
( Cercidiphyllum japonicum )、 珙 桐 ( Davidia
involucrata)、水青树 ( Tetracentron sinensa)、领春木
(Eupulea pleiosperma)、稠李 ( Prunus padus)等珍稀
的古 老 孑 遗植 物伴 生; 灌 木层 主要 以 拐 棍 竹
( Fargesia spathacea )、多 鳞 杜 鹃 ( Rhododendron
polylepis)、腊连绣球 ( Hydrangea strigosa)、川吊樟
(Lindera pulcheriima)、阔叶青风藤( Sabia latifolia)、
悬钩子(Rubus corchorifolius)、鸡桑(Morus australis)
等为主;草本层主要以蕨类、苔藓、钝叶楼梯草
(Elatostema obtusum )、禾草等为 主 ( 张万 儒等,
1990; 周世强等,2003; 何飞等,2006)。
2 材料与方法
2. 1 样品的采集
于 2010 年 7 月 20 日—8 月 20 日,在样地内选
取有代表性的 3 个 20 m × 20 m 的样方,分别编为
LK1、LK2、LK3,每个样方内按 S 型选取 3 个取样
点,挖 3 个 1 m × 1 m × 1 m土壤剖面,按 FH、A、B、C
分层取样。将土壤样品装入已灭菌的土壤袋中,放
入4 ℃冰箱保存,并在 2 天内进行微生物区系分析;
同时详细记载采样位置及主要植被组成。
2. 2 微生物的区系分析
2. 2. 1 培养基 细菌: 用牛肉膏蛋白胨培养基;放
线菌: 用淀粉硝酸盐培养基(高氏一号培养基);真
菌: 用孟加拉红链霉素培养基(中国科学院南京土
壤所微生物室,1985)。
2. 2. 2 细菌、真菌、放线菌的测定 精确称取
30. 00 g 新鲜土壤样品加入内盛 270. 00 mL 无菌水
的三角瓶中,150 r·min - 1振荡 30 min,吸取 1. 00 mL
土壤悬浊液加入装有 9. 00 mL 无菌水的大试管中,
依次稀释成 10 - 1,10 - 2,10 - 3,10 - 4土壤悬浊液。细
菌 FH 和 A 层用采用土壤悬浊液的稀释度为 10 - 4,
B 层稀释度为 10 - 3,C 层为稀释度 10 - 2土壤悬浊液
接种;真菌 FH 层采用稀释度为 10 - 3,A 及 B 层采用
稀释度为 10 - 2,C 层采用稀释度为 10 - 1的土壤悬浊
液接种;放线菌 FH 层采用稀释度为 10 - 4,A 层采用
稀释度为 10 - 3,B 层采用稀释度为 10 - 2,C 层采用
稀释度为 10 - 1的土壤悬浊液接种。每一处理 3 个
重复,接种后倒置培养于 28 ℃温箱内,其中细菌数
量在培养 24 ~ 36 h 内计数,真菌菌落在培养 3 ~ 5
天内计数,放线菌菌落在培养 10 ~ 12 天内计数。
411
第 10 期 韩 梅等: 卧龙自然保护区落叶阔叶林土壤微生物分布规律及功能菌的筛选
采用稀释平板法进行菌落计数:每克干土中的菌
数 =菌落平均数 ×稀释倍数 /风干土所占质量百分比。
2. 2. 3 初筛菌种的纯化和保存 利用稀释平板法
获取实验所用的细菌、放线菌、真菌的单个菌落,经
多次平板划线进行纯化,纯化后接种于试管内置
4 ℃冰箱内保存。
以上实验方法依据为《土壤微生物分析法》《土
壤微生物分析方法手册》《土壤微生物实验法》(土
壤微生物研究会,1983; 中国科学院南京土壤研究
所微生物室,1985; 许光辉等,1986)。
2. 3 功能性菌株的筛选
2. 3. 1 纤维素分解菌的筛选 在羧甲基纤维素钠
( sodium carboxymethyl cellulosea,CMC-Na)培养基
平板上接种待测菌进行培养(细菌、真菌、放线菌培
养时间分别为 4,6,7 天),培养后用刚果红进行染
色。根据透明圈的大小,比较其分解纤维素的效果
(黄宁珍等,2009; 史国翠等,2010; 周红霞等,
2010; 魏亚琴等,2010)。
2. 3. 2 木质素分解菌的筛选 1)苯胺蓝平板脱色
法:以苯胺蓝培养基为筛选培养基,接种实验菌株,
菌落周围若出现脱色圈证明菌株产生木质素过氧化
物酶 ( lignin peroxidase,Lip ) 和 锰 过 氧 化 物 酶
(manganese peroxidase,Mnp)。无脱色圈则没有 LiP
或 MnP 产生。
2)利用愈创木酚变色圈法:以鲜艳而均匀的红
棕色变色圈的有无来定性检测漆酶的产生与否。有
红棕色变色圈说明有漆酶的产生,无红棕色变色圈
则没有漆酶产生(杨金水等,2006; 吴薇等,2008;
蒋荣清等,2010)。
2. 3. 3 溶磷菌的筛选 在无机磷 Ca3 (PO4 ) 2 为唯
一磷源的培养基平板上均分为 4 个小区接种实验菌
株,并在 28 ℃条件下培养(细菌 4 天、真菌 6 天、放线
菌 7 天)。根据是否产生透明圈确定是否具有溶磷作
用,根据溶磷圈直径与菌落直径的比值大小初步确定
各个菌株解磷能力的大小。每个菌株 3 次重复(刘晓
芳等,2003; 焦如珍等,2005; 张毅民等,2006)。
2. 3. 4 固氮菌的筛选 利用无氮平板进行固氮菌
筛选,接种实验菌株,进行平板划线,28 ℃培养 1 ~ 3
天;在无氮培养基上连续转接 3 次仍生长良好的菌
株就说明其具有固氮能力 (杨从发等,1999; 蒲一
涛等,1999; 蒋宝贵等,2005)。
3 结果与分析
3. 1 卧龙自然保护区落叶阔叶林植被特征
对核桃坪落叶阔叶林的 3 个典型样方进行了植
被调查,由表 1 可知: 枯枝落叶层的厚度在 3 个样
方间有差异,其中样方 2 枯枝落叶层厚度最大,依次
为 LK2 > LK1 > LK3; 乔木层郁闭度样方 3 明显高
于样方 1 和样方 2,样地 1 和样方 2 基本一致; 灌木
层盖度差异较大,LK3、LK1、LK2 分别为 94%,46%
和 23% ; 草本层盖度也存在明显差异,依次为 LK2
> LK3 > LK1。
表 1 不同样方植被分布情况
Tab. 1 Forest vegetation distribution in different plots
样方
Plot
乔木层郁闭度
Canopy
density of
arbor
灌木层盖度
Coverage of
shrub(% )
草本层盖度
Coverage of
herb(% )
枯枝落
叶层厚度
Thickness of
litter / cm
LK1 0. 65 46 12 6. 17
LK2 0. 65 23 63 6. 67
LK3 0. 80 94 28 5. 50
3. 2 土壤微生物垂直分布特征
由表 2 可知,落叶阔叶林土壤中 FH、A 土层的细
菌、放线菌和真菌数量显著高于其他层次。这可能与
有机质分布有关,即有机质在 FH 及 A 土层中所占比
例较高,再加上大量土壤动物也主要在此层活动,动
植物残体为微生物提供了充足的有机物质、养分和
水,良好的土壤通气条件也有利于微生物的繁殖。且
表层土壤与空气进行热交换,其土壤热值状况比下层
好,利于微生物生长(倪彬等,2007)。另外,FH 及 A
土层是根须密集区,根系代谢能够提供较多的能源和
养分(张健等,2008; 王敬国,1993),其分泌物促进
了微生物的生长繁殖。微生物的数量垂直分布规律
与植被的盖度及枯枝落叶层的厚度有关,LK1 的 FH
层细菌、放线菌和真菌数量均比 LK2、LK3 都多,可能
是因为 LK1 的枯枝落叶中乔、灌、草结构及比例适当,
利于微生物的繁殖与生长。
表 2 土壤各类群微生物数量垂直分布
Tab. 2 Vertical distribution of the amounts of different microorganisms in soil
土壤层次
Soil layer
细菌 Bacteria /(106 cfu·g - 1 dry soil) 放线菌 Actinomycete /(105 cfu·g - 1 dry soil) 真菌 Fungi /(104 cfu·g - 1 dry soil)
LK1 LK2 LK3 LK1 LK2 LK3 LK1 LK2 LK3
FH 587. 13 529. 42 258. 57 1567. 46 559. 96 504. 96 744. 87 205. 46 260. 53
A 65. 41 45. 78 138. 61 36. 19 26. 51 22. 09 33. 14 13. 91 26. 71
B 14. 24 9. 31 12. 58 4. 34 2. 21 5. 18 7. 31 6. 52 4. 27
C 11. 8 1. 27 1. 44 0. 99 0. 31 1. 04 0. 52 0. 89 0. 26
511
林 业 科 学 49 卷
3. 3 功能性菌株的筛选
由表 3 可知,通过对四川卧龙自然保护区落叶
阔叶林土壤微生物区系的分析,根据菌落形态、质
地、颜色等特征,分离纯培养菌株细菌 118 株、真菌
66 株、放线菌 56 株。
表 3 几种类型功能菌株的数量分布
Tab. 3 Distribution of the number of functional microorganism
菌类
Microorganism
细菌
Bacteria
真菌
Fungi
放线菌
Actinomycetes
种类总数 Total species number 118 66 56
固氮菌 Nitrogen fixing microorganism 2 0 0
溶磷菌 Phosphorus dissolving microorganism 59 19 19
纤维素分解菌 Lignocellulose
decomposing microorganism
2 10 16
木 质 素 分 解 菌 ( Lip 或 Mnp ) Lign
decomposing microorganism(Lip,Mnp)
2 25 3
木质素分解菌(产漆酶)
Lign decomposing microorganism(Laccase)
0 5 0
其中,利用选择性培养基 CMC-Na 平板筛选出
分解纤维素的细菌 2 株、真菌 10 株、放线菌 16 株。
森林凋落物 50%以上是由纤维素组成的,纤维素分
解菌能将纤维素和半纤维素分解成为各种糖类,提
供植物生长所需的碳源和能源,因此,纤维素分解菌
对土壤中森林凋落物的分解起着极其重要的作用。
通过无氮平板筛选出固氮菌 2 株,固氮菌能将
大气中游离氮转化成氨,再进一步将其转化成硝酸
盐供植物吸收利用,对于土壤的速效氮素补充和平
衡,具有重要的作用。
利用苯胺蓝平板脱色法筛选出具有 Lip 和 Mnp
的细菌 2 株,真菌 25 株,放线菌 3 株,其中产漆酶 5
株,且均为真菌菌株,可能与土壤微生物分离时间有
关。此外,阔叶树的木质素是由松柏醇和芥子醇的
脱氢聚合物构成的愈创木基和紫丁香基木质素,而
这 2 种木质素的分解为主要是真菌,这也是未分离
出可产生漆酶的细菌、放线菌菌株的原因之一。而
草本植物木质素则是由芥子醇、松柏醇、对香豆醇的
脱氢聚合物和对香豆酸组成的,结构复杂、稳定,细
菌能在一定程度上使木质素的结构发生改性,成为
水溶性的聚合产物,但极少使木质素矿化,产生
CO2;另外,细菌在木质素降解的过程中主要起着改
变木质素结构的间接作用,这种作用有利于真菌分
解木质素。真菌通过其菌丝侵入到含有木质素的物
质中,通过菌丝分泌特殊的胞外酶能分解植物细胞
壁中的木质素和纤维素,促进它们的解聚和溶解。
此外,放 线 菌 中 链 霉 菌 ( Streptomyces )、节 杆 菌
(Arthrobacter)及小单胞菌也对木质素的降解有一定
的作用。高效优良的木质素分解菌的筛选对低污染
制浆造纸具有重要的意义,具有潜在的经济价值和
商业价值。
从 Ca3(PO4 ) 2 为唯一磷源的培养基平板上筛
选出可溶解 Ca3(PO4) 2 的细菌 59 株、真菌 19 株、放
线菌 19 株,它们能将土壤中难溶性磷 Ca3(PO4) 2 转
化为植物能够吸收利用的可溶性磷,为林地提供有
效磷。磷是植物必需的主要营养元素之一,是植物
细胞遗传物质 RNA 和能量物质 ATP 的基本构成元
素,在整个生命过程中起着很重要的作用。我国土
壤中的总磷量相当可观,但 95%以上的磷以稳定的
铝硅酸盐和磷灰石等无效形式存在 (陈延伟等,
1960),植物很难直接利用,绝大多数农作物及林木
都需追施磷肥。因此,筛选溶磷高效菌株对提高土
壤磷的利用率具有重要意义。
4 结论与讨论
各类群微生物数量垂直分布规律一致,均为
FH 层 > A 层 > B 层 > C 层,这是因为上层土壤通气
状况良好,表土根系分泌物较多,为土壤微生物提供
了较为良好的通气状况,而下层通气状况较差,生长
受到抑制,所以出现了上层大于下层的趋势。
各样地土壤微生物类群数量均为好气性细菌 >
放线菌 >真菌。可能是因为土壤微生物数量、分布
与组成在很大程度上影响并决定着土壤的生物活
性,在有机质分解、腐殖质合成、土壤团聚体形成以
及土壤养分转化等方面具有关键作用 ( Harris,
2003; 李延茂等,2004)。土壤微生物群落结构和
功能多样性是土壤质量最敏感的潜力指标之一
(白清云,1997; 任天志,2000; 滕应等,2004),并
且微生物的数量与森林郁闭度、林下植被盖度及丰
富度等也有关。
由功能菌的筛选可知溶磷菌的种类比分解纤维
素、木质素菌种类多。溶磷菌可为林地有效地提供
磷素,使森林植被能更好地生长。纤维素分解菌和
木质素分解菌能将枯落物转化为各种糖类供林木利
用,是树木生长碳源和能源的主要来源,在大气碳素
的循环中有重要作用,而且它们的分布与土壤的性
状、肥力有着密切的关系(赵小蓉等,2000)。
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(责任编辑 朱乾坤)
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