全 文 ：第 v{卷 第 v期
u s s u年 x 月
林 业 科 学
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¤¼ou s s u
银杏茎段试管培养条件筛选研究
胡蕙露 杨景华 杨荻荣 王 勇
k安徽农业大学 合肥 uvssvyl
摘 要 } 本研究采用 ≥培养基 o附加不同浓度的活性炭 !y2…„ !‘„„ o按正匀表 |kvwl前 v列形成 v因素 !v
水平的不同配比 o比较了银杏茎段试管培养的植株再生效果 o分析了不同培养基中不同激素浓度配比及有无
活性炭对茎段分化的影响 o并对取自不同阶段不同生长期的银杏茎段的植株再生能力进行了比较 ∀试验结果
表明 o以 ≥培养基 n活性炭 s1x h n y2…„t1s °ª#pt n ‘„„s1t °ª#pt配方对茎段分化和植株再生效果最好 ~
各因素中 o活性炭的正向效果最显著 ~取材时间以 w月中 !下旬为佳 ∀
关键词 } 银杏 o茎段 o组织培养 o正交试验
收稿日期 }ussu2su2st ∀
tl 沈敏娟 q银杏之组织培养 q台湾大学森林学研究所硕士论文 ot||u }v ∗ x q
ΣΤΥ∆Ψ ΟΝ ΣΤΕΜ ΣΕΧΤΙΟΝ ΧΥΛΤΥΡΕ ΧΟΝ∆ΙΤΙΟΝΣ ΙΝ ςΙΤΡ Ο ΙΝ ΓΙΝΚΓΟ ΒΙΛΟΒΑ
‹∏‹∏¬¯∏ ≠¤±ª¬±ª«∏¤ ≠¤±ª⁄¬µ²±ª • ¤±ª ≠²±ª
kΑνηυι Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ηεφειuvssvyl
Αβστραχτ } ׫¨ ·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ ²©·«¨ ¶·¨° ¶¨¦·¬²±¬± Γινκγο βιλοβᦤµµ¬¨§²∏·¬±·«¨ ³¤³¨µo∏¶¬±ª ≥ °¨ §¬∏° º¬·«·«¨ ¤§2
§¬·¬²± ²©§¬©©¨µ¨±·¦²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²©¤¦·¬√¤·¨§¦¤µ¥²±oy2…„ ¤±§‘„„ q׫¨ ²µ·«²ª²±¤¯ ·¤¥¯¨|kvwlº¬·«·«¨ ¦²°³²∏±§²©
·«µ¨¨¨¯ °¨¨ ±·¶º¬·«·«µ¨¨¯¨ √¨ ¶¯º¤¶¶¨¯¨ ¦·¨§q׫¨ √¤µ¬²∏¶¤¦·¬²±¶²±·«¨ ¦∏¯·∏µ¨ ©¨©¨¦·º¨ µ¨ ¤±¤¯¼¶¨§o¶∏¦«¤¶§¬©©¨µ¨±·«²µ2
°²±¨ o¬±¦¯∏§¬±ª¤¦·¬√¤·¨§¦¤µ¥²± ²µ±²·o¤±§·«¨ µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ¤¥¬¯¬·¼ ²©¶·¨° ¶¨¦·¬²±¬± §¬©©¨µ¨±·ªµ²º·«³¨µ¬²§q׫¨ µ¨¶∏¯·¶
¶«²º¨ §·«¤··«¨ ≥ °¨ §¬∏° º¬·«¤¦·¬√¤·¨§¦¤µ¥²±s qx h n y2…„t qs °ª#pt n ‘„„ s1t °ª#pt º¤¶·«¨ ¥¨¶·©²µ·«¨ ¦∏¯2
·∏µ¨ ²©¶·¨° ¶¨¦·¬²±¬± Γινκγο βιλοβαqŒ± ¤¯¯¨¯ °¨¨ ±·¶o·«¨ ³²¶¬·¬√¨ ©¨©¨¦·²©¤¦·¬√¤·¨§¦¤µ¥²± º¤¶·«¨ °²¶·²¥√¬²∏¶q׫¨ ³µ²³2
µ¨·¬°¨ ²©¶¤°³¯¬±ªº¤¶¬±·«¨ °¬§§¯¨¤±§ ¤¯¶··¨± §¤¼¶²©„³µ¬¯q
Κεψ ωορδσ} Γινκγο βιλοβαo≥·¨° ¶¨¦·¬²±o׬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨k¬± √¬·µ²¦∏¯·∏µ¨l o’µ·«²ª²±¤¯ ¬¨³¨µ¬°¨ ±·
银杏是新生代第四纪冰川期的孑遗树种 o为我国独存的珍稀名贵树种 ∀它既可作为园林绿化和观
赏树种 o也是优良木材 o且其种子 !叶片富含营养及药用成分 ∀银杏的用途广泛 o经济价值很高 ∀随着银
杏开发利用及其潜在价值的不断发现 o发展良种银杏产业势在必行 ∀特别是西部地区的开发 o对银杏苗
木的大量需求更是迫在眉睫 ~但银杏是雌雄异株的裸子植物 o生长周期长 ∀应用现代生物技术 o对银杏
苗木进行快速繁殖和工厂化生产 o具有极大的现实意义 ∀
组织培养的最大优点是大量快速繁殖 o可以用极少量的材料获取大量幼苗 ~正交试验是一种理想的
部分试验设计方案 ∀在银杏组织培养方面 o前人和同行们做了很多卓有成效的研究工作 ∀但迄今所见
多以幼胚 !胚乳为外植体k李继侗 ot|{y ~王伏雄等 ot|yv ~t|yx ~吴元立等 ot||{ ~≤¤µµ¬¨µετ αλqot||sl o或以
胚切段胚轴部位培养k罗紫娟 ot|{wl o以及采用种仁 !胚 !胚轴 !子叶 !成熟株腋芽等为外植体tl ~以成熟株
材料进行组培则少见获得理想结果kŠ∏³·¤ ετ αλqot|{z¤l ∀本研究采用植物组织培养法 o在合适时间采
取银杏当年生茎段 o按正交试验设计对银杏进行了条件筛选研究 o通过正交试验从多个因素中找出影响
试验结果的各因素的主次顺序和交互作用 o从中找出最佳结果 o并确定了培养基中最显著影响因素 ∀
t 材料和方法
111 试验材料
接种材料为 w月份生长旺盛的银杏多年生植株上当年抽生幼嫩茎段 o剪去叶片 o截取带芽外植体 ∀
112 新材料消毒
将截取的带芽外植体清水浸泡清洗 o再用 zs h酒精消毒 vs¶o无菌水冲洗 v ∗ x遍后转入无菌条件
下 o用 s1t h的升汞浸泡 ts °¬±o取出材料再用无菌水冲洗 v ∗ x遍 ∀在无菌条件下将外植体切成 s1{ ∗
t1s¦°的茎段 o每个茎段带一个芽 o转入消毒过的培养皿中备用 ∀
113 培养基配制
本试验采用 ≥基本培养基 o附加 v种不同浓度的活性炭 !y2…„ !‘„„ o按正交表 |kvwl前 v列列成
不同的试验配比 o正交表中列号 t !u !v分别对应活性炭 !y2…„ !‘„„ v个因素 o活性炭列对应 v个水平 }
≠ s o s1u h o≈ s1x h ~y2…„列对应 v个水平 }≠ t1s °ª#pt o u1s °ª#pt o≈ v1s °ª#pt ~‘„„列对应 v
个水平 }≠ s1t °ª#pt o s1x °ª#pt o≈ t1s °ª#pt ∀培养基蔗糖浓度为 vs ª#pt ∀正交表和 |种培养
基的详细配比如表 t和表 u ∀
表 1 正交表
Ταβ .1 Ορτηογοναλ Ταβλε
试验号
‘²q²© ¬¨³¨µ¬°¨ ±· t u v
t ≠ ≠ ≠
u ≠  ≈
v ≠ ≈ 
w  ≠ ≈
x   
y  ≈ ≠
z ≈ ≠ ≠
{ ≈  
| ≈ ≈ ≈
表 2 培养基配比表
Ταβ .2 Μεδιυµ φορµυλατιον
序号
‘²q²©
¶¨ ∏´¨ ±¦¨
培养基配方
 §¨¬∏° ©²µ°∏¯¤·¬²±
培养基
 §¨¬∏°
活性炭
„¦·¬√¤·¨§¦¤µ¥²±k h l
y2…„
k°ª#ptl
‘„„
k°ª#ptl
t ≥ s t1s s1t
u ‘≥ s u1s t1s
v ≥ s v1s s1x
w ≥ s1u t1s t1s
x ≥ s1u u1s s1x
y ≥ s1u v1s s1t
z ≥ s1x t1s s1t
{ ≥ s1x u1s s1x
| ≥ s1x v1s t1s
114 培养基及实验器具的消毒
将培养基及接种所需各种器皿均放入高压锅内消毒 ~压强升至 s1x ®ª#¦°pu时打开阀门放出冷空
气 o继续加热 o压强升至 t1t ®ª#¦°pu时 o计时 us °¬±停止加热 o自然冷却后取出放入接种室备用 o³‹ 值
调节为 x1w ∗ x1{ ∀
115 培养的环境条件
银杏茎段培养温度为 ux ε ? u ε o光强为 tsss ∗ usss ∏¬的日光灯照明 ots «光照 otw «黑暗 ∀
u 结果与分析
211 银杏茎段培养芽分化和增殖表现
u1t1t 各培养基对银杏茎段分化影响 银杏茎段接种以后 o根据培养基中活性炭及激素配比的不同 o
各组合都程度不同地出现器官发生现象 o其中没有加活性炭的前 v组配比中均只出现愈伤组织和芽点 o
有活性炭的后 y组配比均有芽分化 o实验结果如表 v所示 ∀
表 v表明 o茎段分化率以 x !z !{号为最高 o达 tss h o其中均加有活性炭成分 ∀
u1t1u 各培养基对银杏微繁增殖影响 分化的茎段进行继代培养 ∀银杏茎段经过继代培养 t| §后 o各
培养基中茎段萌芽均有不同程度增殖k发叶 !萌芽l o折算成百分比列入表 w ∀
表 w的统计结果表明 o第 z种培养基 ≥ n活性炭 s1x h n y2…„t1s °ª#pt n ‘„„s1t °ª#pt增殖率
最高 o达 y{ h ∀
无论是分化率还是增殖率 o活性炭的最佳浓度为第 v个水平 „v }s1x h oy2…„的最佳浓度为第 u个
水平 …u }u1s °ª#pt o‘„„的最佳浓度为第 u个水平 ≤u }s1x °ª#pt o过高或过低均不利于萌芽率和分化
vx 第 v期 胡蕙露等 }银杏茎段试管培养条件筛选研究
率的提高 ∀图 t和图 u为不同水平浓度的各因素作用曲线图 ∀
从两个曲线图可以清晰地看出 o以茎段为外植体的分化和增殖趋势随活性炭浓度增大而增大 ~y2…„
与 ‘„„则不然 o均以浓度适中ky2…„水平 u1s °ª#pt ~‘„„水平 s1x °ª#ptl为宜 o过大或过小其效果都
呈下降趋势 ∀
表 3 接种 10 δ 时茎段分化率测试结果 ≠
Ταβ .3 ∆ιφφερεντιατιον περχενταγε οφστεµ
σεχτιον ινοχυλατεδ φορ 10 δαψσ
序号
‘²q²©
¶¨ ∏´¨ ±¦¨
活性炭
„¦·¬√¤·¨§
¦¤µ¥²±k h l
y2…„
k°ª#ptl
‘„„
k°ª#ptl
分化率
•¤·¬²²©
§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±k h l
t s t1s s1t ws
u s u1s t ws
v s v1s s1x ws
w s1u t1s t wx
x s1u u1s s1x tss
y s1u v1s s1t ux
z s1x t1s s1t tss
{ s1x u1s s1x tss
| s1x v1s t yy1z
Τt tus t{x tyx
Τu tzs uws uws
Τv uyy1z tvt1z txt1z
Ξt ws yt1z xx
Ξu xy1z {s {s
Ξv {{1| wv1| xs1y
Ρ w{1| vy1t u|1w
表 4 继代培养 19 δ 时增殖率测试结果 ≠
Ταβ .4 Ρεπροδυχτιον περχενταγε οφσυβχυλτυρε αφτερ 19 δαψσ
序号
‘²q²©
¶¨ ∏´¨ ±¦¨
活性炭
„¦·¬√¤·¨§
¦¤µ¥²±k h l
y2…„
k°ª#ptl
‘„„
k°ª#ptl
增殖率
•¤·¬²²©
µ¨³µ²§∏¦·¬²±k h l
t s t s1t us
u s u t vs
v s v s1x vs
w s1u t t wu
x s1u u s1x xs
y s1u v s1t vy
z s1x t s1t y{
{ s1x u s1x ys
| s1x v t vv1v
Τt {s tvs tuw
Τu tu{ tws tws
Τv tyt1v ||1v tsx1v
Ξt uy1z wv1v wt1v
Ξu wu1z wy1z wy1z
Ξv xv1{ vv1t vx1t
Ρ uz1t tv1y ts1y
≠ Τt ∗ Τv 为各因素每一水平之和 ~Ξt ∗ Ξv 为各因素每一水平之平均 ~Ρ为最大与最小水平间距 ∀ Τt ∗ Τv ¶«²º¬±ª·«¨ ¶∏° ²© √¨¨ µ¼ ©¤¦·²µo
Ξt ∗ Ξv ¶«²º¬±ª·«¨ ¤√¨ µ¤ª¨ ²© √¨¨ µ¼ ¯¨ √¨¯ ©µ²° ¤¨¦«©¤¦·²µoΡ ¶«²º¬±ª·«¨ §¬©©¨µ¨±¦¨ ¥¨·º¨¨ ± °¤¬¬°∏° ¤±§°¬±¬°∏° q
图 t 不同浓度各因素对分化率影响的曲线图
ƒ¬ªqt ≤∏µ√¨ ¶²© ©¨©¨¦·¶²© ¤¨¦«©¤¦·²µº¬·«
§¬©©¨µ¨±·¦²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²± §¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±µ¤·¨
图 u 不同浓度各因素对增殖率的影响曲线图
ƒ¬ªqu ≤∏µ√¨ ¶²© ©¨©¨¦·¶²© ¤¨¦«©¤¦·²µº¬·«§¬©©¨µ¨±·
¦²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²± µ¨³µ²§∏¦·¬²± ³¨µ¦¨±·¤ª¨
) σ ) „¦·¬√¤·¨§¦¤µ¥²±k h l ~) υ ) y2…„k°ª#ptl ~) ω ) ‘„„k°ª#ptl q
u1u1u 各因素影响结果的方差分析表 表 x与表 y结果表明 ov个因素对继代 t| §时的增殖率影响其
不同水平之间的差异都达到显著或极显著水平 ~对接种 ts §时的分化率影响 o只有活性炭各水平之间
达到显著水平 oy2…„和 ‘„„都未达到 ∀进一步说明活性炭及其水平高低对银杏茎段的快繁作用不可
低估 ∀
wx 林 业 科 学 v{卷
表 5 接种 10 δ 时分化率方差分析表 ≠
Ταβ .5 ς αριανχε αναλψσισ οφ διφφερεντιατιον ρατε
φορ 10 δαψσ αφτερ ινοχυλατιον
试验因素
ƒ¤¦·²µ¶²©
¬¨³¨µ¬°¨ ±·
平方和
≥∏° ²©¶´∏¤µ¨
自由度
⁄¨ ªµ¨¨²©
©µ¨ §¨²°
方差
∂¤µ¬¤±¦¨
Φ值
Φ √¤¯∏¨
活性炭
„¦·¬√¤·¨§¦¤µ¥²± tttv qyu u xxy q{t v qwu
3
y2…„ u|| q{| u tw| q|x s q|uw
‘„„ ust qs| u tss qxx s qyt|
误差 ∞µµ²µ vuw qy{ u tyu qvw
总和 ≥∏° t|v| qu{ {
≠ Φs1ux € v1s ~Φs1ts € |1s q
表 6 继代 19 δ 时增殖率方差分析表 ≠
Ταβ .6 ς αριανχε αναλψσισ οφ ρεπροδυχτιον ρατε
φορ 19 δαψσ αφτερ συβχυλτυρε
试验因素
ƒ¤¦·²µ¶²©
¬¨³¨µ¬°¨ ±·
平方和
≥∏° ²©¶´∏¤µ¨
自由度
⁄¨ ªµ¨¨²©
©µ¨ §¨²°
方差
∂¤µ¬¤±¦¨
Φ值
Φ √¤¯∏¨
活性炭
„¦·¬√¤·¨§¦¤µ¥²± vzsz q|y u t{xv qw{ tu qz{
3 3
y2…„ t|xw q|y u |zz qw{ y qzw 3
‘„„ txts q|y u zxx qw{ x qut 3
误差 ∞µµ²µ u|s qsu u twx qst
总和 ≥∏° zwyv q|s {
≠ Φs1ux € v1s ~Φs1ts € |1s q
213 不同采样时间对茎段分化率的影响
采样时间的不同 o茎段的幼嫩程度不同 o太嫩则在消毒时细胞容易失活而造成外殖体的死亡 o但如
果木质化程度高则容易感染 o成活率也会随之下降 o同时 o木质化程度高细胞分化难 o从而导致分化率的
下降 ∀
表 7 不同采样时间对外植体分化率的影响
Ταβ .7 Τηεινφλυενχε οφ διφφερεντ σαµπλινγ τιµε
ον διφφερεντιατιον ρατε οφ εξπλαντατιον
采样时间 ≥¤°³¯¬±ª·¬°¨ wΠy wΠuz xΠvs
接种数 ‘²q²©¬±²¦∏¯¤·¬²± xw vy ys
形成数目 ‘²q²©§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± wy vv wu
分化率 •¤·¬²²©§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±k h l {x |u zs
表 z为不同采种时间对分化率影响的分析结
果 o从中可以看出适宜采样时间为 w月中 !下旬 ∀过
早或过晚都会影响萌芽率的提高 ∀
v 结论
银杏茎段试管培养研究 o从国内外一些文献记
载来看 o成功的例子不多 o这与试验材料取样时间 !
培养基配方 !培养条件等多种因素有关 o本次试验以
多年生植株 w月中 !下旬当年抽生茎段为材料 o选择 ≥基本培养基辅以适宜的其它条件 o可以取得较
好的成效 ∀
311 银杏茎段试管培养再生途径
银杏组织培养利用茎段微繁 o存在先诱导愈伤组织 !后分化或直接分化 !增殖的两种再生途径 o从本
试验结果与笔者先前所做试验k胡蕙露等 ot||zl可以互相验证 ~分析原因主要受培养条件和取样时间制
约 ∀
312 银杏茎段试管培养最佳条件筛选
正交试验及其方差分析筛选出最佳培养基为 ≥ n活性炭 s1x h n y2…„t1s °ª#pt n ‘„„s1t °ª#
pt o其分化率最高 ~就各因素而言 o活性炭以 s1x h水平最佳 oy2…„以 u1s °ª#pt水平最佳 o‘„„以 s1x
°ª#pt水平为宜 ∀培养基组合之间的协调与各因素的临界最佳发挥并不矛盾 ∀
313 活性炭对银杏茎段试管培养的作用
在银杏茎段培养中 o活性炭对外植体芽的分化和培养增殖 o具有非常重要的作用 o较之激素 y2…„和
‘„„效果明显 ~随着活性炭水平k浓度l的提高 o分化率 !增殖率都呈上升趋势 ∀活性炭为 v个因素中最
活跃的因素 o并有防止褐化和促进生长的效果 ∀高于 s1x h浓度的活性炭作用有待试验 ∀活性炭是银
杏组织培养中关键 !敏感的培养条件 o而这一点 o一直没有受到很多甚至富有经验的组培研究者所重视 ∀
314 取样时间对银杏茎段试管培养的影响
取样时间对植株分化和再生有一定影响 o最佳取样时间为 w月中 !下旬 o过早或过晚分化率都有所
下降 ~可能与银杏成熟植株本身各发育阶段有关 ∀
xx 第 v期 胡蕙露等 }银杏茎段试管培养条件筛选研究
315 银杏组织培养的应用
银杏组织培养在生产上的应用和推广前景广阔 ~可以肯定的是 o它必将为银杏工厂化生产及银杏遗
传资源的保存和利用 o提供一定的应用价值和学术价值 ∀
参 考 文 献
陈耀华 o董鹏举 o白恒勤 q银杏组培育苗试验初报 q北京林业大学学报 ot|{{ otsk增刊l }tsy ∗ ts|
胡蕙露 q银杏 ‘n离子诱变相关育种效应研究 q安徽农业大学学报 ot||{ ouxkvl }u|y ∗ u||
胡蕙露 o杨枝发 o胡翠玲 q银杏茎段组织培养正交试验 q安徽农业大学学报 ot||z ouwkul }tu| ∗ tvvk联合国粮农组织 „Š•Œ≥收录2u{{xzl
姜 玲 o章文才 q银杏悬浮细胞系的建立及其黄酮糖苷的产生 q果树科学 ot||| otykul }tvt ∗ tvw
李继侗文集编辑委员会 q李继侗文集 q北京 }科学出版社 ot|{y
罗紫娟 q银杏组织培养初步研究 q云南植物研究 ot|{w oyktl }|v ∗ |z
谭文澄 o戴策刚主编 q观赏植物组织培养技术 q北京 }中国林业出版社 ot||t
王伏雄 o陈祖铿 q银杏幼胚离体培养的研究 ´ ) ) ) 蜂皇浆对胚生长的影响 q植物学报 ot|yv ottkvl }utz ∗ uuu
王伏雄 o陈祖铿 o李觉章 q银杏幼胚离体培养的研究 µ ) ) ) 椰子乳汁对幼胚生长的影响 q植物学报 ot|yx otvkvl }uuw ∗ uv|
吴元立 o严学成 q银杏成熟胚乳培养的细胞组织学观察 q果树科学 ot||{ otxkwl }vuz ∗ vvt
吴元立 o严学成 q银杏成熟胚培养的细胞组织学观察 q林业科学 ot||{ ovwkwl }{ ∗ tv
≤¤µµ¬¨µ⁄o≤²¶¨±·¬±² Š o‘¨∏©¨ §¯ • ετ αλq‘∏·µ¬·¬²±¤¯ ¤±§«²µ°²±¤¯ µ¨ ∏´¬µ¨° ±¨·¶²© Γινκγο βιλοβα °¨¥µ¼²2§¨µ¬√ §¨¦¤¯ ∏¯¶¤±§¶∏¶³¨ ±¶¬²± ¦¨¯¯ ¦∏¯·∏µ¨ q°¯ ¤±·
≤¨¯¯ • ³¨²µ·¶ot||s o{ }yvx ∗ yv{
Š∏³·¤° Ž¤±§⁄∏µ½¤± ⁄qŒ± √¬·µ² ¶¨·¤¥¯¬¶«° ±¨·¤±§°∏¯·¬³¯¬¦¤·¬²±²©­∏√¨ ±¬¯¨ ¤±§°¤·∏µ¨ ⁄²∏ª¯¤¶2©¬µ¤±§≥∏ª¤µ³¬±¨ q„¦·¤ ‹²µ·¬¦∏¯·∏µ¨ ot|{z outu }w{v ∗
w{z
yx 林 业 科 学 v{卷