全 文 ：第 !"卷 第 #$期$ % % &年 #$月 林 业 科 学 ’()*+,)- ’)./-* ’)+)(-* /012!"，+02#$
3456，
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$% % & 蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达" 谢树章#，$ 秦平伟# 张 迷# 胡雨晴# 李名扬# 眭顺照#
（#2 西南大学园艺园林学院 重庆市花卉工程技术研究中心 重庆 !%%7#"；$2 重庆市农业科学院生物技术研究中心 重庆 !%%%""） 摘 要： 在构建好蜡梅花 53+-文库并进行 *’,分析基础上，通过随机克隆测序，得到 #个蜡梅几丁质酶的 53+- 基因，命名为 !"#$%&（849:;9<登录号：=>7!&#?%）。!"#$%& 53+-全长为# #@! AB，开放阅读框为 &"! AB，编码 ?#7个氨 基酸，其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区，无 (端延伸区，为 (1;CC !A型胞外几丁质酶，属于几 丁质酶第 #&家族。将 !"#$%& 克隆到原核表达载体 B*,D$@;（ E），在大肠杆菌 :.$1细胞中以包涵体形式表达融合蛋
白，利用透析法获得复性蛋白，其几丁质酶活性经 3+’法检测达到$%% F·G.H #。酶活性和稳定性分析表明，试验条 件下，BI 72%有利于酶的稳定和活性发挥，!% J活性最高，在 % J低温下也有较高活性。上述结果说明，分离的 !"#$%&基因编码蛋白具有几丁质酶活性，而且可能与蜡梅花的抗寒性形成有关。
关键词： 几丁质酶；克隆；原核表达；蜡梅
中图分类号：’7#@2!K；L&!?2$文献标识码：- 文章编号：#%%# H 7!@@（$%%&）#$H %%?K H %K 收稿日期：$%%& H %$H$K。
基金项目：重庆市自然科学基金项目，(’,(，（$%%K::#??K）；西南大学基金项目（’MF:$%%K%!%）。
"眭顺照为通讯作者。
!"#$%$& ’$( )*#+’*,#-%. /01*233%#$ #4 ’ !5%-%$’32 .678 4*#9 !"#$%&’&(")* +,’-.%/
NO4 ’PQRP;9S#，$LO9 TO9SU4O# VP;9S WO# IQ XQYO9S# .O WO9SZ;9S# ’QO ’PQ9RP;0# （#2 !$’()*%() +,’-./ 0()%(../%() 1.#$(’,’)2 3.4.&/#$ !.(5./ !’,,.). ’6 7’/5%#8,58/. &(9 :&(94#&".，;’85$-.45 <(%=./4%52 !$’()*%() !%%7#"；
$2 >%’5.#$(’,’)2 3.4.&/#$!.(5./，!$’()*%() ?#&9.@2 ’6 ?)/%#8,58/&, ;#%.(#.4 !$’()*%() !%%%""） 8:3-*’.-： - 5PO[O9;C4 S494 U;C OC01;[4\ A;C4\ 09 [P4 1OA];]Z 509C[]Q5[O09 ^]0G !$%@’(&(5$84 "/&.#’A ^10U4] ;9\ O[C *’, ;9;1ZCOC，;9\ U;C 9;G4\ ;C !"#$%&（849:;9< ;554CCO09 +06 =>7!&#?%）6 ,P4 ^Q11 149S[P 0^ !"#$%& C4YQ4954 U;C # #@! AB， 509[;O9O9S ;9 0B49O9S ]4;\O9S ^];G4 0^ &"! AB6 )[ 4950\4\ ; B01ZB4B[O\4 0^ ?#7 ;GO90 ;5O\ ]4CO\Q4C O951Q\O9S COS9;1 B4B[O\4， 5ZC[4O94D]O5P \0G;O9，PO9S4 ]4SO09，;9\ 5;[;1Z[O5 \0G;O96 ,P4 P0G0S494O[Z O9 C[]Q5[Q]4 ;9\ C4YQ4954 CP0U4\ [P;[ [POC 53+- U0Q1\ A4109S [0 (1;CC!A 5PO[O9;C4，; G4GA4] 0^ [P4 #&[P 5PO[O9;C4 ^;GO1Z 6 M4 O9C4][4\ [POC S494 O9[0 [P4 B]0<;]Z0[O5 4_B]4CCO09 ‘45[0] 0^ B*,D$@;（ E）;9\ O[ 4_B]4CC4\ O9 04#$./%#$%& #’,% :.$1 ;C O951QCO09 A0\O4C 6 ,P4 ]4^01\4\ B]0[4O9C U4]4 0A[;O94\ ;^[4] C[4BUOC4 \O;1ZCOC，;9\ [P4 POSP4C[ ;5[O‘O[Z U;C$%% F·G.H # G4;CQ]4\ UO[P ?，"D\O9O[]0C;1O5Z1O5 ;5O\（3+’）G4[P0\6 ,P4 49RZG4
U;C C[;A14 ;[ BI 72%，;9\ P;\ [P4 G0C[ ;5[O‘O[Z ;[ !% J ;9\ ]4G;O94\ ;5[O‘4 ;[ % J 6 ,P4 ]4CQ1[C CP0U4\ [P;[ !"#$%& 4950\4[P4 B]0[4O9 UO[P 5PO[O9;C4 ;5[O‘O[Z ;9\ B]0A;A1Z U;C ]41;[4\ [0 501\ [014];954 0^ !$%@’(&(5$84 "/&.#’A A100GO9S 6 ;2, <#*(3： 5PO[O9;C4；5109O9S；B]0<;]Z0[O5 4_B]4CCO09；!$%@’(&(5$84 "/&.#’A 几丁质（5PO[O9）是广泛存在于自然界的直链状 高分子生物多聚体，为地球上第二大可再生的天然 多聚物资源，仅次于纤维素（:0114] .5 &, 6，#&@?）。它 不仅是大多数真菌细胞壁的主要成分之一，同时也 大量存在于昆虫和海洋生物的甲壳及昆虫的肠道中 （M;[;9;A4 .5 &, 6，#&&&）。几丁质酶（5PO[O9;C4）是一种 能催化降解几丁质的糖苷酶，主要水解几丁质多聚 体中"D#，!糖苷键，产生几丁质单糖———+ H乙酰氨 基葡萄糖（+-8）。 资料显示，几丁质酶具有抗菌、抗寒和抗冻等多 种抗逆作用，受到广泛关注（赵晓芳等，$%%@）。
:]0SQ4等（#&&#）和 T;C0949等（$%%!）通过转基因等
生物技术手段研究表明几丁质酶跟植物的抗病虫害
密切相关。aO积累能够提高高丛蓝莓（B&##%(%8@ #’/2@C’48@）茎芽
的抗寒性。I09 等（#&&"）在经低温驯化后的冬黑麦
（;.#&,. #./.&,.）中分离纯化得到了同时具有内切几
丁质酶活性和抗冻活性双重活性的酶。因此，深入
研究植物几丁质酶，对探索植物的抗逆机制具有重
要的意义。然而，正常情况下，植物几丁质酶作为一
种诱导酶在植物体内含量很低（8;0 .5 &, 6，$%%?）， 在植物体内分析其性质、作用存在相当的难度，客观 上阻碍了对几丁质酶生物学功能的分析及进一步的 应用研究。 蜡梅（!"#$%&’&(")* +,’-.%/）花期正值腊月寒冬，
秦华等（!""#）首次从分子角度对其抗寒性进行了研
究。蜡梅开花过程具有高耐寒、无病虫害、无机械损
伤等特点，蜡梅几丁质酶在这一过程中的性质和作
用如何，是个值得探索的问题。本研究从实验室已
构建好的蜡梅花 $%&’文库（眭顺照等，!""(）中克 隆到 )个 *+,长为 -./ 01的几丁质酶基因$%&’序
列，并构建原核表达载体 1234!56781$9:6，转化宿主 大肠杆菌（0*"-,#."#’ .%1#）;)，诱导表达获得了重<br组蛋白。然后进行纯化复性，进而对该几丁质酶进 行活性检测和特性分析。这对于蜡梅几丁质酶的功 能分析，深入研究该几丁质酶在蜡梅开花生理过程 中的作用具有重要意义，并为蜡梅花抗寒机制的研 究提供新思路和开辟新途径。 ) 材料与方法 !"! 材料 大肠杆菌 =<)4;>?@ 菌株；原核表达载体 1234 !56（ A）及宿主菌 ;)菌株；蜡梅花 $%&’文库由<br西南大学花卉研究所构建保存。 !"# 目标克隆子的获得及序列分析 随机 挑 选 文 库 克 隆，提 取 质 粒 %&’，以 .B 13C:1>2D! E@F?@G$@ 1C:H@C 为测序引物，采用 ’;I
J("" %&’ E@F?@G$@ %&’自动序列测定仪进行正向 序列测定得到 2E3序列，然后运用 %&’EK6C软件包 的 E@FL6G进行 2E3聚类，在本地运行 ;<’E3=与 GC 库进行比对，对目标克隆子（编号：8M"#-/）再以 EN. 和 3(为测序引物进行 !次正反向序列测定。本地 分析主要采用 %&’L’&/O"和 %&’EK6C(O"软件包进 行。利用 E:PG6>N分析蛋白信号肽，利用 NE*+3软件 预测亚细胞定位情况，利用 &@KN9QR !O"分析蛋白磷 酸化位点。 !"$ 原核表达载体的构建
根据目的基因序列，切除一段 !"个氨基酸构成
的信号肽序列，并设计合成 )对 N8+扩增引物。上
游引物：.’4S8SS’388’83SS’’S88’’S8’S4J’，
下划线为 2’$M!酶切位点；下游引物：.’4888 ’’S833883’’S8’33S’’’SS8834J’，下划线为 3#&T"酶切位点。将 N8+产物与 1L%)543载体连 接转化大肠杆菌 =<)4;>?@，提取质粒与表达载体 1234!56（ A）均用 2’$M!和 3#&T"双酶切，分别回
收目的片段和线性载体并连接，转化大肠杆菌 ;
感受态细胞，N8+、酶切及测序验证。筛选阳性克
隆，命名为 1234!56781$9:6。 !"% &’()#*+,-&./0+在 12#!（3’$）中的表达和原
核表达体系的优化
挑取 1234!56781$9:6阳性克隆，接种于 J H<含
有."#P·H<
U )卡那霉素的 <;液体培养基中过夜培
养，次日按 ) V."的比例扩大培养，至 *%#""!"O#时，
加入 IN3S（浓 度 分 别 为 "，"O)，"O.，)，)O.，
! HHQ>·诱导时间设为 J，/，.，# 9，设置对照处理（8X）。E%E4
N’S2电泳检测分析。利用复日 ,+4-5"生物电泳图
像分析系统所内含的 EL’+3 YI2Z分析软件分析蛋
白电泳图，计算重组蛋白的表达丰度值。
!"4 重组蛋白 &’()#*+,-&./0+包涵体的分离纯化
与复性
将 诱 导 表 达 后 的 菌 液 高 速 离 心
（)J """ C·H:GU )），沉淀按比例（!" H<裂解液7) P湿
菌体）加入细胞裂解液（." HHQ>·，
! HHQ>··，"O.[ 3C:KQG
=4)""，) HP·H·J" H:G，超声波细胞破碎 ). H:G，离心沉淀用洗涤缓冲
液洗涤后加入 !" H<包涵体溶解缓冲液（." HHQ>·3C:R4M8>，! HHQ>··，
5 HQ>··期间不断振荡混匀，直至沉淀全部溶解。低温高速离
心（/ W，)J """ C·H:GU )），上清在一定尿素梯度
（/ HQ>····) HQ>···/ W低温透析，每 5 9更换 )次透析缓冲液。并利用
;C6T\QCT 法测定复性后蛋白质含量（;C6T\QCT，
)-(#）。
!"5 几丁质酶酶学性质的测定与分析
)O#O) 几丁质酶定性分析 按 M?G6P 等（)--(）的
方法，稍做改进。在 ![几丁质 U琼脂平皿上，放 J
张灭过菌的小圆形滤纸，分别用 ."#<酶液、)""#<
酶液和 )""#<灭活酶液处理，J( W培养 /5 9，观察
水解几丁质后形成透明圈的大小。
)O#O! 几丁质酶活性的测定 按 396HK9:6G]?> 等
（!"")）方法，略作改进。取 "O. H< 的酶液，加 "O.
H< ![胶体几丁质及 "O. H<磷酸缓冲液（1M (O"）
于 J( W反应 ) 9后煮沸灭活 )" H:G。冷却后离心取
上清 )OJ H<加双蒸水至 ! H<，加入 ! H< J，. U二硝
基水杨酸（%&E）沸水浴 # H:G显色，.J" GH下测吸光
度以确定还原糖的量。以 & U 乙酰氨基葡萄糖
（&’S）作标准曲线。) 单位几丁质酶酶活性定义
为：在指定条件下每分钟从几丁质中释放的 )#P
(J第 )!期 谢树章等：蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达
!"#所需的酶量。
$%&%’ 温度及 ()值对几丁质酶活性和稳定性的影 响 取 *%+ ,-的酶液，加 *%+ ,- ./胶体几丁质及 *%+ ,- ()调节缓冲液（范艳华，.**&），制成不同 () 的反应混合液。将 () 0%* 的反应混合液置于不同 的温度下（* 1 2* 3）反应$ 4，测定酶活性。将酶液
分别于上述不同的温度下放置 $4后，再测定残余 酶活性。将上述不同 ()的反应混合液在 ’0 3反应$ 4，测定酶活性。将酶液分别于不同 ()调节缓冲
液（() ’%* 1 $*%*）下放置$ 4 后，再测定残余酶
活性。
. 结果与分析
!"# !"#$%& 克隆子的获得及其$%&’序列特征
图 $!"#$%&与同源基因编码区氨基酸序列比对
5678$"967:,;:< => <4; ?;?@A;? B,6:= BA6? C;D@;:A;C => EF5 => !"#$%’& B:? 4=,=9=7=@C 7;:;C
G(：蜡梅 !$%()’&’*$+, "-&.#)/；HB：鳄梨 0.-,.& &(.-%#&’&（I02.*.）；JB：小果野芭蕉 1+,& &#+(%’&*&（"K.00.0L）；
H(：草地早熟禾 0)& "-&*.’,%,（"5***L&&）；MA：冬黑麦 2.#&3. #.-.&3.（"5.2*N’0）；OB：小麦 4-%*%#+( &.,*%5+(（"PN’0NN’）8
Q：信号肽序列 M67:B9 (;(<6?; C;D@;:A;；—：几丁质结合域 G4#：推定的糖结合位点 H@随机测序后 XMO分析显示，XMO序列 SY...L.+
对应的目标克隆子 G)*&LN 上的 AS!"片段可能属
几丁质酶基因，以 MH+和 O0为测序引物的测序结果
初步表明获得的 G)*&LN是源于蜡梅几丁质酶的全
长 AS!"。克隆的 !"#$%& AS!" 长$ $2N W(，包含$
个 L+N W(的 EF5，编码蛋白由 ’$0个氨基酸残基组 成，理论分子质量约 ’’%+ Z@，预测等电点为 +%*0，命 名为 !"#$%&（#;:RB:Z登录号：5K0NL$’*）。 运用 R9BC<[ 进行比对发现，!"#$%& 与多个种类
几丁质酶序列有较高的同源性，排在第 $，.位的分 别为草地早熟禾（ 0)& "-&*.’,%,）和小麦（ 4-%*%#+( &.,*%5+(）（图略）。保守结构域分析显示，该几丁质 酶为$L家族几丁质酶，大部分的植物几丁质酶都属
于这个家族。如图 $所示，包含$个富含 AUC和 79U
的几丁质结合域和 $个完整保守的几丁质酶催化 区，以及$ 个富含 (T=的链接区，无 G端扩展区，根
据 P;4等（.***）的研究结果，初步推测为 G9BCC !W
型几丁质酶。信号肽分析显示在 !端含有 $个长约 .* BB信号肽序列。蛋白亚细胞定位分析显示该蛋 白可能定位于胞外，这与该几丁质酶功能推测结果 相一致。磷酸化位点分析显示该几丁质酶有多个磷 酸化位点，推测翻译后蛋白可能进行多样化修饰，这 与几丁质酶多抗性特性相关。 !"! !"#$%& 编码蛋白多序列比对和进化树分析
将 !"#$%& 蛋白质序列与其他植物同源序列比 较发现，该序列与鳄梨（0.-,.& &(.-%#&’&）、小果野芭 蕉（1+,& &#+(%’&*&）、草地早熟禾、冬黑麦、小麦等植 物的几丁质酶序列高度同源，同源性分别为 0’%*/，0$%L/，0.%&/，0$%N/，0.%&/（图$），进一
步证明本试验克隆得到的基因为编码蜡梅几丁质酶
的全长 AS!"。进而将该蛋白质序列与其他 .N条同
源序列利用 G9@C2’ 林 业 科 学 N+卷
进化树（图 !）。结果显示，"#$%% !、"#$%% "、单子叶
植物和双子叶植物几丁质酶分别形成单独的一支，
这与 &$’(#等（)**+）的研究结果是一致的。另外蜡 梅与鳄梨、葡萄（ !"#"$ %"&"’()*）的几丁质酶单独形成
了 )个小分支，显示它们的同源关系较近。
图 ! 几丁质酶类蛋白质进化树分析
,-./! 01( 213#-.(4(5-6 57(( 89 51( 61-5-4$%(:#-;( 2785(-4 <=6#(85->( %=?%5-5=5-84%（ @ )AA）：表示经 )AA个重复的 ?885%57$2分析所得的核苷酸替换率
B4>-6$5-4. 51( 4=6#(85->( %=?%5-5=5-84% 89 )AA 7(2#-6$5-84% 89 ?885%57$2$4$#3%-%/ !"# 原核表达载体的构建及在大肠杆菌中表达 以 "&AC*D克隆子为模板，用设计引物扩增出 目的片段，将其连接到 2EF:)G0 载体上，H"I 和测 序结果表明连接成功并准确无误。然后用+"&># J ,*-&$ 同 时 双 酶 切 2EF:)G0K"261-$和 2L0:!G$（ J），分别胶回收基因片段和线性载体并连
接转化大肠杆菌 MN!)感受态细胞。用双酶切方法
验证，电泳结果和条带大小都与预期一致。测序结
果（略）鉴定出插入的序列及其读码框准确无误。从
结果（图 O）来看，在 )G P下，重组蛋白基本不表达。
!G P和 O+ P都出现了 OO ;=左右的表达特异带，与
预期大小相符，且 O+ P要比 !G P表达量高很多。
但破碎上清都没有目的条带，表明没有可溶蛋白产
生。综合表明诱导温度在试验范围内对可溶融合蛋
白的产生影响不大，且温度下降会降低融合蛋白的
表达量，这与董娜等（!AAG）的研究结果一致。在试
验条件下，加入 BH0Q的浓度变化对表达量影响不明
显（图 D），而未加 BH0Q的没有特异条带出现，根据
结果综合考虑选择ARS ’’8#·NT )的 BH0Q 作为试验
诱导浓度。随着诱导时间的增加，目的蛋白的表达
量逐渐增加（图 S）。到 S 1达到最大值（占菌体总蛋
白的 S!U），S 1 后表达量没有继续增加。因此，选
择 S 1作为试验诱导时间。
图 O 温度对 2L0:!G$K"261-$表达的影响
,-./O 01( (V27(%%-84 89 2L0:!G$K"261-$ $5 >-99(7(45 5(’2(7$5=7(%
) T O：)G，!G，O+ P诱导表达菌液 085$# 2785(-4 -4>=6(>$5 )G，!G，
O+ P；D：蛋白质标准分子质量 H785(-4 ’$7;(7；S，+，*：)G，!G， O+ P破碎上清 W=2(74$5$45$95(7 %=2(7%84-6（)G，!G，O+ P）；C，G，)A：
)G，!G，O+ P 破碎沉淀 B46#=%-84 ?8>3 $95(7 %=2(7%84-6（)G，!G，O+ P）/ !"$ 重组目的蛋白的分离纯化及复性
重组蛋白以包涵体的形式存在，通过G ’8#·NT )
尿素缓冲液进行溶解，然后使用透析袋透析复性，
WFW:HXQL电泳检测结果（图 C）与预期一致，显示通
过分离纯化获得较高浓度（AR+!* ’.·’NT )）和纯度
（*SU）的复性蛋白。
!"% 几丁质酶酶学性质的测定与分析
!RSR) 几丁质酶的定性分析 由图 +可以看出，SA
%N酶液具有较高的几丁质酶活性，在几丁质平板形
*O第 )!期 谢树章等：蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达
图 ! "#$%终浓度对 &’$()*+,-&./0+表达的影响
1023! $/4 45&6477089 8: &’$()*+,-&./0+ 09 ;0::4649< "#$% =：蛋白质标准分子质量 #68<409 >+6?46；)：未加 "#$%的
&’$()*+,-&./0+ @89(09;A.4; &’$()*+,-&./0+；
B C D：分别为 EF=，EFG，=，=FG，) >>8H·IC = "#$% 终浓度诱导的 &’$()*+,-&./0+ "9;A.4; J0=FG，) >>8H·IC = 8: "#$%3 图 G 诱导时间对 &’$()*+,-&./0+表达的影响
1023G $/4 45&6477089 8: &’$()*+,-&./0+ 09 ;0::4649< <0>4
=：空载 &’$()*+（ K）；)：蛋白质标准分子质量 #68<409 >+6?46；B C L：分别加入 EFG >>8H·IC = "#$%诱导
B，!，G，L / "9;A.4; &’$()*+,-&./0+ +< B，!，G，L / 647&4.<0M4HN3 图 L 重组目的蛋白的分离与纯化 1023L$/4 &A60:0.+<089 8: :A7089 &68<409
=：蛋白质标准分子质量 #68<409 >+6?46；
)：纯化复性蛋白 #68<409 +:<46 &A60:04; +9;
64:8H;4;；B："#$%诱导后菌液 &’$()*+,-&./0+
09;A.4; ON "#$%3 成明显的水解圈（!!)FG .>），=EE!I酶液处理的水 解圈更加明显，直径长达 BFG .>，而对照却没有形成 水解圈，初步说明重组复性蛋白具有一定的几丁质 酶活性。 图 D 几丁质酶定性分析 1023D -/0<09+74 +77+N =：GE!I酶液 GE!I 64:8H;4; ./0<09+74； )：=EE!I酶液 =EE!I 64:8H;4; ./0<09+74； B：=EE!I灭活后酶液 =EE!I 09+.<0M+<4; ./0<09+743 )FGF) 几丁质酶的活性检测 以 )P的胶体几丁质 为底物，通过 Q@R法检测出重组复性蛋白的几丁质 酶活性达到 )EE S·>IC =，说明复性蛋白具有较高的 酶活力。 )FGFB 温度及 &T值对活性和稳定性的影响 在不 同的温度下酶解底物，结果如图 *所示，几丁质酶在 !E U活性最高，GE U以下保持活性稳定，*E U接近 失活。但在 E U低温下，活性比 =E，)E U时要高，说 明该几丁质酶在低温下也具有很高的活性。由图 V 可以看出，几丁质酶活性和稳定性在 &T DFE时达到 最高，并随着 &T值的增减，活性和稳定性出现了不 同程度的下降。 图 * 温度对几丁质酶活性,稳定性的影响 1023*$/4 +.<0M0&46+图 V &T值对几丁质酶活性,稳定性的影响
1023V $/4 +.<0M0E! 林 业 科 学 !G卷
! 讨论
本研究从实验室已构建好的蜡梅花 "#$%文库 中克隆到 &个长约& &’( )*的几丁质酶基因 !"#$%&，
该基因编码 !&+个氨基酸，与鳄梨、草地早熟禾等植
物的几丁质酶具有较高的同源性，在 $端有一段长 ,-..的信号肽序列。进化树分析显示 /0.11!几丁 质酶基因从原祖序列分化可能发生在单子叶和双子 叶植物分化之前，与 /0.11"和 /0.11#几丁质酶基因 同源关系较远。而蜡梅 /0.11")几丁质酶与葡萄和 鳄梨 /0.11".几丁质酶作为 & 个独立的分支出现， 是否形成 /0.11"几丁质酶的 & 个新亚型还有待进 一步研究。 一般认为，表达水平过高是包涵体形成的原因 之一（2.3456，&777），在本研究中，通过降低诱导温 度可降低目的蛋白的表达量，但同时并不会促使产 生可溶性目的蛋白。包涵体中杂蛋白含量较低，且 只需要超声破碎和离心就可以与可溶性蛋白分离， 有利于分离纯化。本研究在纯化时先用溶菌酶破碎 细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，显著提高了包 涵体的纯度和回收率。利用’ 890·:; &尿素缓冲液 将包涵体变性溶解，然后通过透析复性，得到浓度和 纯度较高的重组蛋白。几丁质酶活性检测证实复性 后的目的蛋白具有一定的活性，温度梯度试验显示 该酶在低温下同样具有较高的活性，这一点很值得 关注。<4=等（,---）在经过冷驯化的冬黑麦中发现 低温诱导 ,种抗冻蛋白与几丁质酶 />?7、/>?(@具 有很高的同源性，区别只在于少量的化学修饰，推测 是基因复制的结果。蜡梅花具有在腊月寒冬开花的 特性，有很高的耐寒性。本试验获得的蜡梅几丁质 酶基因 !"#$%& 是否与体内抗冻机制有关，尚需进一
步深入研究，其结果对揭示蜡梅花的抗冻机制、丰富
几丁质酶的多抗性研究具有重要意义。
参 考 文 献
董 娜，张增艳，辛志勇 A ,--’ A 病原诱导的小麦 BCD 转录因子
?.BCD&)的原核表达及纯化 A 植物遗传资源学报，7（!）：,’! ;
,’+ A
范艳华 A ,--@ A 球孢白僵菌降解寄主体壁的几丁质酶和蛋白酶的分
子改良 A 西南大学博士学位论文 A
秦 华，眭顺照，李名扬，等 A ,--@ A 蜡梅（ !$%’()&)*$+, "-&.#(/（:A）
:E3F）/GC(&!蛋白基因（!"#(-(&! "’& ）的分子特性与表达分
析 A 中国生物化学与分子生物学报，,,（+）：H(+ ; HH, A
眭顺照，李名扬，蒋 安，等 A ,--+ A 蜡梅花 "#$%文库构建及其高频 出现脂转移蛋白 "#$% 的表达 A 中国农业科学，(-（!）：@(( ;
@(’ A
赵晓芳，王贵禧，王艳娜，等 A ,--’ A 鸭梨果实接种轮纹病菌后的生长
期、贮藏期几丁质酶和$; &，!葡聚糖酶活性变化 A 林业科学，(( （!）：&@, ; &@HA 2.3456 DA &777 A C4"98)E3.3I *J9I4E3 46*J411E93 E3 0,#$.-%#$%& #(1% A /KJJ43I G*E3E93 E3 2E9I4"=3909L5，&-：(&& ; (,& A 29004J M，N4=JE %，O.K"= D， .* &1 A &7’! A /=EIE3.14 E3 )4.3 04.P41： E3QK"IE93 )5 4I=50434，*KJERE".IE93，*J9*4JIE41，.3Q *911E)04 RK3"IE93A S0.3I.，&H+：,,A 2J.QR9JQ OA &7+@ A % J.*EQ .3Q 1431EIEP4 84I=9Q R9J I=4 TK.3IEI.IE93 9R 8E"J9LJ.8 TK.3IEIE41 9R *J9I4E3 KIE0EUE3L I=4 *JE3"E*04 9R *J9I4E3VQ54 )E3QE3LA %3.0 2E9"=48，+,：,(’ ; ,H(A 2J9LK4 W，/=4I X，>900EQ.5 O， .* &1 A &77& A ?J.31L43E" *0.3I1 YEI= 43=.3"4Q J41E1I.3"4 I9 I=4 RK3L.0 *.I=9L43 2$%,(#*()%& ,(1&)% A Z"E43"4，
,H(：&&7( ; &&7+A
N.9 M， 2.K4J O [， Z=9"F045 W C， .* &1 A ,--! A NJ9YI= 9R
=5*4JI=4J89*=E0E" .J"=.493 34-(#(##+, 5+-%(,+, 93 "=EIE3 E3P90P41 IY9
R.8E05 &’ "=EIE3.141A %**0 .3Q B3PEJ93 OE"J9)E90，@7：!&&7 ; !&,’A
>.840 D，29EPE3 C，?J48)0.5 /，.* &1 A &77+ A ZIJK"IKJ.0 .3Q 4P90KIE93.J5
J40.IE931=E*1 .893L "=EIE3.141 9R R09Y4JE3L *0.3I1A M O90 BP90，((（@）：
@&( ; @,( A
>93 [ /，NJERREI= O，O053.JU %，.* &1 A &77H A %3IERJ44U4 *J9I4E31 E3 YE3I4J
J54 .J4 1E8E0.J I9 *.I=9L4341E1VJ40.I4Q *J9I4E31A S0.3I S=51E90，&-7：
’+7 ; ’’7 A
>K3.L \，[=EI4 # N，S5.34 N %A &77+ A /9J3 144Q *J9I4E31 E3=E)EI9J5 I9
6,".-7%11+, 51&8+, .3Q .R0.I96E3 )E9153I=41E1A S=5I9*.I=909L5，’+（@）：
@,, ; @,+ A
WEFK"=E ?，O.1KQ. WA ,--7 A /0.11 # "=EIE3.14 .""K8K0.I4Q E3 I=4 ).JF
IE11K4 E3P90P41 YEI= I=4 "90Q =.JQE3411 9R 1=99I 1I481 E3 =EL=)K1=
)0K4)4JJ5（ 9&##%)%+’ #(-4’:(,+’ :A）A Z"E43IE. >9JIE"K0IKJ.4，&,-：
,!- ; ,!@ A
S.19343 > :，Z4**.343 Z W，#4L4RK <，.* &1 A ,--( A DE40Q *4JR9J8.3"4 9R
"=EIE3.14 IJ.31L43E" 1E0P4J )EJ"=41（ ;.*+1& ".)<+1&）： J41E1I.3"4 I9
RK3L.0 QE14.141A ?=49J %**0 N434I，&-7：H@, ; H+- A
?=.8I=E.3FK0 Z，ZK.3V$L.5 Z，?.3IE8.P.3E"= Z，.* &1 A ,--& A /=EIE3.14 RJ98 ;&#%11+, *$+-%)7%.),%, 1K)1*A "&=%,*&)% A %**0 2E9"=48 2E9I44=390，H@：
!7H ; (-& A
[.I.3.)4 ?，W.3.E C，W.Y.14 ?， .* &1 A &777 A D.8E05 &7 "=EIE3.14 9R
>*-."*(’4#., 1*4"E41："=.J."I4JEU.IE93 .3Q QE1IJE)KIE93A OE"J9)E909L5，
&(H：!!H! ; !!@! A
<4= Z，O9RR.II 2 %，NJERREI= O，.* &1 A ,--- A /=EIE3.14 L4341 J41*931EP4 I9
"90Q 43"9Q4 .3IERJ44U4 *J9I4E31 E3 YE3I4J "4J4.01A S0.3I S=51E90，&,(
（!）：&,H& ; &,@(A
（责任编辑 徐 红）
&(第 &,期 谢树章等：蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达