全 文 ：第 wu卷 第 tu期
u s s y年 tu 月
林 业 科 学
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玻璃化法超低温保存石楠茎尖的初步研究 3
王 越 刘 燕
k北京林业大学园林学院 北京 tsss{vl
关键词 } 石楠 ~茎尖 ~玻璃化 ~超低温
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1t 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussyltu p stvw p sv
收稿日期 }ussx p ts p u{ ∀
基金项目 }北京林业大学研究生自选课题基金资助项目ksw­­stzl ∀
3 刘燕为通讯作者 ∀
Χρψοπρεσερϖατιον οφ Πηοτινια σερρυλατα Σηοοτ2Τιπσ βψ ςιτριφιχατιον
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k Χολλεγε οφ Λανδσχαπε Αρχηιτεχτυρε o Βειϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγ tsss{vl
Αβστραχτ} „ ³µ²¦¨§∏µ¨ º¤¶¶·∏§¬¨§²± ¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²± ²© Πηοτινια σερρυλατα ¶«²²·2·¬³¶ ιν ϖιτρο ¥¼ √¬·µ¬©¬¦¤·¬²±q׫¨ ¬¨¦¬¶¨§
¶«²²·2·¬³¶º«¬¦« º¨ µ¨ ¦∏¯·∏µ¨§©²µvs §ot1x ∗ u1s °° ²¯±ªo º¨ µ¨ ²¯¤§¨§º¬·«ys h °∂≥u ©²µws °¬± ¤·µ²²° ·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ¬±
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Κεψ ωορδσ} Πηοτινια σερρυλατα~¶«²²·2·¬³¶~√¬·µ¬©¬¦¤·¬²±~¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±
石楠k Πηοτινια σερρυλαταl属于蔷薇科k•²¶¤¦¨¤¨ l石楠属常绿阔叶灌木至小乔木 ∀同属植物我国产 ws余
种 o其花果叶均可观赏 o属园林中观赏季节特长的一类花木 ∀石楠原产我国中部及南部 o抗寒性较强 o在暖温
带地区有一定的应用前景 o已有少数成苗在北京引种 o能够正常开花结实k郑淮兵等 oussxl ∀目前石楠的适
用地区在不断扩展 o并陆续有大量新品种出现 o对其资源保存的研究具一定意义 ∀石楠及同属一些栽培品种
的组培技术成熟 k段祖安等 ousss ~李慧 ousswl o并且同科植物如杏k Αρµενιαχα δυλχισlk≤«²¦®³¬¶¬·ετ αλqo
usssl !樱桃k Χερασυσlk‘¬¬±² ετ αλqot||zl等的茎尖 o枇杷k Εριοβοτρψα ϕαπονιχαlk王家福等 ousswl !杏k Αρµενιαχα
ϖυλγαρισlk王彩虹等 ot||yl等的花粉超低温保存及枇杷试管苗常温k王家福等 oussul !低温保存k刘丹学等 o
usswl均已见报道 o但未见对石楠种质资源超低温保存方面研究的报道 ∀
常规的离体保存需要经常继代 o耗费大量人力 !物力 o而且易污染和变异 ∀玻璃化法超低温保存具有设
备要求简单 !材料处理步骤简便 !效果和重演性好等优点k王君晖等 ot||w ~ ≠¤®¤¬ετ αλqot||{l o是目前较为
理想的植物种质资源长期稳定的保存方法 o尤其适合组培物和茎尖培养物的保存 o已经成功应用于几十种植
物的茎尖保存 ∀本试验采用玻璃化法进行石楠茎尖的超低温保存 o以期建立石楠茎尖的超低温保存体系 o为
长期稳定保存石楠种质资源打下一定基础 ∀
1 材料与方法
t1t 材料 以石楠的带芽茎段为外植体 o参照段祖安等kusssl建立茎尖无菌培养体系 ∀以继代 w代培养
vs §左右的茎尖为试验材料 ∀
t1u 方法 tl装载与脱水 切取继代培养 vs §左右长度为 s1x ot1s ot1x ou1s ov1s °°的石楠茎尖 o装入
©¨©¨ ±§²©©管 o在室温条件下用 ys h的 °∂≥u 溶液≈s1w °²¯#pt的蔗糖液体培养基与 °∂≥u 溶液kvs h甘油 otx h
乙二醇 otx h ⁄≥’ os1w °²¯#pt蔗糖l体积比为 uΒv 处理 ts ∗ ys °¬±o然后在 s ε 条件下 °∂≥u 溶液处理 us ∗
ys °¬±∀ul冻存 在 ©¨©¨ ±§²©©管中换入新鲜的 s ε °∂≥u 溶液 o迅速投入液氮 ots个茎尖为一个处理 o重复 v
次 ∀vl化冻与再生植株培养 液氮中保存 uw «后取出冻存管 o迅速投入 ws ε 水浴化冻 o解冻后立即用含有
t1u °²¯#pt蔗糖的 ≥液体培养基洗涤 u次 o每次 ts °¬±∀用 ××≤法检测茎尖存活率 ∀或吸去材料表面液体
将茎尖转入 ≥ n y2…„ u1s °ª#°pt n蔗糖 v h的固体培养基暗培养 ot周后转入正常光照培养 o统计再生率 ∀
2 结果与分析
u1t 茎尖长度对冻后存活率的影响 切取长度分别为 s1x !t1s !t1x !u1s !v1s °°的石楠茎尖 o室温下用
ys h °∂≥u 溶液处理 ws °¬±os ε 条件下用 °∂≥u 溶液处理 xs °¬±∀经液氮冻存后 o对茎尖进行 ××≤活性检测 ∀
结果表明茎尖长度在 t1x !u1s °°存活率最高 o为 zs h ∗ zv1vv h ~s1x °° 茎尖冻后存活率很低 o只有
y1yz h o可能是由于体积过小 o切割对材料伤害较大 o并且玻璃化溶液对材料的毒害也较大 o导致茎尖死亡 ~
v1s °°茎尖的存活率较低 o可能是由于材料体积过大 o导致脱水处理不够充分 o迅速降温时材料局部降温速
率不一致 o影响玻璃化溶液保护作用的发挥 o对材料造成损伤 ∀
u1u 装载溶液处理时间对冻后存活率的影响 切取 u1s °°长的茎尖 o用 ys h °∂≥u 溶液室温下分别处理
ts !us !vs !ws !xs !ys °¬±o°∂≥u 溶液在 s ε 处理 xs °¬±∀经液氮冻存后 o对茎尖进行 ××≤活性检测 ∀由图 t可
见 o装载处理时间从 ts ∗ ys °¬±冻后茎尖都有一定的存活率 o为 v1vv h ∗ {y1yz h ∀随处理时间延长 o最初存
活率不断提高 o处理时间达到 ws °¬±时 o茎尖存活率最高 o为 {y1yz h ~随后处理时间的延长反而导致存活率
下降 o处理时间 ys °¬±时存活率为 zv1vv h o仍高于处理 vs °¬±时的茎尖存活率 ∀因此 o装载时间在 ws ∗ xs
°¬±较为适宜 ~装载溶液渗透茎尖使其逐步脱水需要一定时间 o但随着时间延长 o对茎尖也有一定毒害 ∀因
此需要根据材料的特性准确控制装载时间 o使装载溶液既发挥最大作用 o又使伤害降至最低 ∀
u1v °∂≥u 预处理时间对冻后存活率的影响 切取 u1s °°长的茎尖 o室温下用 ys h °∂≥u 溶液处理 ws °¬±o
°∂≥u溶液 s ε 下分别处理 us !vs !ws !xs !ys °¬±∀经液氮冻存后 o对茎尖进行 ××≤ 活性检测 ∀由图 u可见 o
°∂≥u 预处理 us ∗ ys °¬±冻后茎尖都可以存活 o存活率为 ty1yz h ∗ |v1vv h ∀随处理时间延长 o最初存活率
不断提高 o处理时间达到 xs °¬±时 o存活率最高 o为 |v1vv h ~随后处理时间延长反而导致存活率的下降 o处
理 ys °¬±时存活率为 {y1yz h o仍高于 ws °¬±的茎尖存活率 ∀因此 o°∂≥u 预处理时间在 xs ∗ ys °¬±较为适
宜 ∀°∂≥u 溶液使材料脱水需要一定时间 o随时间延长脱水越来越充分 o茎尖存活率不断提高 o但如果时间过
长 o即便是 s ε 条件下 °∂≥u 对茎尖的毒害作用也会逐渐显现出来 o影响存活率 o因此根据材料特性准确控制
°∂≥u 处理时间 o可最大限度地保护茎尖 o提高冻后存活率 ∀
图 t 装载溶液处理时间对冻后存活率的影响
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图 u °∂≥u 预处理时间对冻后存活率的影响
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u1w 茎尖植株的再生 冻后茎尖接种到含 y2…„ u1s °ª#pt的 ≥固体培养基上 o一周后可观察到萌动的现
象 oxs §左右可发育成完整小植株 o从外部形态上看与未经冻存的石楠茎尖发育形成的小植株之间没有明显
差异k图 vl ∀冻后茎尖的再生率为 wt1yz h o与 ××≤法检测的茎尖存活率有差异 ∀可能是由于 ××≤法是以表
征细胞呼吸活性的过氧化脱氢酶活力为检测标准 o虽然它是细胞内的重要指标 o但不能完全表征细胞与组织
的再生能力 o因此冻存后茎尖的活力不能仅以此衡量 ∀ ××≤ 法的优点在于能够迅速简便地反映冻存后茎尖
的状况 o在其他通过玻璃化法超低温保存植物茎尖的研究中 o××≤法检测的茎尖存活率也基本上与冻后茎尖
再生的趋势一致k刘云国等 oussu ~张玉芹等 oussw ~艾鹏飞等 oussv ~王子成等 ousstl ∀此外 o再生时的培养
基配方与培养条件的不适也会导致茎尖再生困难 o还需进一步研究与优化 ∀
xvt 第 tu期 王 越等 }玻璃化法超低温保存石楠茎尖的初步研究
v 结论与讨论
石楠茎尖玻璃化法超低温保存比较适宜的程序为 }切取 t1x ∗ u1s °°长的茎尖 o室温下用 ys h °∂≥u 溶
液处理 ws °¬±o再用 °∂≥u 溶液 s ε 处理 xs °¬±o更换新鲜的 °∂≥u 溶液后 o迅速投入液氮中 ∀需要时取出在 ws
ε 水浴化冻 o解冻后立即用含有 t1u °²¯#pt蔗糖的 ≥液体培养基洗涤 u次 o每次 ts °¬±o然后接种到再生
培养基 ≥ n y2…„ u1s °ª#°pt n蔗糖 v h上暗培养 o一周后转入正常光照培养 ∀
图 v 冻后石楠茎尖再生植株
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冻存后石楠茎尖的成活率和再生率分别为 |v1vv h 和
wt1yz h ∀××≤法检测结果与茎尖的再生结果还有较大差异 o可通
过进一步优化保存条件与步骤来提高成活率 ∀ ¤·¶∏°²·²等
kussvl优化试验步骤使冻后葡萄kςιτισl茎尖再生率由 ys h提高至
{s h ∀石楠茎尖经过本试验的步骤保存后 o存活下来的材料均为
经过茎尖直接成苗 o而不是经愈伤组织诱导后成苗 o变异几率小 o
能够真实稳定地保存石楠的遗传特性 ∀ ≤«²¦®³¬¶¬·等kusssl在保存
杏茎尖时发现 o只有一部分茎尖能够直接成苗 o大部分在生长一段
时间后完全愈伤化 o一部分愈伤组织可以转变为胚性愈伤组织 o通
过体细胞胚胎发生途径实现植株再生 o也有些愈伤组织最后死亡 ~
将保存后的茎尖先在无激素的培养基上培养 u周 o然后转移到有
激素的培养基上 o可克服这个问题 ∀
超低温保存过程中 o材料在液氮中保存的时间长短可能不是影响保存效果的因素 ∀保存 t §和保存 v
个月的石楠在保存效果上没有明显差别 ∀有文献显示 o保存 t §和保存 ts个月的樱桃在保存效果上也没有
明显区别k‘¬¬±² ετ αλ1 ot||zl o至于超低温保存过程给材料造成的损伤及其对保存效果 !材料遗传特性的影
响 o有必要从细胞的超微结构上对其进行探讨 ∀
参 考 文 献
艾鹏飞 o罗正荣 qussv q柿休眠芽茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生 q中国农业科学 ovykxl }xxv p xxy
段祖安 o齐建国 o张承庆 qusss q石楠的组培快繁研究 q山东林业科技 otu|kwl }t| p ut
李 慧 qussw q红叶石楠茎尖组织培养与快速繁殖 q植物资源与环境学报 otvkvl }yu p yv
刘月学 o刘小军 o王家福 o等 qussw q低温等因素对枇杷种质离体保存的影响 q植物资源与环境学报 otvktl }u{ p vt
刘云国 o王晓云 qussu q苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术 q山东农业大学学报 ovvktl }vu p vy
王彩虹 o李嘉瑞 qt||y q杏花粉的低温与超低温贮藏研究 q莱阳农学院学报 otvkul }ty| p tzv
王家福 o刘月学 o刘小军 o等 qussw q枇杷花粉干冻法超低温保存研究 q中国农学通报 ousktl }t p u
王家福 o刘月学 o林顺权 qussu q枇杷种质资源的离体保存研究 µ }生长抑制剂的影响 q亚热带植物科学 ovtkwl }t p w
王君晖 o黄纯农 qt||w q玻璃化法 ) ) ) 园艺作物茎尖和分生组织超低温保存的新途径 ) ) ) 文献综述 q园艺学报 outkvl }uzz p u{u
王子成 o邓秀新 qusst q玻璃化法超低温保存柑桔茎尖及植株再生 q园艺学报 ou{kwl }vst p vsy
张玉芹 o李锡香 o马 庆 o等 qussw q食用百合种质的玻璃化法超低温保存技术初探 q中国蔬菜 okwl }tt p tv
郑淮兵 o董 丽 o郑彩霞 qussx q低温和 °∞Š/渗控0预处理促进石楠种子萌发的研究 q林业科学 owtkvl }xw p xz
≤«²¦®³¬¶¬·≤ oŠµ¤±«¤° ≤ o× µ¨µ¼ …qusss q≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²± ²©¬± √¬·µ² ¤¯°²±§¶«²²··¬³¶¥¼ √¬·µ¬©¬¦¤·¬²±q²∏µ±¤¯ ²© ‹²µ·¬¦∏¯·∏µ¨¤¯ ≥¦¬¨±¦¨ i …¬²·¨¦«±²¯²ª¼ozx
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¤·¶∏°²·²oײ¶«¬®¤½∏o≥¤®¤¬o ετ αλqussv q≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²± ²©¤¬¬¯¯¤µ¼¶«²²··¬³¶²©¬± √¬·µ²2ªµ²º±ªµ¤³¨ kςιτισl ¥¼ ¤·º²2¶·¨³√¬·µ¬©¬¦¤·¬²± ³µ²·²¦²¯ q∞∏³«¼·¬¦¤o
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k责任编辑 徐 红l
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