全 文 ：第 !" 卷 第 ! 期
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林 业 科 学
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盐胁迫下构树 !"#$转录因子基因表达的
实时荧光定量 %&"分析"
杨 5 帆%，# 5 丁 5 菲# 5 杜天真#
（%1 湖州师范学院生命科学学院 5 湖州 6%6$$$；5 #1 江西农业大学园林与艺术学院 5 南昌 66$$!7）
关键词：5 实时荧光定量 8’9；构树；:9); 转录因子；!+ 值；盐胁迫
中图分类号：&<%=1 !"；&<%=1 !65 5 5 文献标识码：,5 5 5 文章编号：%$$% > $%!" > $7
收稿日期：#$$? > $% > $?。
基金项目：国家林业局重点研究项目“构树种质资源及多目标利用营林技术研究”（#$$" > #!）和教育部高等学校博士点专项基金“构树特
殊抗逆性的生理及分子机理研究”（#$$"$!%$$$#）。
"杜天真为通讯作者 。
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NK3FNN
5 5 转录因子是指那些专一性地结合于 :*, 特定序
列上、能激活或抑制其他基因转录的蛋白质（王少峡
等，#$$!）。 :9);（ SFIWS3AKE/B 3FN2/BNEQF F0FLFBK
VEBSEBC 23/KFEB）转录因子是一种特异性的转录因子，
当植物在干旱、低温及盐等逆境胁迫下，:9); 转录
因子被诱导表达，与 :9) 元件特异结合，启动下游与
抗逆性相关的功能基因的表达，导致基因产物的累
积，调节植物体内各种生理生化反应，最终使植物对
环境胁迫的抗逆性得到提高（孙静文，#$$"）。由于植
物的抗逆性属于复杂的数量性状，是多种调控机制共
同作用的结果，因此用单一的功能基因转化植物其效
果往往有限（秦红霞等，#$$"）。相比之下，转录因子
基因可以通过与 :*, 元件的结合调控下游一系列基
因的表达，因此寻找植物抗逆过程中起重要作用的转
录因子基因，探究其作用范围及机制之后将其用于植
物抗逆基因工程中，预期能获得更为理想的效果。目
前，关于 :9); 转录因子基因的研究主要集中在草本
植物中，有关木本植物的 :9); 转录因子基因的克隆
及表达的研究较少。
构树（ >3".,,"+$7(2 ?2?<3(&$32）具有良好的生态
和经济效益，它分布广，适应性强，整株均有利用价
值。构树叶是很好的动物饲料；树皮纤维洁白细长，
强度高、韧性好，是制备木浆的高级原料；根和种子
均可入药；树液可治皮肤病；果实富含氨基酸等有效
成分。构树耐干旱、耐贫瘠、抗盐碱，是迅速绿化荒
山、荒坡、荒滩和盐碱地的优良树种之一。同时，由
于其良好的适应性，还可作为研究木本植物应答环
境逆境信号途径的一种植物材料。在人口、粮食和
土地的矛盾日益加剧的今天，对这些适应性强且具
有较高经济价值的植物进行逆境的生理及分子机制
的研究十分必要。
实时荧光定量 8’9 技术是在常规 8’9 基础上
! 第 " 期 杨 ! 帆等：盐胁迫下构树 #$%& 转录因子基因表达的实时荧光定量 ’($ 分析
发展起来的可用于基因表达分析的核酸定量技术，
于 )**+ 年由美国 ,--./01 &/23435063 公司推出（袁
亚男等，7889），具有精确、操作简单、成本适中、可
以实现高通量的优势。实时荧光定量 ’($ 技术在
同一密闭试管中，同时进行 ’($ 扩增与靶核苷酸探
针杂交，与其他检测目的基因 6$:, 表达水平的方
法，如杂交、$;<’($ 相比，其污染可能是最低的，检
测需要的时间更短，灵敏度高（王明旭等，788=）。
操作相对简单，不需要跑胶和手工收集数据，影响因
素大大减少，也不需后期处理。基因芯片技术是分
析大量基因表达的良好方法，但与此技术相比，操作
过程繁杂，成本也高，且具有一定的假阳性。目前，
该技术在生物医学领域有着广泛的应用，近年来也
被逐渐运用于农作物的转基因检测和基因差异表达
研究上，如转基因玉米（!"# $#%&）（陈颖等，788"）
和棉花（ ’(&&%)*+$）（刘娜等，788>）的检测；水稻
（,-%.# &#/*0#）,&1234（余舜武等，788>），’56（魏敏
等，788+），789:（赵森等，7889）等基因以及玉米中
的水分胁迫诱导基因（张中保等，788>）的表达，但
在林业上的运用还未见报道。
目前最常用的实时定量 ’($ 方法有染料
（?@&$ AB00C D）法和 ;EFGEC 探针法 7 种，本研究选
择探针法。?@&$ AB00C 荧光染料为双链 #:, 特异
性染色，它不仅和靶基因的扩增产物结合，也会同非
特异性 ’($ 产物结合，所以特异性不如探针法（@/C
"/ #;H，788)；?IJ6/55K0C "/ #;H，7888），需要熔解曲线
判断 ’($ 扩增反应是否特异。探针法除了 ) 对特
异性引物，增加了 ) 条和模板互补的基因特异性探
针，探针上 =L端和 ML端分别标记了 ) 个报告荧光基
团（供体）和 ) 个猝灭荧光基团（受体），可提高定量
’($ 的专一性。每扩增 ) 个特异产物只释放 ) 个分
子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特
异产物对检测信号没有影响，有效提高了检测的特
异性，不需要用到熔解曲线，但探针设计有一定
难度。
本文应用实时荧光定量 ’($ 技术研究了构树
幼苗叶片中 7 个 #$%& 转录因子基因在不同程度盐
胁迫下的表达差异，以此进一步验证它们与构树抗
盐性的关系，初步探讨盐胁迫下 #$%& 转录因子的
分子机制，为利用 #$%& 转录因子改良植物抗逆性
的基因工程技术提供线索。
!" 材料与方法
)N )! 材料 ! 来源于同一株健康母树的构树种子播
于装有洗净石英砂的培养皿中，待幼苗长至 7 片真
叶时，移栽于装有相同质量洁净砂的塑料钵中，每钵
种植 ) 株，用 ) O 7P2EK.EC1 营养液培养，尽量控制每
钵水分和养分一致，至株高 )8 I6 左右开始 :E(. 处
理。:E(. 溶液以营养液配制，设 M 个梯度，分别是
)88，788 和 M88 662.·Q R )，每梯度 M 个重复。分别
剪取未经 :E(. 处理和处理后 +，)7，7" J 的幼苗叶
片，立即投入液氮中，用于 $:, 抽提。
)N 7! 引物和探针 ! 选择已从构树中克隆到的编码
#$%& 类转录因子的 7 个 3)21<3 基因（A0C&ECS
的序列号分别为 #T7))9M+ 和 %U8*+=7>，下文中分
别称为 3)21<34 和 3)21<3:）作为目标基因进行
分析，以已发表的构树 7=/*> 基因（李岩等，788>）作
内标。引物运用 ’$DG%$ =N 8 软件设计，探针及引
物由上海生工提供（表 )）。
表 !" 引物和探针
#$%& !" ’()*+(, $-. /(0%+,
基因 A0C03 引物 ’B/60B3 探针 ’B2V03
3)21<34
!
W：=L<;(;A,A(,A,(;AA;;(;;;,AA(;B：=L=L3)21<3:
!
W：=L<(,(,,,(A,AAA,;;,;,,,,A;;AB：=L=L7=/*>
!
W：=L<(((,,;((,,A,A,AA;,;((;;,(B：=L=L)N M! 试验方法 ! )）$:, 抽提、纯化 ! ;B/X2. 试剂
（ DCY/5B2K0C）提取总 $:,，#CE30（;EZE$E）酶解可能
混杂的基因组 #:,，用适量的 #%’( 水溶解 $:,，
用紫外分光光度计测定 $:, 的浓度和纯度，琼脂糖
凝脉电泳评价 $:, 质量。
7）I#:, 合成 ! 取各样品总 $:, 7 !K 分别进
行反转录，加入 ) !Q [./K2 15（ DCY/5B2K0C），#CE30 抑
制剂（;EZE$E）8N = !Q，补 #%’( 水至终体积 )8 !Q。
轻轻混匀并在微量离心机低速将混合液收集在底
部。每个反应管中顺序加入 = \ $; &]WW0B " !Q，
>")
林 业 科 学 !" 卷 #
$%&’ ()*（+, --./·0 1 + 2345）（ &67686）+ !0，
9%3:2 抑制剂（ &3;393）,< = !0，>?’@ 水 A< = !0，
((0B（+,, CD)E:·!0 1 +）（ FDG)EH.I2D）+ !0。!J K空
气浴孵育 + 5，LL K = -)D，! K保存。
A）荧光定量 ’@9 分析 # 反应体系 A, !0，包括
(3:E2H (FM JN< = !0，上、下游引物（上海生工）各
,< " !0，探针（上海生工）,< A !0，4>%O 模板 + !0。
反应于 8).P93$ F4Q4/2H 荧光定量 ’@9 仪上进行，每
个样品做 A 次平行反应，反应条件为：L= K预变性 A
-)D，L= K J, :，", K J, :，循环 !, 次。电脑自动分
析，直接读出 !& 值。
!）基因表达差异的分析（;2DD2E5 "# $%R，J,,+）
分析方法的确立：以不同处理的 4>%O 模板混合样
进行梯度稀释，对于每一个稀释样本，用目标基因和
内标基因的荧光探针及引物进行扩增。计算出它们
的平均 !& 值以及+!& 值，通过 4>%O 浓度梯度的
/I 值对+!& 值作图，如果所得直线斜率接近于 ,，说
明反应优化较好，目标基因和内标基因的扩增效率
相同，可以通过比较 !& 值的方法进行相对定量，分
析基因表达的差异。另外，运用 J+!S&［+!S& T !&（参
照）1 !&（处理）］分析作为内标的 &’#() 基因的相对
表达量，以判断该基因的表达受试验处理的影响，确
定其作为内标的有效性。
基因表达相对定量分析：当反应条件优化较
好，将参照样本的基因表达设为 +，那么处理样本中
的基因表达量变化的倍数可以用 J++!&来表示，其
中++!& T +!&（参照）1 +!&（处理），+!& T
!&（目标基因）1 !&（内标基因）。
!" 结果与分析
J< +# 9%O 抽提质量 # 提取总 9%O 经分光光度计
检测，6> J", U JV, 在 +< V W J< + 之间。经 +X琼脂糖
变性凝胶电泳显示（图 +），条带清晰，无明显降解，
可用于反转录反应。
J< J# 扩增效率分析 # 不同处理所得的 4>%O 模板
混合样进行 +, 倍 V 个梯度的稀释。根据 +< A 所述
的方法，对于每一个稀释样本，用目标基因和内标基
因的荧光探针及引物进行扩增，通过 4>%O 浓度梯
度的 /I 值对+!& 值作图，得到图 J。所得直线斜率
分别为 ,< ,JA A 和 ,< ,A+，均接近于 ,，说明反应优化
较好，>9?8 转录因子基因和 &’#() 基因的扩增效率
相同，因此，可以通过比较 !& 值的方法，运用 J
++!&
公式进行相对定量，参照样本为 %3@/ 处理前的
叶片。
J< A# 实时 ’@9 反应的可靠性 # 每样品每基因均
图 +# 9%O 电泳图
Y)IR +# 9%O 2/24EH.Z5.H2IH3-
图 J# 目标基因与内标基因的扩增效率分析
Y)IR J# OD3/Q:): .[ 3-Z/)[)43E).D 2[[)4)2D4Q .[
E3HI2E I2D2 3D$ )DE2HD3/ I2D2
*：4>%O 稀释倍数 4>%O $)/CE).DR
按照 A 孔平行试验，得出 A 个基因 !& 值的标准偏差
均小于 ,< A（表 J），说明试验建立的定量 ’@9 反应
具有较强的准确性和可重复性。此外，运用J+!S&计
算作为内标的 &’#() 基因的相对表达量，得出 +,,，
J,, 和 A,, --./·0 1 + %3@/ 胁迫处理过程中它的相
对表达量均稳定在 + 左右，变幅很小。方差分析得
到 + 值分别为 ,< J,= "，,< A=+ ! 和 ,< +L" N，说明胁
迫处理时间对 &’#() 基因表达的影响也很小。因此，
&’#() 基因在这里作为内标是合适的。
J< !# 盐胁迫下构树 ,-./ 基因表达的变化 # 从
图 AO可 以 看 到，/0,-./1 基 因 在 +,, 和 J,,
--./·0 1 + %3@/ 胁迫下都能被显著诱导表达。其
中，在 +,, --./·0 1 + %3@/ 胁迫下，"，+J 5 时均被诱
导上调，表达量分别比未胁迫的参照样本增加了
J< =，N< A 倍，而后又表现为下调趋势，到 J! 5 时，表
达量比对照下降一半。在 J,, --./·0 1 +的 %3@/ 胁
V!+
! 第 " 期 杨 ! 帆等：盐胁迫下构树 #$%& 转录因子基因表达的实时荧光定量 ’($ 分析
! ! ! ! ! 表 !" 不同浓度 #$%& 胁迫下构树叶片 !"#$%! 和 &’()* 基因实时 ’%( 反应 +) 值
)$*+ !" +) ,$&-. /0 1.$&2345. ’%( 1.$634/7 /0 !"#$%! $78 &’()* 9.7. 47 &.$,.: /0
!, "-"./)01/- -78.1 8400.1.73 #$%& 31.$35.73:
基因
)*+*
,-(. 处理
/0*-12*+13 4
（225.·6 7 8）
处理时间
/92* 4
:
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重复 8
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标准差
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<" <@A CB <@A =@@ @ <B <=A 8B <8< <<" <=A 8B <迫下，胁迫 B : 表达量被诱导上调达对照的 8A < 倍，
8< : 时高达 EA < 倍，而后又表现为下降趋势，但在
<" : 时它的表达量仍然高于对照，为对照的 8A B 倍；
而在 =@@ 225.·6 7 8 ,-(. 胁迫下，"#$%&"’ 基因的
表达量却始终低于未经盐胁迫处理的。
! ! 如图 =& 所示，"#$%&"( 基因在 8@@ 225.·6 7 8
,-(. 胁迫下的相对表达量先被强烈诱导升高而后
又逐渐下降。在 8@@ 225.·6 7 8 ,-(. 胁迫 B : 时表
达量上调到对照的 =@A C 倍，8< : 时为对照的 倍，而后继续下降并且下降幅度明显增大，<" : 时
降至对照的 8A = 倍。在 <@@ 225.·6 7 8 ,-(. 胁迫 B，
8< : 时表达量均低于对照，然后缓慢上升，到 <" :
时表达量达对照的 胁迫下，"#$%&"( 基因的表达量始终小于对照，说
明它未被 ,-(. 胁迫诱导。
;" 结论
试验 表 明，"#$%&"’ 基 因 能 被 8@@， <@@
225.·6 7 8 ,-(. 胁迫所诱导，"#$%&"( 基因能被
8@@ 225.·6 7 8,-(. 胁迫所诱导，对盐胁迫做出表达
水平增高的应答，但超过一段时间之后表达量又逐
渐下降。后期表达量的下降可能有 < 种解释：一是
#$%& 转录因子被诱导表达后启动下游与抗逆性相
关的功能基因的表达，调节植物体内各种生理生化
反应，使构树对盐胁迫的抗逆性得到提高，已经对胁
迫环境产生了适应，盐胁迫不再诱导 #$%& 转录因
子基因的表达上调；二是 #$%& 转录因子的诱导会
受到胁迫时间的限制，超过一定的时间，表达逐渐受
F"8
林 业 科 学 !" 卷 #
图 $# 不同浓度 %&’( 胁迫下 !"#$%!& 和
!"#$%!’ 基因相对表达差异
)*+, $# -.(&/*0. .123.44*56 57 !"#$%!& &68 !"#$%!’
968.3 8*77.3.6/ :56:.6/3&/*564 57 %&’( 4/3.44
到抑制，植物对逆境的耐受性也逐渐降低。以上推
断还需要进一步深入的试验加以论证。!"#$%!’
基因也能被 ;<< ==5(·> ? @ %&’( 胁迫所诱导表达量
升高，但是在表达量升高之前的一段时间里它的表
达被抑制，可能是在中度盐胁迫下，!"#$%!’ 基因
要经历一个启动期才能被诱导表达。!"#$%!’ 基
因在 @<< ==5(·> ? @%&’( 胁迫下比 !"#$%!& 基因的
表达量大，可能暗示着较 低 程 度 的 盐 胁 迫 对
!"#$%!’ 基因的诱导影响更大，在低盐胁迫下它的
抗逆作用更强。当 %&’( 浓度达到 $<< ==5(·> ? @，
!"#$%!& 和 !"#$%!’ 基因对胁迫的应答均表现为
表达水平的降低，也就是说它们的表达被抑制。结
合对植株外部形态的观察，经 $<< ==5(·> ? @ %&’( 胁
迫处理的构树幼苗，在胁迫 " A 之后就陆续出现叶
片失绿枯萎等症状，;! A 左右开始陆续有植株死
亡，推断在 ;! A 之后不可能出现 !"#$%! 基因表达
量被诱导升高的情况。
构树幼苗叶片中 #$%! 基因的转录表达受盐胁
迫因子所诱导，它可能参与构树应答盐胁迫逆境的
信号传递途径，但超过一定的胁迫时间和程度此类
基因可被阻遏。
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（责任编辑 # 徐 # 红）