全 文 ：第 v|卷 第 u期
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林 业 科 学
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万寿菊根提取物对山楂叶螨几种酶活性的影响 3
曹 挥 刘素琪 王鸿雷 师光禄
k山西农业大学农学院 太谷 svs{stl
曾鑫年
k华南农大昆虫生态毒理室 广州 xtsywul
摘 要 } 本文用常规生化方法研究了万寿菊的氯仿提取物在光照和非光照条件下对山楂叶螨体内几种代
谢酶活性的影响 o结果表明 }在光照和非光照条件下蛋白酶活性都受到明显抑制 ~谷胱甘肽2≥2转移酶在非光
照条件下被激活 o而在光照条件下被显著抑制 ~山楂叶螨的酯酶同工酶活性在非光照条件下变化不明显 o而在
光照条件下被明显抑制 ∀研究表明 o万寿菊的氯仿提取物有较好的光活化活性 ∀
关键词 } 万寿菊 o山楂叶螨 o蛋白酶 oŠ≥׶o酯酶同工酶
收稿日期 }usst p ts p vt ∀
基金项目 }山西省科技攻关项目k||tssyl o山西省自然科学基金kussuts{zl o山西农业大学青年基金资助项目kussstul o农业部昆虫
生态毒理国家重点开放实验室资助项目kŽsssul ∀
3 师光禄为通讯作者 ∀
ΤΗΕ ΕΦΦΕΧΤΣ ΟΦ ΕΞΤΡΑΧΤΣ ΟΦ ΤΑΤΕΓΕΣ ΕΡΕΧΤΑ ΟΝ ΑΧΤΙςΙΤΙΕΣ ΟΦ
ΣΕς ΕΡΑΛ ΕΝΖΨΜΕ ΟΦ ΤΕΤΡΑΝΨΧΗΥΣ ςΙΕΝΝΕΝΣΙΣ ΖΑΧΗΕΡ
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k Σηανξι Αγρι qΥνιϖ ΤαιΓυsvs{stl
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k Σουτη Χηινα Αγρι qΥνιϖq Γυανγζηου xtsywul
Αβστραχτ } Τατεγεσ ερεχτᬶ¤± ∏¶¨©∏¯ ±¤·∏µ¤¯ ³¯¤±·³¨¶·¬¦¬§¨ ¤¦¦²µ§¬±ª·²·«¨ ©²µ°¨ µµ¨³²µ·¶qŒ±·«¬¶³¤³¨µo·«¨ ©¨©¨¦·¶²±
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Κεψ ωορδσ} Τατεγεσ ερεχταo Τετρανψχηυσϖιεννενσισ ¤¦«¨µo°µ²·¨¤¶¨ oŠ≥׶o∞¶·¨µ¤¶¨ ¬¶²½¼°¨
万寿菊k Τατεγεσ ερεχταl为 t ¤生草本 o是广泛分布于世界各地的观常性植物 ∀近年来研究发现 o它的
根提物对多种昆虫有很好的毒杀作用和光活化活性k²µ¤¯ ²¯2• ­¨¨¶∏¶ot|{z ~°«¬¯²ª¨ ±¨ ετ αλqot|{x ~乐海洋
等 ot||{ ~Œ¶°¤±ot||wl ∀但其杀螨活性在国内并无报道 ∀本实验中发现 o万寿菊根的氯仿提取物对山楂
叶螨k Τετρανψχηυσϖιεννενσισ ¤¦«¨µl有很好的触杀活性 o鉴于螨类以刺吸方式为害 o本文研究了在自然光
照射和非光照条件下 o万寿菊根氯仿提取物内吸处理对山楂叶螨体内几种酶系的影响 o旨在寻找其对螨
类的作用途径 o为进一步开发和利用提供科学依据 ∀
t 材料与方法
111 材料
万寿菊采自山西太谷 o试螨采自山西农业大学果园内 o试验期间禁止施药 ∀
112 方法
t1u1t 活性物质的提取 将采集到的万寿菊根阴干 o置于烘箱中 xs ε 烘干后 o用电动粉碎机粉碎过 ys
目筛 ∀准确称取 ts ª根粉 o用滤纸包好后置于索氏提取仪中 o用氯仿k分析纯ltss °o{s ε 连续抽提 y «
后 o将所得溶液浓缩至浸膏状 o用少量乙醇溶解 o加水配成浓度为每毫升含 vs °ª干粉的溶液备用 ∀
t1u1u 供试叶螨的处理 选取果树向阳部位 t ∗ u ¤生枝条上的健康叶片 o洗净后将柄端插入装有药剂
的试管中浸泡 zu «∀叶片及试管上罩塑料网罩以防失水 ∀zu «后将叶片取出浮贴在 t h的琼脂胶上 o沿
叶缘去除外周多余琼脂后将培养皿中注入少量水以防山楂叶螨逃逸 ∀将每一叶片上接健康活泼 o虫龄
一致的雌成螨 vs头 o使其在光照和非光照条件下取食不同时间后测定酶活性 ∀
t1u1v 酶活性测试 将不同处理的试螨于不同时间制取酶液 o参照5植物化学保护研究方法6k慕立义 o
t||tl中的有关方法进行酶活性测定 ∀
蛋白酶活性测定 }以酪蛋白为底物进行测定 ∀
酶液制备 }分别于非光照条件下处理 { «!ty «!uw «!vu «!ws «!w{ «和光照条件下处理 s qx «!t «!t qx
«!u «后取雌成螨 tss头 o加 s1ux °生理盐水冰浴中匀浆 ots sssµ#°¬±pt ow ε 下离心 tx °¬±o取上清液
备用 ∀
蛋白含量测定 }用 ƒ²¯ ¬¯±酚法测定 ∀取酶液 s1t °加 s1v °生理盐水与 ƒ²¯ ¬¯±2酚甲液 u °混匀静
置 ts °¬±后加 ƒ²¯ ¬¯±2乙液 s1u °摇匀 o在 vs ε 水浴中反应 vs °¬±o于 xss ±°处比色 o测定 ’⁄值 ∀
蛋白酶活性测定 }取制备好的酶液 s1sx °o在 vz ε 水浴中预热 v ∗ x °¬±o加入 t °预热到 vz ε 的
酪蛋白溶液 o混匀后置于 vz ε 水浴中加热 tx °¬±o加入 v °ts h三氯乙酸 o混合后离心 ∀取上清液 t
°o加 x °s1x °²¯#pt碳酸钠 ot °ƒ²¯ ¬¯±2酚试剂 o在 vz ε 水浴中显色 tx °¬±o用分光光度计于 y{s ±°
波长处测光密度值 ∀从绘制好的标准曲线上查出对应的酪氨酸微克数 o确定酶活力大小 ∀
Š≥׶酶活性测定 }酶液制备 !蛋白含量测定同上 ∀
活性测定 }将 yy °°²¯#pt磷酸缓冲液 u1x °!xs °°²¯#pt Š≥‹ s1u °!s1sv °²¯#pt ≤⁄‘…s qsx °
迅速混匀作为对比 o将以上试剂再加 s1t °制备好的酶液作为试样 o在 uz ε 下置于 ˜∂2vss型分光光度
计 vws ±°处 o测定 x °¬±内 ’⁄值变化 ∀
酯酶及同工酶 }用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定k陈长琨 ot||vl ∀
u 实验结果
211 对蛋白酶活性影响
万寿菊氯仿提取物对山楂叶螨体内蛋白酶活性影响见图 t !u ∀
从图 t中可以看出 o山楂叶螨在非光照条件下取食的过程中 o对照组的蛋白酶活性变化与处理组有
所不同 o对照组表现为先上升后又下降的变化过程 o在 ty «时比活力值达到最大 o而处理组则表现为在
小范围内先下降后有所上升的趋势 o且在处理 ty «后酶活性为最低 o此时 o比活力值只有对照组的
xt h ~而在光照条件下 o蛋白酶活性变化与在非光照条件下的变化相似 o试螨接受 u «光照的阶段 o对照
组比活力同样表现为先上升后下降 o而处理组表现为先下降后略有上升 o且在对照组活性达到最大时 o
其活性表现为最小 o此时的比活力值只有对照组的 u{1| h o酶活性受到明显抑制 ∀蛋白酶是生物体内
重要的消化酶系之一 o它活性的高低直接关系着生物体对食物的吸收和利用 ∀在本实验中 o试螨体内蛋
白酶活性的降低 o可能是由于万寿菊氯仿提取物中含有抑制蛋白酶的物质 o影响山楂叶螨对食物的正常
消化 o从而导致机体饥饿死亡 ∀
212 对谷胱甘肽2Σ2转移酶活性的影响
谷胱甘肽2≥2转移酶是螨类体内最活跃的解毒酶系之一 o它能催化有毒的亲电化合物与内源性的还
原型谷胱甘肽进行共轭反应 o保护它的亲核中心 o如蛋白质 !核酸等 ∀脂溶性的外源物质通过轭合作用 o
形成易溶于水的化合物 o再经代谢排出体外 o达到解毒作用 ∀
经万寿菊氯仿提取物处理的螨 o体内谷胱甘肽2≥2转移酶有不同程度变化 o结果见图 v !w ∀在光照和
非光照条件下 o两组试螨的 Š≥׶酶的比活力值均表现为先上升后下降的趋势 o在非光照过程中 o处理组
的比活力值在处理的 s ∗ vu «区域大于对照组 o尤其在处理后的 uw «o对照组的比活力值只有处理组的
ww h oŠ≥׶酶活性被激活 ~而光照条件下 o试螨在接受光照 u «的过程中 o处理组的酶比活力值在光照后
的 s1x ∗ t1x «区域值却低于对照组 o在处理后 s1x «o处理组的酶活性为对照组的 xx h o在该过程中 o
xtt 第 u期 曹 挥等 }万寿菊根提取物对山楂叶螨几种酶活性的影响
Š≥׶酶的活性受到一定抑制 ∀
图 t 万寿菊氯仿提取物内吸处理对山楂叶螨
蛋白活性影响k非光照l
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) ρ ) 氯仿提取物 ∞¬·µ¤¦·²©¦«¯²µ²©²µ°
) m¿) 对照 ≤Ž下同 ׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
图 u 万寿菊氯仿提取物内吸处理对山楂叶螨
蛋白酶活性影响k光照l
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图 v 万寿菊氯仿提取物内吸作用对山楂叶螨
Š≥׶酶活性影响k非光照l
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图 w 万寿菊氯仿提取物内吸作用对山楂叶螨
Š≥׶酶活性影响k光照l
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213 对酯酶同工酶的影响
万寿菊氯仿提取物对山楂叶螨体内酯酶同功酶作用后的凝胶电泳图谱见图 x ∀
图 x 万寿菊氯仿提取物内吸处理对山楂叶螨酯酶同工酶活性影响
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图中 t ∗ x为用万寿菊氯仿提取物处理山楂叶螨雌成螨 { «!uw «!vu «!ws «!w{ «后酯酶活性变化 otχ ∗ xχ为对照组处理 { «!uw
«!vu «!ws «!w{ «后酯酶活性变化 os为新鲜对照 osχ为处理后立即供试的成螨 o¤∗ ¥为万寿菊氯仿提取物光照处理雌成螨 s1x «!t
«!t qx «!u «后酯酶活性变化 o¤χ ∗ ¥χ为对照组光照处理雌成螨 s1x «!t «!t qx «!u «后酯酶活性变化 ∀ k酶带由上到下依次为辅酶
带 t !u o主酶带l
t ∗ x µ¨³µ¨¶¨±·¨ ©©¨¦·¶²±·«¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶²© ¶¨·¨µ¤¶¨ ¬¶²½¼°¨²© Τετρανψχηυσϖιεννενσισ ¤¦«¨µ¤¥¶²µ¥¬±ª ¬¨·µ¤¦·²©¦«¯²µ²©²µ° ¤©·¨µ{«!uw«!vu
«!ws «!w{ «±²2¯¬ª«·¬±ª~tχ ∗ xχ µ¨³µ¨¶¨±·¨©©¨¦·¶²± ≤Ž²©±²2¯¬ª«·¬±ªqs¬¶≤Ž²© ¬¯√¬°ª°¬·¨¶qsχ¬¶µ¨³µ¨¶¨±·°¬·¨¶º«¬¦«º µ¨¨ ·¨¶·¨§¤·²±¦¨ ¤©·¨µ
·µ¨¤·¨§q¤∗ §µ¨³µ¨¶¨±·¨ ©©¨¦·¶²±·«¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶²© ¶¨·¨µ¤¶¨ ¬¶²½¼°¨ ²© Τετρανψχηυσϖιεννενσισ ¤¦«¨µ¤¥¶²µª¬±ª ¬¨·µ¤¦·²©¦«¯²µ²©²µ° ¤©·¨µ¯¬ª«·¬±ªs q
x «!t «!t qx «!u «~¤χ ∗ §χ µ¨³µ¨¶¨±·¨©©¨¦·¶²± ≤Ž²© ¬¯ª«·¬±ªq
ytt 林 业 科 学 v|卷
从图 x中可以看出 o万寿菊氯仿提取物处理后 o在凝胶电泳图谱上可明显的看到 v条酯酶酶带 }Α!
Β!Χo用光照和非光照处理时 o这三条酯酶酶带变化有所不同 o其中 Χ带基本无变化 o而 Α和 Β带变化较
大 ∀处理 s «与新鲜对照相比 o其 Α!Β带颜色较粗 !较深 ~在非光照处理时 o从图上可以看出处理组的这
两条酶带在颜色和粗细上大都弱于对照组 o尤其在处理的 vu «和 ws «o这种现象尤为明显 ~在光照处理
中 o处理组的变化与对照组相比 o也出现了同样的情况 o并且 o从整体上来看 o这种减弱辐度比非光照处
理时明显 ∀另外从处理后酯酶酶带随时间的变化趋势上来看 o处理组的酶带无论在光照还是非光照条
件下 o酶带有逐渐减弱的现象 o而在两个对照组中 o没有这种趋势 o并且变化不明显 ∀酯酶也是生物体内
重要的解毒酶系之一 o当外源有毒物质进入生物体内时 o会激活酯酶进行解毒代谢 o其活性的升高往往
是许多害虫产生抗药性的标志之一 o而当其活性受到抑制时 o会导致生物体内有毒物质进行积累 o产生
中毒作用 o从而引起死亡 ∀从本实验的结果来看 o处理组酯酶酶带颜色和粗度的减弱 o可能与其活性受
到一定的抑制有关 ∀
v 讨论
万寿菊是一种高效的杀虫植物 o尤其是它的光活化活性 o目前关于万寿菊杀虫活性和光活化活性的
报道有很多 o但这些报道大都集中于鳞翅目 !同翅目害虫及仓储害虫 o对螨类的光活化活性和作用机制
的研究却开展很少 ∀本实验中发现万寿菊对山楂叶螨有很好的杀虫效果 o并且发现山楂叶螨取食用浓
度为 vs °ª#°ptk植物干粉的浓度l的药液处理的万寿菊叶片 o并经自然光照射 s1x «后 o出现极度兴
奋 o虫体痉挛 o肢体竭力向外伸开 o头向后仰 o腹部上翅 o并在原地翻腾跳跃 ot1x «后出现死亡的个体 o因
此对其作用机理进行了初步的研究 ∀
通过万寿菊氯仿提取物对山楂叶螨体内几种酶系的影响发现 o万寿菊氯仿提取物在光照条件下 o处
理组与对照组相比 o蛋白酶 !谷胱甘肽2≥2转移酶的活性受到一定程度的抑制 o并且酯酶酶带颜色和粗度
减弱 ~而在非光照条件下 o与对照相比 o处理组的蛋白酶活性受到抑制 o谷胱甘肽2≥2转移酶的活性增加 o
而酯酶酶带无明显变化 ∀外源性有毒物质在生物体内的代谢要先经过氧化 !还原 !水解等原发性代谢过
程降解 o再经过轭合等继发性代谢过程形成易溶于水的化合物 o排出体外 ∀其中水解和轭合是昆虫解毒
代谢的重要方式 o由一系列酶系催化完成k张宗炳 ot|{|l ∀酯酶和谷胱甘肽2≥2转移酶便是普遍存在于生
物体内最重要的两种解毒酶系 ∀
酯酶具有广泛的底物专一性和重迭性 o在杀虫药剂代谢中不需要额外能量即可催化酯类化合物水
解 o当外源有害物质侵入生物体内时 o该酶会积极参与解毒代谢k宗静等 ousss ~吴青君 ot||{l ∀这种高
效的解毒代谢体系在生物体与外界不良环境因子的斗争过程中很可能发挥重要作用 ∀谷胱甘肽2≥2转
移酶能催化生物体内的还原型谷胱甘肽kŠ≥‹l与外源化合物的亲电子基团发生轭合 o最终形成硫醚氨
酸排出体外 o此外 o该酶在谷胱甘肽过氧化物酶kŠ≥‹2°÷l活力高的条件下 o还具有清除体内脂质过氧化
物k°’l的功能 o因此 oŠ≥×兼有消除体内过氧化物及解毒的双重功能 oŠ≥×的升高可作为动物组织损伤
的敏感指标k沈同等 ot||s ~深见顺一 ot||wl ∀从本实验结果来看 o光照条件下 o处理组这两种酶活性受
到抑制可能会使螨体内的正常解毒代谢受到影响 o从而导致有毒物质在螨体内积累 o引起死亡 ∀而谷胱
甘肽2≥2转移酶活性的升高 o可能是由于万寿菊氯仿提取物中的有毒物质在其体内的增多而导致其解毒
代谢的增加 ∀
在本实验中蛋白酶在光照和非光照条件下都有所降低说明 o在万寿菊氯仿提取物中存在着光活化
和非光活化物质 o它们都对螨体内的蛋白酶有抑制作用 o影响其正常的生理消化功能 ∀
综合本实验的结果可以看出 o万寿菊氯仿提取物对山楂叶螨的生物活性主要属于光活化活性 o在万
寿菊中主要的光活化物质为 Α2三噻吩 o但由于螨类在生物学方面有很多地方区别于昆虫 o因此其主要杀
螨有效成分 o仍需进一步的研究 ∀另外 o从黑暗条件下各处理的各项指标来看 o万寿菊氯仿提取物中可
能也存在着不依赖于光活化活性的其它活性物质 o需进行深入分析研究 ∀
值得提出的是螨类个体比较微小 o要获得大量均匀一致的研究材料较为困难 o并且在螨类的生理生
ztt 第 u期 曹 挥等 }万寿菊根提取物对山楂叶螨几种酶活性的影响
化实验中不可能进行组织解剖 o只能整体磨碎匀浆 o这样酶活性可能很低 o甚至测不到酶活性 o因此在螨
类的生理生化实验中不可避免的会出现误差 o这也是目前螨类生理生化研究开展不多的原因之一 ∀
参 考 文 献
陈长琨主编 q昆虫生理生化实验 q北京 }中国农业出版社 ot||v
慕立义主编 q植物化学保护方法 q北京 }中国农业出版社 ot||t
深见顺一 q农药实验法 ) ) ) 杀虫剂篇 q北京 }中国农业出版社 ot||w }uxt ∗ uyu
沈 同 o王镜岩 q生物化学k下册l q北京 }高等教育出版社 ot||s }u{v ∗ u{x
吴青君 q小菜蛾对定虫隆的抗性生化机制初探 q昆虫学报 ot||{ owtk≥∏³l }wu ∗ wz
乐海洋 o赵善欢 q万寿菊提取物对白纹伊蚊幼虫的光活化活性及有效成分研究 q华南农业大学学报 ot||{ ot|kul }{ ∗ tu
张宗炳 o樊德方 q杀虫药剂的环境毒理学 q北京 }农业出版社 ot|{| }{ ∗ tu
宗 静 o张 帆 q繁殖寄主对赤眼蜂羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的影响 q昆虫学报 ousss owvk≥∏³l }zs ∗ zy
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{tt 林 业 科 学 v|卷