全 文 ：第 49 卷 第 12 期
2 0 1 3 年 12 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 12
Dec．，2 0 1 3
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20131210
收稿日期: 2013 － 02 － 05; 修回日期: 2013 － 09 － 11。
基金项目: 国家 863 项目(2011AA100203) ; 浙江省农业科技重点项目(2012C12908 － 11，2011C12014，2009R50035) ; 浙江农林大学研究
生科研创新基金项目(3122013240137)。
* 黄华宏为通讯作者。
杉木苯丙氨酸解氨酶基因 ClPAL的克隆与表达分析*
徐莉莉 童再康 林二培 黄华宏
(浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地 临安 311300)
摘 要: 利用 RACE 方法从杉木中分离得到 3 个编码苯丙氨酸解氨酶( PAL)的全长 cDNA 序列，分别为 2 455，
2 418，2 689 bp，编码的氨基酸个数分别为 709，710，709。氨基酸序列分析显示，推导的氨基酸序列包含 PAL-HAL
和 PAL 2 个功能域以及酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA)。荧光定量 PCR 分析表明，虽然 3 个 ClPAL 基因在
调查的器官和组织中皆有表达，但仍表现出一定的组织特异性。ClPAL1 在木质化茎中的表达量明显高于针叶、雌
球花、根和非木质化茎中的表达量，ClPAL3 主要在木质化茎中表达; 二者均在木质部中优势表达，且在中间材中的
表达量高出边材 20 倍以上。ClPAL2 主要在富含韧皮部针叶和皮层中高丰度表达。 IAA、GA3 和 BR 能促进木质部
细胞的分化，与木质素的生物合成有直接或间接的联系。经此 3 种激素处理后，ClPAL1 和 ClPAL3 的表达模式相
似，均受到不同程度的诱导，其中 IAA 和 BR 的诱导效应相对明显; ClPAL2 基因的表达则受到相对弱的抑制。这些
结果说明 ClPAL1 和 ClPAL3 可能主要参与了杉木木材中木质素的合成过程。在应压木诱导形成中，ClPAL1 在应压
区木质部的表达量表现为先下降后上升，处理 10 天后达对照的 1. 4 倍，在对应区木质部中则呈现下调表达;
ClPAL2 在应压区木质部中表现为上调表达，而在对应区木质部中，仅处理 10 天后的表达量明显高于对照; ClPAL3
的表达量变化不是很明显。另外，ClPAL2 基因在中间材中的表达丰度也明显高于边材，是否参与杉木心材特殊色
泽的形成值得深入研究。
关键词: 杉木; PAL 基因; 基因克隆; 基因表达; 木材形成
中图分类号: S718. 46; Q943. 2 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)12 － 0064 － 09
Isolation and Expression of ClPAL Genes in Chinese Fir (Cunninghamia lanceolata)
Xu Lili Tong Zaikang Lin Erpei Huang Huahong
(A Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture Zhejiang Agricultural and Forestry University Linan 311300)
Abstract: In this study，three full-length cDNAs encoding phenylalanine ammonia lyase ( PAL) were isolated from
Chinese Fir (Cunninghamia lanceolata) using RACE． They encode 709，710 and 709 amino acids，respectively，and
their sequence lengths are 2 455，2 418 and 2 689 bp，respectively． The amino acid sequences contain two functional
domains of PAL-HAL and PAL，and the enzyme active site (GTITASGDLVPLSYIA) ． The expression analysis showed that
the three ClPALs differentially expressed in different organs． The expression level of ClPAL1 in lignified stem was higher
than that in needle，male cone，root and non-lignified stem，and ClPAL3 was mainly expressed in lignified stem． Both
genes were predominantly expressed in xylem，and their expression levels in intermediate wood were over 20 times higher
than that in sapwood． ClPAL2 exhibited the high transcript abundance in phloem-enriched needles and bark． IAA，GA3
and BR can promote the differentiation of xylem cells，and thus they should directly or indirectly associate with lignin
biosynthesis． After application of the three hormones，ClPAL1 and ClPAL3 were induced to different extents，and changes
in the expressions were relatively more significant with IAA and BR，indicating that ClPAL1 and ClPAL3 were likely to
play important roles in lignin biosynthesis of Chinese Fir wood tissue． During the compression wood formation， the
expression level of ClPAL1 in the compression area of xylem showed decreased then increased，and reached to 1. 4 times of
the control level after 10 days bending treatment． Its expression levels in the opposite area of the compressed zone were
lower than that of the control． The ClPAL2 expression was up-regulated in the compression wood，and its value in the
opposite wood area was obviously higher than that of the control after 10 days bending． The expression changes of ClPAL3
were not significant compared with the control． In addition，the expression level of the ClPAL2 in intermediate wood was
第 12 期 徐莉莉等: 杉木苯丙氨酸解氨酶基因 ClPAL 的克隆与表达分析
higher than that in sapwood． It deserves further study whether this gene would participate in the formation of the heartwood
color．
Key words: Cunninghamia lanceolata; PAL gene; gene cloning; gene expression; wood formation
木质素( lignin)是苯丙烷衍生物的单体构成的
聚合物，占木材干质量的 15% ～ 35% ( Zhong et al．，
2000)，对木材的形成和品质具有重要影响。因此，
木质素的生物合成已是当前木材形成分子机制解析
的主要内容之一。木质素的合成须经历苯丙烷类途
径和木质素单体特异途径。近十几年来，随着分子
生物学的快速发展，许多参与其中的酶编码基因被
不断地分离和克隆出来(Boerjan et al．，2003; Li et
al．， 2006 )。 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 ( phenylalanine
ammonia-lyase，PAL)催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂
酸，即木质素、黄酮类和水杨酸盐等的前体，它是植
物苯丙烷类途径的第 1 个限速酶，是主代谢和次生
代谢间的重要调控位点。迄今为止，多个来自拟南
芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、
水稻(Oryza sativa)、北美短叶松(Pinus banksiana)、
火 炬 松 ( Pinus taeda ) 和 欧 洲 颤 杨 ( Populus
tremuloides)等植物的 PAL 编码基因已被克隆鉴定
(Cochrane et al．，2004; Nagai et al．，1994; Minami et
al．，1989; Butland et al．，1998; Whetten et al．，1992;
Bagal et al．，2012; Kao et al．，2002)。植物 PAL 基因
家族一般由 2 ～ 6 个成员组成，且不同成员表现出不
同的表达模式和代谢功能。拟南芥基因组中含有 4
个 PAL，突变体分析发现这 4 个基因存在一定的功能
冗余，其中 PAL1 在参与苯丙烷类化合物合成方面比
PAL2 具有更重要的作用，值得注意的是 pal1 pal2 双
缺突变体和 pal1 pal2 pal3 pal4 四缺突变体花序茎中
木质素含量分别仅为野生型的 25% 和 30% 左右
(Rohde et al．，2004; Huang et al．，2010)。研究发现
来自欧洲颤杨的 PtrePAL1 主要在茎、叶、根的积累单
宁的非木质化细胞中表达，且随木质化程度增加而下
降; PtrePAL2 主要在茎的木质化细胞和由非木质化
细胞组成的根尖中表达(Kao et al．，2002)。可见，
PAL 活性高低也是影响木质素含量的关键因子之一。
杉木 ( Cunninghamia lanceolata)是我国重要的
针叶速生用材树种，现阶段材性的改良是其主要育
种目标之一。然而，在材性育种方面国内育种者虽
以杉木木材密度、色泽等性状改良为目标开展了一
些常规育种工作，但涉及木材性状形成分子机制的
研究 相 对 较 少。如，以 独 干 杉 ( Cunninghamia
lanceolata var． duganshan)为材料建立相关的 cDNA
文库和 EST 数据库，并对扩展蛋白基因 ClEXPA1 和
ClEXPA2 进行克隆和异源转化烟草的研究(王桂凤
等，2007; Wang et al．，2007; 2011); 利用高通量测
序技术建立含 8 万余条序列的杉木 EST 数据库，并
对参与纤维素和木质素合成的部分基因进行初步的
表达分析(Huang et al．，2012)。因此，本研究以杉
木速生无性系 B057 为材料，分离 ClPAL 基因序列，
并分析其在不同组织和非生物胁迫处理条件下的表
达特性，探讨其在木质素合成中的功能，以期为后续
以材性改良为目标的分子辅助育种提供重要基因
资源。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
试验材料为杉木速生无性系 B057，栽植在浙江
农林大学实验苗圃，共 10 种器官或组织被采集，取
样时间为 4 月初至 6 月底。其中雌球花 ( female
cone，FC)、雄球花(male cone，MC)取自树冠上部枝
条，根取自同一无性系的水培植株。叶为成熟针叶。
茎取自树冠上部的当年生枝条，分为 2 段，分别标记
为 Stem1 和 Stem2。经解剖观测，Stem1 的木质化区
域很少，可认为是非木质化茎，Stem2 为木质化茎，
具体形态见图 1。在 1 年生茎段的皮层一侧刮取韧
皮部，而剥皮后在木质部一侧刮取厚 2 ～ 3 mm的木
质部。另外，在 11 月截取同一无性系 6 年生植株胸
径部位主干，依据生长年轮分别取边材 ( sapwood，
SW)和中间材( intermediate wood，IW)。所有样品采
集后立即放入液氮中冻存备用。
1. 2 激素处理
茎段的激素处理参照 Karpinska 等(2004)的方
法。在 6 月底采集树冠上部的当年生枝条，将粗细
相对一致的木质化茎段截成 8 cm 段，直立放入
50 mL 旋盖离心管中(每离心管放 1 段)。将不同的
处理溶液加入离心管，使浸没茎段，并真空渗透处理
12 h。处理溶液分别为含 500 μmol·L － 1吲哚 － 3 －
乙酸( IAA)的 1 /2MS、含 5 μmol·L － 1赤霉素 3(GA3)
的 1 /2 MS 和含 0. 5 μmol·L － 1油菜素内酯(BR)的
1 /2MS，以 1 /2MS 溶液为对照。每种处理(含对照)
重复 3 次，结束后分别刮取韧皮部和木质部，并立即
放入液氮中冻存。
1. 3 应压木诱导处理
采用拉弯处理诱导应压木，选取生长相对一致
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林 业 科 学 49 卷
的杉木无性系植株，将其拉弯与垂直方向成 45°角。
在处理 1，6 和 10 天时，截取拉弯部位主干，分别刮
取应压区和对应区木质部，对应样品记为 CW1d，
OW1d，CW6d，OW6d，CW10d 和 OW10d，并迅速放
入液氮中冻存，以未处理的直立植株为对照(CK)。
每次截取 6 株(其中 3 株为对照)。
图 1 试验中使用的植物材料
Fig． 1 Plant materials in the experiments
标尺 Scale A: 100 mm; B － D，G，H: 10 mm; E，F: 60 μm．
A: B057 无性系; B: 雌雄球花; C: 根; D: 当年生枝条(1: 未木质化; 2: 木质化); E，F: 未木质化的茎和木质化的茎的横切片; G:
皮和木质部; H: 针叶。
A: Chinese Fir clone B057; B: Male and female cone; C: Root; D: Current-year branches(1: Non-lignified stem; 2: Lignified stem) ; E，F:
Transverse sections of non-lignified and lignified stem; G: Bark and xylem; H: Leaf．
1. 4 总 RNA 提取及 cDNA 第 1 链的合成
用 PureLinkTM Plant RNA Reagent(上海英骏生
物技术有限公司)提取样品总 RNA。具体提取过程
按照 试 剂 盒 说 明 书 进 行。按 PrimeScriptTM RT
Reagent Kit(TaKaRa)说明将杉木总 RNA 逆转录合
成 cDNA 第 1 链，作为模板待用。
1. 5 ClPAL 序列的分离
在杉木转录组测序基础上，设计 5和 3 RACE
引物。按照 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit
(Clontech)说明书进行 RACE 反应。将得到的目的
片段连接在 PMD 19-T Simple Vector(TaKaRa)上，
转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α，筛选阳性克
隆后送华大基因公司测序。同时，为验证序列的正
确性，在基因的 5 UTR 和 3 UTR 设计引物，进行
PCR 和克隆测序。
1. 6 生物信息学分析
序列比对应用 NCBI 数据库中的 BLASTX，利用
DNASTAR 软件包进行开放阅读框 ( open reading
frame，ORF)确定，氨基酸序列的推测，以及蛋白质
的分子质量、等电点的预测。运用 InterProScan
(http: / /www． ebi． ac． uk /Tools / pfa / iprscan /)数据库
推测蛋白质结构域。蛋白质跨膜区预测、信号肽和
二级结构分析分别采用 TMHMM Server v． 2. 0
( http: / /www． cbs． dtu． dk / services /TMHMM /)，
SignalP 4. 0 Server ( http: / /www． cbs． dtu． dk /
services / SignalP /)和 SOPMA(http: / / npsa-pbil． ibcp．
fr / cgi-bin / npsa． automat． pl? page = /NPSA /npsa _
sopma． html) 工具进行。利用 MEGA 4. 0 的邻接
(Neighbor Joining，NJ)算法构建 PAL 蛋白的系统进
化树(Tamura et al．，2007)。
1. 7 基因表达模式分析
采用荧光定量 PCR 分析 PAL 基因在各样品中
的相对表达量。使用购自 TaKaRa 公司的定量 PCR
专用的 PrimeScript Reagent Kit 和 SYBR Premix
Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)试剂盒，持家基因 Actin
作为内参。
2 结果与分析
2. 1 3 个 ClPAL 基因的克隆及序列分析
在转录组测序(Huang et al．，2012)的基础上，3
个 ClPAL 基因被成功克隆，相应 GenBank 登录号分
别为: JQ904042，JQ904043，JQ904044。3 个克隆基
因的全长在 2 418 ～ 2 689 bp 间变化，对应 ORF 皆
大于 2 110 bp，ORF 序列间的一致性在 59% ～ 64%
间变化，而与对应最高相似度的火炬松 PtPAL 序列
间的一致性则在 73% ～ 76%间变化，说明克隆到的
3 个 ClPAL 是该家族的不同成员，而非等位变异或
同一基因的不同拷贝。推测的 3 个 ClPALs 蛋白分
别由 709，710 和 709 个氨基酸组成，分子质量为
77. 18 ～ 77. 50 kDa，理论等电点 ( pI) 分别为 6. 09，
66
第 12 期 徐莉莉等: 杉木苯丙氨酸解氨酶基因 ClPAL 的克隆与表达分析
6. 35 和 6. 22。氨基酸序列间的一致性变幅为
59% ～ 67%，而它们与相应具最高相似度的火炬松
PtPAL 氨基酸序列间的一致性达 68% ～ 77% (表
1)。
表 1 杉木 ClPAL 蛋白的特征和序列相似性情况①
Tab． 1 Characteristics and amino acid residue identity / similarity of ClPAL proteins
基因
Gene
氨基酸(个)
Number of amino acids
分子质量
Molecular mass / kDa
等电点
Isoelectric point( pI)
相似性 a Identity / Similarity
ClPAL2 ClPAL3 PtPAL
ClPAL1 709 77. 21 6. 09 59 /72 67 /80 (1) b 74 /84
ClPAL2 710 77. 50 6. 35 — 60 /74 (3)68 /80
ClPAL3 709 77. 18 6. 22 — — (4)77 /87
①a: 杉木 PAL 氨基酸序列之间及其与具有最高相似度的火炬松 PAL 氨基酸序列间的比对; b: 括弧中的数字表示来自火炬松的相应
PAL，如 PtPAL1。a: Compared with each other and most similar Pinus taeda PALs; b: Number in brackets indicates the specific PAL from Pinus taeda，
e． g．，PtPAL1．
通 过 与 来 自 拟 南 芥、毛 果 杨 ( Populus
trichocarpa)和火炬松等植物中已鉴定的 PAL 进行
氨基酸序列比对和基序分析，发现 3 个 ClPAL 蛋白
与来自其他植物的 PAL 蛋白一样都含有 PAL-HAL
(histidine ammonia-lyase)和 PAL 功能域，且这 2 个
功能域均含有该类酶的 1 个酶活性中心基序，即 G-
［STG］-［LIVM］-［STG］-［AC］-S-G-［DH］-L-x-P-L-
［SA］-x(2)-［SAV］(图 2)。PAL 蛋白的酶活性中
心还含有 1 个高度保守的三肽 Ala-Ser-Gly，它能通
过环化作用和消除 2 分子水生成亲电子辅基 3，5 －
二氢 － 5 －次甲基 － 4H －咪唑 － 4 －酮(MIO)(Ritter
et al．，2004)。
2. 2 ClPAL 的系统进化树分析
为了分析 ClPALs 与其他物种之间的系统进化
关系，将来自 8 种裸子植物、7 种单子叶植物和 7 种
双子叶植物的共 33 个全长 PAL 氨基酸序列进行比
对和构建系统进化树(图 3)。从拓扑结构看，构建
的进化树可明显分为 3 个主分支，即来自裸子植物、
单子叶植物和双子叶植物的 PAL 分别聚类为一支，
暗示在裸子植物与被子植物或单子叶植物与双子叶
植物分化之前，多数 PAL 可能已进化产生了不同的
类型。在裸子植物分支中，ClPAL1 与来自银杏
(Ginkgo biloba)的 PAL 序列最为相似，并与火炬松
PtPAL1、马尾松 ( Pinus massoniana) PmPAL、海岸松
(Pinus pinaster) PpPAL1 聚为一个亚组; ClPAL2 与
PtPAL3 亲缘关系最近，并进一步与松叶蕨(Psilotum
nudum) PnPAL 聚为一个亚组; 而 ClPAL3 则与
PtPAL4、PtPAL5 聚类在一起。
2. 3 不同器官和组织中 ClPALs 的表达差异
首先利用 RT-PCR、定量 PCR 产物的融解曲线
分析和克隆测序等方法，对设计的 3 对 ClPAL 定量
PCR 引物的特异性和正确性进行验证，结果发现扩
增特异且产物大小、序列正确，可用于后续定量
PCR 分析。图 4A 为检测的 ClPAL 基因在 6 种不同
器官中的表达模式(以叶做参照)。ClPAL1 在 6 个
不同的器官中都有表达，木质化茎中的表达量最高，
其次是在针叶、雌球花和根中。ClPAL2 基因在针叶
中的表达丰度最高，其次是雌球花，在茎、雄球花和
根中的表达量皆小于 0. 1。ClPAL3 在木质化茎中的
表达丰度最高，在针叶、雄球花和根中的表达量中
等，在雌球花和非木质化茎中的表达量最低。为了
进一步研究 ClPAL 基因与木质素生物合成之间的关
系，取木质化茎的皮层和木质部进行基因表达量的
对比分析，结果见图 4B。ClPAL1 在木质部的表达
量是皮层的 10. 1 倍以上; 而 ClPAL2 主要在皮层表
达，其表达量约是木质部的 8. 3 倍。值得注意的是，
ClPAL3 在木质部中的表达量接近皮层的 120 倍，可
能主要在木质化组织中表达。以来自 6 年生主干的
边材和中间材 (心边过渡区) RNA 为模板的定量
PCR 结果(图 4C)表明，ClPAL1，ClPAL2 与 ClPAL3
的表达模式相似，都表现为中间材中的表达量明显
高于边材中的相应数值，相应的差异倍数分别为
20. 7，3. 6 和 144. 7。
2. 4 激素处理对 ClPALs 表达的影响
吲哚乙酸( IAA)、赤霉素 ( GA)和油菜素内酯
(BR)等是调节植物生理反应的活性物质，在形成层
的生长和次生维管组织的形成中具有重要作用
(Ursache et al．，2012)。因此，本研究分析了 IAA、
GA3 和 BR 对木质部中 ClPALs 基因表达的影响(图
5)。经 IAA、GA3 和 BR 处理 12 h 后，ClPAL1 的表
达受到了不同程度的诱导，其中 BR 处理后最为明
显，表达量提高了 2. 1 倍以上; 同样 ClPAL3 的表达
量也得到了提高，且受 IAA 和 BR 的诱导均非常明
显，相应数值是对照的 3. 1 和 4. 5 倍。然而，对于
ClPAL2 基因，经这 3 种激素处理后，其表达则受到
相对弱的抑制，与对照的平均差值在 0. 18 ～ 0. 32 间
变化。
2. 5 应压木形成中 ClPALs 的表达差异
应力木是指在外力作用下造成的弯曲树干或树
枝试图恢复到原来位置，形成的解剖、物理力学性质
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林 业 科 学 49 卷
明显不同的木材( IAWA Committee，1989)。在裸子
植物中，应力木通常出现在倾斜树干或树枝的下部，
被称为应压木。相比正常木，应压木的管胞壁厚、管
胞长度短 (Onaka，1949; Wardrop et al．，1950)、微
图 2 ClPALs 与同源基因的编码区氨基酸序列比对
Fig． 2 Alignment of the deduced amino acid sequences of ORF of ClPALs and homologous genes
At: 拟南芥 Arabidopsis thaliana; Nt: 烟草 Nicotiana tabacum; Ptr: 毛果杨 Populus trichocarpa; Pm: 马尾松 Pinus massoniana; Pt: 火炬松 Pinus
taeda． 圆点 Circle: MIO; 下划线 Underline: 酶活中心 Enzymatic activity center．
明显不同的木材( IAWA Committee，1989)。在裸子
植物中，应力木通常出现在倾斜树干或树枝的下部，
被称为应压木。相比正常木，应压木的管胞壁厚、管
胞长度短(Onaka，1949; Wardrop et al．，1950)、微纤
丝角大且木质素含量高(Wilson et al．，1977; Timell，
1986)。为了探讨 ClPALs 在应压木形成中的作用，
试验中应用荧光定量 PCR 分析其在拉弯处理不同
时间应压区和对应区木质部中的表达变化(图 6)。
ClPAL1 在应压区木质部的表达量表现为先下降后
上升，拉弯处理 6 天时为对照的 0. 5 倍，第 10 天的
相应数值是对照的 1. 5 倍; 而在对应区木质部中的
表达呈现下调，处理第 10 天后的表达量为 0. 5。这
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第 12 期 徐莉莉等: 杉木苯丙氨酸解氨酶基因 ClPAL 的克隆与表达分析
图 3 基于不同物种 ClPAL 氨基酸序列
构建的分子系统树
Fig． 3 Phylogenetic tree derived from the alignment of
the deduced amino acid sequences of different species
At: 拟南芥 Arabidopsis thaliana; Nt: 烟草 Nicotiana tabacum;
Gs: 野大豆 Glycine soja; Gm: 大豆 Glycine max; Er: 大叶桉
Eucalyptus robusta; Ll: 麝香百合 Lilium longiflorum; Lr: 石蒜
Lycoris radiata; Ptr: 毛果杨 Populus trichocarpa; Rp: 刺槐
Robinia pseudoacacia; Gb: 银杏 Ginkgo biloba; Pm: 马尾松
Pinus massoniana; Pp: 海岸松 Pinus pinaster; Pt: 火炬松 Pinus
taeda; Es: 草麻黄 Ephedra sinica; Pn: 松叶蕨 Psilotum nudum;
Pa: 欧 洲 蕨 Pteridium aquilinum; Cl: 杉 木 Cunninghamia
lanceolata; Zm: 玉米 Zea mays; As: 燕麦 Avena sativa; Os: 水
稻 Oryza sativa; Bo: 绿 竹 Bambusa oldhamii; Pe: 毛 竹
Phyllostachys edulis; So: 甘蔗 Saccharum officinarum; Ta: 小麦
Triticum aestivum． ▲: 裸子植物 Gymnosperm; ●: 双子叶植物
Dicotyledon; ◆: 单子叶植物 Monocotyledon．
能部分解释杉木应压木和对应木中木质素含量的变
化趋势。在拉弯处理过程中，ClPAL2 在应压区木质
部中表现为上调表达，第 10 天的表达量为对照的
2. 0 倍; 而在对应区木质部中，仅第 10 天的表达量
与对照间有明显差异，为 1. 7。另外，经拉弯处理
后，ClPAL3 的表达量变化不是很明显，与对照的相
应差值变幅仅在 0. 2 ～ 0. 4 间。
3 讨论
PAL 基因是植物苯丙烷类物质生物合成的重要
调控位点，多以基因家族形式存在。拟南芥基因组
中含 4 个 PAL(Huang et al．，2010)，近来完成测序的
黄瓜(Cucumis sativus)基因组中则有 7 个 PAL 成员
(Shang et al．，2012)。火炬松是裸子植物中具较好
序列信息积累的树种，目前已鉴定出 5 个 PAL 成员
(Bagal et al．，2012)。在前期转录组测序的基础上，
本试验成功分离到 3 个 ClPAL 的全长 cDNA 序列，
且对应氨基酸序列皆含有植物 PAL 蛋白所具有的
特征结构域。Bagal 等(2012)研究认为在不同进化
阶段发生基因重复事件导致产生了 5 个 PtPAL 基
因，且来自早期基因重复的 PAL 成员往往具有不同
的功能，而近期基因重复产生的 PAL 成员在功能上
表现冗余。从进化树分析结果看，3 个 ClPAL 分别
与来自早期基因重复的不同 PtPAL 聚类在一起，暗
示它们也可能来自不同时期发生的基因重复事件，
且具不同功能。不同 PAL 基因的产物具有不同的
功能，参与不同苯丙烷类合成的分支途径，且催化形
成相应的前体，因此，其表达模式也往往不尽相同。
Hamberger 等(2007)研究发现毛果杨的 PtrPAL2 主
要在正在发育的木材组织中表达，与木质素的合成
有关; PtrPAL1 则主要参与缩合单宁的合成。在本
试验中，虽然 3 个 ClPAL 基因在不同的器官和组织
中皆有表达，但仍表现出一定的组织特异性。
ClPAL1 和 ClPAL3 在木质化茎中优势表达，相应表
达量是非木质化茎的 6. 5 倍以上，且在木质化茎中
的表达部位均集中在木质部区域; ClPAL2 主要在
富含韧皮部的针叶和皮层中高丰度表达。这些结果
说明 ClPAL1 和 ClPAL3 可能主要参与了杉木木材组
织的木质化过程。IAA、GA3 和 BR 能促进木质部细
胞的分化，与纤维素、木质素和半纤维素等细胞壁成
分间必然有直接或间接的联系。IAA 被认为能提高
次生木质部细胞的木质化程度，并促进管状分子的
分化 ( Sitbon et al．，1999; Demura et al．，1993 )。
Israelsson 等(2003)通过转基因提高了杂交杨中的
GA 水平，并发现转化植株中木纤维的数目和长度
明显增加。Hossain 等(2012)应用 RNAi 使得拟南
芥的 BR 生物合成受阻，导致转化植株花序茎中的
木质素含量比野生型下降了 38%，且 S /G 木质素单
体比例更低。在本试验中，经此 IAA、GA3 和 BR 处
理 12 h 后，ClPAL1 和 ClPAL3 在木质部中的表达模
式相似，均受到了诱导，尤其是 BR 的诱导效应最为
显著，进一步表明这 2 个基因可能都在杉木木质素
的生物合成中发挥重要作用。然而，在杉木应压木
的诱导形成中，ClPAL1 的表达呈现出与木质素变化
相对一致的模式，而 ClPAL3 的表达却无明显变化。
可见，这 2 个基因仍可能存在不同的调控机制。
中间材是心材和边材之间存在的窄过渡区，是
心材不断形成的区域。试验中发现木质部优势表达
的 ClPAL1 和 ClPAL3 在中间材中的表达量均高于边
材 20 倍以上。而最近的研究报道，在杉木边心材转
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林 业 科 学 49 卷
图 4 不同器官和组织中 ClPALs 基因的相对表达量
Fig． 4 Relative expression levels of ClPALs in different organs and tissues
(A) L: 针叶 Leaf; MC: 雄球花 Male cone; FC: 雌球花 Female cone; R: 根 Root; S1: 未木质化的茎 Non-lignified stem; S2: 木质化
的茎 Lignified stem． (B) B: 树皮 Bark; X: 木质部 Xylem． (C) SW: 边材 Sapwood; IW: 中间材 Intermediate wood．
图 5 激素处理后木质部中 ClPALs 基因的相对表达量
Fig． 5 Relative expression levels of ClPALs in the xylems after treatment with different hormones
图 6 应压木形成中 ClPALs 的相对表达量
Fig． 6 Relative expression levels of ClPALs during the formation of compression wood
CW1d，CW6d 和 CW10d 分别指拉弯处理 1，6 和 10 天的应压木; OW1d，OW6d 和 OW10d 分别指拉弯处理 1，6 和 10 天的
对应木; CK 则指未处理的直立木。The compression woods after the bending of one-day，six-day and ten-day were individually
designated by CW1d，CW6d and CW10d，and the opposite woods were accordingly designated by OW1d，OW6d and OW10d． CK
means the normal wood．
07
第 12 期 徐莉莉等: 杉木苯丙氨酸解氨酶基因 ClPAL 的克隆与表达分析
变过程中，木质素含量和分子结构发生了变化，心材
细胞壁木质素含量高于边材，且木质素交联程度高
于边材 (宋坤霖，2012)。因此，ClPAL1 和 ClPAL3
对于杉木木质素的这种变化可能有重要作用。值得
注意的是，主要在韧皮部表达的 ClPAL2 在中间材中
的表达丰度也显著高于边材。中间材所含薄壁射线
细胞能不断合成各种次生代谢物，如单宁、类黄酮、
木脂体类等，并随着死亡能分散到邻近细胞和空腔，
使心 材 具 有 特 殊 色 泽 ( Hillis， 1996; Pallardy，
2008)。Beritognol 等(2002)研究发现，参与苯丙烷
途径的查尔酮合酶 ( chalcone synthase，CHS)、PAL
在秋季黑核桃( Juglans nigra)中间材中的表达量均
明显高于其他区域的木质部，认为与心材中酚类物
质的积累有关。可见，该基因是否参与单宁、类黄酮
等次生代谢物的合成，与杉木心材色泽的加深有关，
值得深入研究。
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(责任编辑 徐 红)
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