以不同种源的鹅掌楸、北美鹅掌楸和不同组合的杂交鹅掌楸为试验材料，对176对SSR引物进行初筛、复筛，最后筛选出1对物种特异性SSR引物。该引物在鹅掌楸群体中特异性扩增出190 bp的产物，在北美鹅掌楸群体中特异性扩增出180 bp的产物，在杂交鹅掌楸群体中特异性扩增出180 bp和190 bp 2种产物。该引物对鹅掌楸种间鉴别准确率达100%。
This paper reported that speciesspecific SSR markers were used to identify Liriodendron tulipifera, L. chinense and hybrid Liriodendron. Overall, 90 genotypes were taken as DNA amplification templates, of which 30 came from 20 provenances of L. chinense, 30 from 5 provenances of L. tulipifera, and 30 from 30 mating combinations of hybrid Liriodendron. Upon two round amplifying and screening, one speciesspecific pair primers for Liriodendron were screened from 176 pair primers. With the pair primers, a 190 bp fragment from L. chinense, 180 bp fragment from L. tulipifera, and a 190 bp and a 180 bp fragment from hybrid Liriodendron were respectively amplified. To testify the veracity of these pair primers, 10 individuals from L. chinense, 5 from L. tulipifera, and 10 from hybrid Liriodendron were used as amplification templates, and the results showed 100% veracity for species identification. Therefore, the development of the pair primers provided an effective, stable and reliable method for speciesspecific identification in Liriodendron at the molecular level.
全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % # % 年 # 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01 !"，*/1 #
2345，$ % # %
鹅掌楸属种及杂种的 &&6分子鉴定!
张红莲7 李火根7 胥7 猛7 冯源恒
（南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 7 南京 $#%%89）
摘 7 要：7 以不同种源的鹅掌楸、北美鹅掌楸和不同组合的杂交鹅掌楸为试验材料，对 #9" 对 &&6 引物进行初筛、
复筛，最后筛选出 # 对物种特异性 &&6 引物。该引物在鹅掌楸群体中特异性扩增出 #:% ;< 的产物，在北美鹅掌楸
群体中特异性扩增出 #=% ;< 的产物，在杂交鹅掌楸群体中特异性扩增出 #=% ;< 和 #:% ;< $ 种产物。该引物对鹅掌
楸种间鉴别准确率达 #%%>。
关键词：7 鹅掌楸；北美鹅掌楸；杂交鹅掌楸；&&6 分子标记；特异性鉴定
中图分类号：&9#=1 !"；&9#=1 !:7 7 7 文献标识码：,7 7 7 文章编号：#%%# ? 9!==（$%#%）%# ? %%8" ? %!
收稿日期：$%%= ? ## ? #!。
基金项目：国家自然科学基金项目（ 8%99#9!=）；国家“十一五”科技支撑课题（ $%%"@,A%#,#"）；江苏省自然科学基金项目
（@B$%%"$##）。
! 李火根为通讯作者。
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一种为天然分布于美国东部和加拿大东南部的北美
鹅掌楸（ $? )83->-*"(%），另一种为星散分布于我国长
江以南及越南北部的鹅掌楸（$5 .2-,",/"）。自 #:"8
年我国已故林木遗传育种学家叶培忠教授成功获得
杂交鹅掌楸以来，南京林业大学先后培育出一批杂
交鹅掌楸优良家系与无性系，经过 !% 余年的试验研
究，证实了杂交鹅掌楸具有非常强的杂种优势。与
$ 个亲本种相比，杂交鹅掌楸表现出速生、花色艳
丽、抗逆性强、适应性广、几乎无病虫害等优点，是极
佳的园林绿化及珍贵用材树种（王章荣，$%%[）。迄
今为止，杂交鹅掌楸已在江苏、福建、湖南、浙江、江
西、山东、湖北、湖南、贵州、云南、北京等地区推广，
产生了巨大的经济和社会效益。随着人们对杂交鹅
掌楸利用价值的不断认识，其推广应用规模也越来
越大。但目前杂交鹅掌楸苗木市场混乱，存在以假
乱真现象，因此，生产上急需一种方便、准确、可靠的
杂交鹅掌楸鉴别方法。
传统的杂交鹅掌楸鉴定主要依据其与两亲本种
在形态（刘洪谔等，#::#）、解剖（叶金山等，#::9）和
同工酶酶谱（黄敏仁等，#:9:）等方面的差异。但形
态特征在苗期差异并不明显且受环境影响较大，同
工酶标记受基因表达的限制而影响其使用。分子标
记的迅速发展为物种鉴别提供了很好的手段，李周
岐等（$%%#）用 6,^A 分子标记构建了杂交鹅掌楸
的无性系指纹图谱，但 6,^A 分子标记存在稳定性
与重复性差等缺陷。与其他分子标记相比，&&6 具
有共显性遗传、重复性与稳定性好、多态性高等优
! 第 " 期 张红莲等：鹅掌楸属种及杂种的 ##$ 分子鉴定
点，是亲本分析、物种 %品种鉴别较理想的遗传标记
（孙亚光等，&’’(；王琼等，&’’)；杨彦伶等，&’’)）。
本文报道了鹅掌楸、北美鹅掌楸及杂交鹅掌楸 ##$
分子标记的物种特异性鉴定方法。
"! 材料与方法
!" !# 试验材料
试验材料分 & 批，一批用来筛选鹅掌楸物种特
异性 ##$ 引物，另一批用来验证该引物的物种特异
性。以鹅掌楸、北美鹅掌楸、杂交鹅掌楸各 *’ 个基
因型作为筛选物种特异性 ##$ 引物的试验材料，其
中，鹅掌楸来自 &’ 个种源，北美鹅掌楸来自 + 个种
源，杂交鹅掌楸来自 *’ 个交配组合，每个交配组合
随机抽取 " 个基因型。*’ 个交配组合分别为：密苏
里 ,浙江松阳、密苏里 ,江西庐山、密苏里 ,福建武
夷山、密苏里 , 安徽黄山、南卡 " , 湖南桑植、南卡
& ,湖南桑植、南卡 ,浙江松阳、南卡 ,江西庐山、南
卡 ,浙江富阳、南卡 " , 贵州思南、南卡 & , 贵州思
南、南卡 ,福建武夷山、北卡 , 安徽黄山、北卡 , 浙
江松阳、北美 , 路易斯、北美 , 江西庐山 -、北美 ,
江西庐山 +、北美 ,浙江富阳、路易斯 ,江西庐山 "、
路易斯 ,重庆酉阳、路易斯 ,江西庐山、路易斯 ,浙
江富阳、路易斯 ,浙江松阳、佐治亚 , 福建武夷山、
佐治亚 ,浙江富阳、浙江松阳 ,佐治亚、浙江松阳 ,
南卡、浙江松阳 ,北卡、安徽黄山 ,路易斯以及江西
庐山 ,路易斯（数字表示不同的基因型）。具体情
况见表 "。
以鹅掌楸 "’ 个基因型、北美鹅掌楸 + 个基因
型、杂交鹅掌楸 "’ 个基因型共 &+ 个基因型用来验
证引物特异性，其中，鹅掌楸来自云南麻栗坡与湖南
城步 & 个种源，每种源各取 + 个基因型，北美鹅掌楸
来自加拿大安大略种源，杂交鹅掌楸来自 " 对正反
交组合（浙江松阳 , 北美，北美 , 浙江松阳），每组
合各取 + 个基因型。对上述每个基因型样品采集新
鲜无病斑嫩叶数片，放入 . (’ /冰箱中保存备用。
!" $# 试验方法
"0 &0 "! 总 123 的提取 ! 鹅掌楸基因组 123 的提
取采用改进的 4536 裂解 . 硅珠吸附法（张博等，
&’’-）。
"0 &0 &! 引物来源及 ##$7 84$ 反应条件和 84$ 后
处理 ! 所用的 "(9 对 ##$ 引物源于南京林业大学
林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室从
北美鹅掌楸 :#5 序列中开发的 :#57##$ 引物（;< !"
#$=，&’’9）。
84$ 的反应体系 "’ !>，包括模板 123 &+ ?@，
表 !# 鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂交鹅掌楸的基因型
来源与基因型数目
%&’( !# %)* +,-./*+ &01 +23*+ ,4 567 +&89:*+ ,4
!" #$%&’&()*+，!" ,-&.)./) &01 );’.21 !&*&01).1*0.
种
#ABCDBE
基因型来源
#F
（个）
2
鹅掌楸
%& ’()*!*+!
贵州思南 #D?I?，O
浙江富阳 U
安徽绩溪 ZDXD，3?Q
&
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"
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"
"
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"
"
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北美鹅掌楸
%& ",$)-).!/#
南卡 #F
密苏里 [DEEF
9
9
9
9
9
杂交鹅掌楸
WNLGD]
%)/)01!*1/0*
*’ 个交配组合
*’ JIMD?@ CFJLD?IMDF?E
*’（每个组合
" 个基因型
" @B?FMNAB ABG
CFJLD?IMDF?）
"’ , 6
物有限公司）’0 & !>，&+ JJFK·> . " [@4K& " !>，U7
AGDJBG ’0 &+ !>，$7AGDJBG ’0 &+ !>，3JAKD 5IS OFK]
（上海捷瑞生物有限公司）’0 ’+ !>，]]W&^ 90 &+
!>。84$ 反应程序为：预变性 _- / - JD?；梯度降
温扩增，_- / "+ E，9’ /［ ‘ +’0 +（ . ’0 + / % CNC）］
"+ E，(& / *’ E，"+ 个循环；一般性扩增，_- /
"+ E，-_0 + / "+ E，(& / *’ E，"+ 个循环；延伸(& /
" Q和最终的保存 - /。所用的 84$ 仪为 388>a:1
6a^#R#5:[# OB?B3JA 84$ ENEMBJ _(’’。然后对
84$ 产物加等体积上样缓冲液，)b 变性聚丙烯酰
胺凝胶［"’’ J> 凝胶包括 -& @ 尿素，&’ J> -’b丙
烯酰胺和 2，2’亚甲双丙烯酰胺（质量比为"_c "），
’0 + J> "’b 过硫酸铵，+’ !> 5:[:1，"’ J> "’ ,
56: 电泳缓冲液］，"&’ d 稳压电泳 " e & Q 后固定
染色；固定 "’ JD?（固定液 "’b乙醇，’0 +b乙酸），
]]W&^ 漂洗 & 次每次 & JD?；再用 ’0 "+b硝酸银染
色 ( JD?，双蒸水漂洗 & 次，每次 & JD?，最后显影
(*
林 业 科 学 !" 卷 #
（$% &’氢氧化钠，(% )&"’四硼酸钠，$’甲醛）至条
带清晰，然后对扩增片段大小进行判断。
*# 结果与分析
!" #$ 引物筛选
随机选取鹅掌楸、北美鹅掌楸各 ! 个 +,- 样
品，对 $)" 对引物进行 ./0 扩增。淘汰无扩增产物
和多态性差的引物，选留扩增条带清晰且有明显多
态性片段的引物，最后筛选出带型清晰、重复性好、
稳定性高、种内一致性较高、种间差别明显的引物 1
对（图 $）。然后，用鹅掌楸（来自 *( 个种源）、北美
鹅掌楸（来自 & 个种源）和杂交鹅掌楸（来自 2( 个
交配组合）各 2( 个基因型对引物进行再次筛选，最
终筛选出 $ 对特异性引物 (($。
图 $# 引物初筛结果
3456 $# 789 :4;<= ;>?@A
E：EF;G9;；$ H !：鹅掌楸 !" #$%&’&(9；& H 1：北美鹅掌楸 !" )*+%,%-’./6
(($ H ((1 为初筛的 1 对引物扩增结果。(($ H ((1 <8>I< FDCJ4:49A ;9: =89 1 CF4;< C;4D9;<6
!" !$ 物种特异性扩增
筛选出的鹅掌楸物种特异性 KK0 引物，其序列
为： &’L//M--/M-7-7---M7M-ML2’； &’LM7-
MM777M-MMM--M-MML2’。该对引物在鹅掌楸中
特异性扩增出 $N( OC 的产物，在北美鹅掌楸中特异
性扩增出 $1( OC 的产物，在杂交鹅掌楸中特异性扩
增出 $1( OC 和 $N( OC * 种产物（图 *）。
图 *# 鹅掌楸物种特异性 KK0 引物扩增结果
3456 *# -DCJ4:4BF=4>@ C;>A?B=< >: =89 =9DCJF=9 +,- :;>D !%.%01’&1.0& OP
!" %$ 引物特异性验证
以来自云南麻栗坡、湖南城步的鹅掌楸，来自安
大略的北美鹅掌楸，以及 $ 对正反交组合子代，共
*& 个基因型（表 *），用以验证该引物特异性扩增的
稳定性及物种鉴别的准确率。结果显示，该对引物
在 $( 个鹅掌楸基因型中特异性扩增出 $N( OC 的产
物，在北美鹅掌楸 & 个基因型中特异性扩增出 $1(
OC 的产物，在 $( 个杂交鹅掌楸正反交组合子代中
均特异性扩增出 $1( OC 和 $N( OC * 种产物（表 *）。
可见，该对引物的物种特异性鉴别准确率达 $((’，
且稳定性高，是鹅掌楸属物种鉴别 的 理 想 遗
传标记。 # #
12
! 第 " 期 张红莲等：鹅掌楸属种及杂种的 ##$ 分子鉴定
表 !" 鹅掌楸属种特异性引物检测结果
#$%& !" ’()*+*,$-*./ +.) $ 0$*) .+ 10(,*(1210(,*+*, 0)*3()1 */ !"#"$%&’%#$’
样本来源
#%&’() %* +,-./)+
基因型数目
#01) %* +,-./)+
检测结果 2-./0*0(,30%4 *’,5-)43+
"67 8. "97 8.
鹅掌楸（云南麻栗坡）!" #$%&’&(’（:,/0.%，;&44,4） < = >
鹅掌楸（湖南城步）!" #$%&’&(’（?@)458&，A&4,4） < = >
北美鹅掌楸（安大略）!" )*+%,%-’./（B43,’0%，?,4,C,） < > =
杂交鹅掌楸（松阳 D北美）AE8’0C !%.%01’&1.0&（ !" #$%&’&(’ D !" )*+%,%-’./） < = =
杂交鹅掌楸（北美 D松阳）AE8’0C !%.%01’&1.0&（ !" )*+%,%-’./ D !" #$%&’&(’） < = =
! ! =：有扩增产物 A,F045 ,-./0*0(,30%4 .’%C&(3+；! >：无扩增产物 A,F045 4% ,-./0*0(,30%4 .’%C&(3+G
H ! 讨论
45 6" 778 标记用于鹅掌楸属种及杂种鉴别的优点
本试验筛选出的 " 对鹅掌楸种特异性 ##$ 引
物，为鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂种鹅掌楸的鉴定提供
了一种快速、简便、稳定、可靠的方法。与原有的杂
交鹅掌楸鉴定方法（如形态特征、$2IJ 分子标记）
相比，该方法具有两大优点："）结果准确可靠。先
后对来自 KK 个种源的鹅掌楸、L 个种源的北美鹅掌
楸以及 HK 个交配组合的杂交鹅掌楸共 ""< 个基因
型进行检测，该对引物在所有基因型中均为特异性
扩增，其物种鉴定的准确率达 "77M，表明该物种特
异性引物具有很高的重复性与稳定性。K）操作简
便快速。仅需 " 对引物，通过对样品进行 JN2 提取
与纯化、I?$ 扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后即
可判断结果，无需对扩增的产物进行限制性内切酶
酶切，整个检测过程可在 L @ 内完成。
45 !" 鹅掌楸 778 种特异性引物的应用前景
由于杂交鹅掌楸杂种优势强、观赏性好、适应性
广，市场前景广阔。但目前杂交鹅掌楸苗木市场混
乱，存在以假乱真现象。鹅掌楸 ##$ 物种特异性引
物的筛选为杂交鹅掌楸的鉴别提供了一种方便、准
确、快速、可靠的方法。另一方面，由于鹅掌楸属种
间可配性高，不存在生殖隔离，随着北美鹅掌楸的大
量引种栽培及杂交鹅掌楸的推广应用，必然导致鹅
掌楸种间基因渐渗，进而影响我国濒危树种鹅掌楸
遗传系统的完整性，因此，开展鹅掌楸种间基因渐渗
研究有重要的理论与实践意义。种间基因渐渗是植
物遗传学与进化生物学的重要课题，利用 ##$ 分子
标记可从分子水平上检测基因渐渗现象。例如庞朝
友等（K77L）利用 "< 对 ##$ 分子标记证明了 6 种野
生 棉（ 20((3,%*4）的 遗 传 成 分 向 陆 地 棉（ 2"
$%.(*)*4）有不同程度的渗入。由于缺少物种特异性
分子标记，因而无法确定双亲对杂交群体的贡献大
小，导致该领域研究进展缓慢（ ;)@ ’) /+G，"96L；
O)44&,@ ’) /+"，K77P）。鹅掌楸物种特异性引物的
开发为鹅掌楸种间渐渗杂交研究开辟了新的途径。
利用该物种特异性引物可从 JN2 水平快速检测鹅
掌楸种间渐渗杂交状况，判断基因渐渗方向，估算渐
渗效应大小，为鹅掌楸遗传资源保护策略制定提供
依据。
参 考 文 献
黄敏仁，陈道明 G "9Q9G杂种马褂木的同功酶分析 G南京林产工业学院
学报，H（" R K）："
李周岐，王章荣 G K77"G杂种马褂木无性系随机扩增多态 JN2 指纹图
谱的构建 G东北林业大学学报，K9（P）：< > 6G
刘洪谔，沈湘林，曾玉亮 G "99"G中国鹅掌楸、美国鹅掌楸及其杂种在
形态和生长形状上的遗传和变异 G 浙江林业科技，""（ <）："6
> KKG
庞朝友，杜雄明，马峙英 G K77LG 棉属种间杂交基因渐渗系 ##$ 标记
及其表型性状的聚类分析 G作物学报，HK（9）："HQ" > "HQ6G
孙亚光，李火根 G K77QG利用 ##$ 分子标记对鹅掌楸自由授粉子代的
父本分析 G植物学通报，KP（<）：<97 > <9LG
王 ! 琼，郑勇奇，周建仁 G K776G 分子标记在林业植物新品种鉴别中
的应用及前景 G林业科学，PP（L）："67 > "6KG
王章荣 G K77
杨彦伶，张亚东，张新叶 G K776G 杨树 ##$ 标记在柳树中的通用性分
析 G分子植物育种，L（L）：""HP > ""H6G
叶金山，周守标，王章荣 G "99QG 杂种鹅掌楸叶解剖结构特征的识别 G
植物资源与环境，L（P）：<6 > L7G
张 ! 博，张 ! 露，诸葛强，等 G K77PG 一种高效的树木总 JN2 提取方
法 G南京林业大学学报：自然科学版，K6（"）："H > "LG
O)44&,@ # ;，S,45 T%45/0，20U)4 # NG K77PG V)4)30( ,4,/E+0+ %* 3@)
5%#’/ (%)#$’&(%( D 6+/*#/ 043’%5’)++0%4 1%4) 04 O’030+@ ?%/&-80,G
W%’)+3 X(%/%5E ,4C :,4,5)-)43，"9Q：L< > QQG
Y& :)45， Z0 A&%5)4， [@,45 O%G K77LG W0*3))4 .%/E-%’.@0( +0-./)
+)\&)4() ’).),3 -,’U)’+ *’%- )].’)++)C +)\&)4() 3,5+ %*
!%.%01’&1.0& )*+%,%-’./G :%/)(&/,’ X(%/%5E N%3)+，L：QK6 > QH7G
;)@ W ?， 2’4%33 ^ TG "96LG X/)(3’%.@%’)30( ,4C -%’.@%/%50(,/
C0**)’)430,30%4 %* 5%#’/ (%)#$’&(%(G ?,4 ^ W%’ $)+，"L：Q9" > Q96G
（责任编辑 ! 徐 ! 红）
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