全 文 ：第 ws卷 第 t期
u s s w年 t 月
林 业 科 学
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¤±qou s s w
栗疫菌弱毒力特征的传递及其影响因素
王克荣 周而勋 姜爱萍 成桂英
k南京农业大学植物病理学系 南京 utss|xl
关键词 } 栗疫病菌 o真菌病毒 o弱毒力转化 o营养体亲和群
中图分类号 }≥zyv1tx 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusswlst p st{x p sw
收稿日期 }ussu p sx p tv ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目资助kvsszsw|wl ∀
Τρανσµισσιον οφ δσΡΝΑιν Χρψπηονεχτρια παρασιτιχα
ανδ ιτ. σ Αφφεχτινγ Φαχτορσ
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k ∆επαρτµεντ οφ Πλαντ ΠατηολογψoΝανϕινγ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγutss|xl
Αβστραχτ} §¶• ‘„ ¬± Χρψπηονεχτρια παρασιτιχα ¦²∏¯§¥¨ ·µ¤±¶°¬·¨§·² ³µ²ª¨±¼·«µ²∏ª«¦²±¬§¬¤ º¬·«√¤µ¼¬±ª ©¨©¬¦¬¨±¦¼¬± ¦∏¯2
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µ¨¶¬²± µ¨§∏¦¨§¤¶·«¨ ±∏°¥¨µ²©§¬©©¨µ¨±·∂≤ ª¨ ±¨ ¶¥¨·º¨ ±¨ §²±²µ¤±§µ¨¦¬³¬¨±·¬¶²¯¤·¨¶¬±¦µ¨¤¶¨§q
Κεψ ωορδσ} Χρψπηονεχτρια παρασιτιχαo ¼¦²√¬µ∏¶o‹¼³²√¬µ∏¯ ±¨¦¨ ¦²±√¨ µ¶¬²±o∂ ª¨¨·¤·¬√¨ ¦²°³¤·¬¥¬¯¬·¼ ªµ²∏³k∂≤Šl
栗疫菌k Χρψπηονεχτρια παρασιτιχαl弱毒力k«¼³²√¬µ∏¯ ±¨¦¨l的本质是菌体中含有一种弱毒性病毒k¦µ¼³«²±¨ ¦·µ¬¤
«¼³²√¬µ∏¯ ±¨¦¨ √¬µ∏¶¨¶o≤‹∂l§¶• ‘„k≤«²¬ετ αλot||u ~²µµ¬¶ ετ αλot|z|l ∀栗疫菌的弱毒力菌株k‹ 菌株l一般都
具有将强毒力k√¬µ∏¯ ±¨·l菌株k∂ 菌株l转化为弱毒力菌株的能力 o因而具有用来防治栗疫病的潜力k∂¤± „¯ 2
©¨ ± ot|{ul ∀由于栗疫病菌弱毒力菌系在意大利的自然传播和在法国的人工辅助扩散 o栗疫病早已不再被认
为是该地区的重要林木病害kŠµ¨±·¨ ετ αλot|y| ~¤¦⁄²±¤¯§ ετ αλot||tl ∀真菌病毒或 ≤‹∂ 病毒 §¶• ‘„不能离
开寄主的细胞质而存活和进行侵染 o因此 o栗疫菌菌体中 §¶• ‘„的传递效率以及影响传播的内外因素就成
为弱毒力能否应用到田间进行生物防治的制约因素 ∀
我国是栗疫菌的原发地k≤¯ ¤³³¨µot|xul ∀近年来 o国内对栗疫病菌及其弱毒力现象进行了一些研究k王
克荣等 ot||t ~t||v ~周而勋等 ot||xl o但对于栗疫病菌中 §¶• ‘„的传递规律及其影响因素还不清楚 o国际上
对于栗疫菌中具体的营养体亲和性基因对菌株间 §¶• ‘„传递的影响也不清楚 ∀本研究试图了解通过分生
孢子 !继代培养和菌丝融合等方式 o菌株间传递 §¶• ‘„的效率及其影响因素 o为我国利用由弱毒性病毒侵染
产生的弱毒力菌株防治栗疫病奠定基础 ∀
1 材料与方法
t1t 供试菌株 供试菌株为 t|{z ) t||t年间采自江苏 !安徽 !江西 !辽宁等省林区 o栗树种类除了辽宁省为
日本栗k Χαστανεα χρεναταl外 o其他均为板栗k Χqµολλισσιµαl ∀选择供试的弱毒力菌株主要考虑培养性状和
§¶• ‘„电泳条带的数量 o毒力菌株的选择主要考虑营养体亲和群k∂ ≤Šl间的基因差异 o以便比较不同类型的
弱毒力菌株对不同 ∂ ≤Š菌株的转化率 ∀详细情况见表 tk表中部分菌株的毒力和营养体亲和群测定结果见
文献k王克荣等 ot||t ~t||vl ∀
t1u 分生孢子后代培养性状的观察 将菌株移植至 °⁄„ 平板上k每皿培养基的量依培养时间而定 }培养
tx !vs §的 tx °#皿 p t o培养 wx和 ys §的 ux °#皿 p t o培养 zx和 |s §的 vx °#皿 p tl o置下列条件下培养 }≠
ux ε n ty «#§pt光照 ~ ux ε n黑暗 ∀分别培养 tx !vs !wx !ys !zx和 |s §后 o每皿加入 ts °灭菌水 o配成孢
子悬浮液 o稀释为每毫升含 uss ∗ vss个孢子后 o将其涂布在 °⁄„平板上 oux ε 黑暗条件下培养 x §o观察并记
载各单孢菌落的形态 !颜色和生长速率 o确定培养性状是否发生分化 o计算分化比率 ∀每菌株至少涂布 y个
°⁄„平板 ∀
表 1 栗疫病菌供试菌株的生物学特征
Ταβ . 1 Ισολατεσ οφ Χρψπηονεχτρια παρασιτιχα στυδιεδ
菌株编号
Œ¶²¯¤·¨ ‘²q
⁄¶• ‘„片段
⁄¶• ‘„ ©µ¤ª°¨ ±·¶
菌落色素
≤²¯²±¼ ³¬ª° ±¨·
弱毒力Π毒力
‹Π∂
营养体亲和群
∂ ≤Š
suz t 白色 • «¬·¨ ‹ uu
sx| t 白色 • «¬·¨ ‹ w{
szz t 白色 • «¬·¨ ‹ ts
s{v ) 桔色 ’µ¤±ª¨ ∂ yz
s{t ) 桔色 ’µ¤±ª¨ ∂ {
s{y ) 桔色 ’µ¤±ª¨ ∂ y|
s{z ) 桔色 ’µ¤±ª¨ ∂ y|
tsu t 白色 • «¬·¨ ‹ ty
txt ) 桔色 ’µ¤±ª¨ ∂ zz
txu ) 桔色 ’µ¤±ª¨ ∂ zz
t{| ) 桔色 ’µ¤±ª¨ ∂ ttx
t|s ) 桔色 ’µ¤±ª¨ ∂ tty
uxs w 白色 • «¬·¨ ‹ tvu
uzz t 白色 • «¬·¨ ‹ tvv
u{s x 白色 • «¬·¨ ‹ tvy
vxw u 白色 • «¬·¨ ‹ tvw
vyz t 白色 • «¬·¨ ‹ tvx
t1v 继代培养 培养条件同 t1u ∀每 z §转管培养一次k代l o连续转管 vs次k代l ∀观察各代菌株的培养性
状是否发生改变 o并对第 ts代 !us代和 vs代的菌株进行 §¶• ‘„检测k²µµ¬¶ ετ αλot|z|l ∀
t1w 弱毒力转化 将培养的 ‹菌株和 ∂ 菌株的菌丝块移至 °⁄„平板中间配对培养kux ε !ty «#§pt光照l o
菌丝块相距 s1x ¦°o每处理重复 us次 ∀z §后检查结果 o计算转化率 ∀
2 结果与分析
u1t 光照和培养时间对 ‹菌株分生孢子后代带毒率的影响 本实验选择生长速度和产孢量均相近的 suz !
szz和 tsu号菌株作为分生孢子后代带毒率测定的研究对象 o试验结果见图 t ∀从图 t可看出 o随着培养时
间的延长 o桔黄色单孢后代的比例呈上升趋势 o这种趋势在有光照条件下特别明显 o经检测 o这种桔黄色菌落
的菌株不含 §¶• ‘„ o毒力较强 o表明光照对 ‹菌株分生孢子传递 ≤‹∂ 病毒产生不利的影响 ∀
黑暗培养 ≤∏¯·∏µ¨ ¬± §¤µ® 光照培养 ≤∏¯·∏µ¨ ∏±§¨µ¯¬ª«·kty «#§ptl
图 t 光照和培养时间对 ‹菌株分生孢子后代菌落特征分化的影响
ƒ¬ªqt ∞©©¨¦·²© ¬¯ª«·¤±§¦∏¯·∏µ¤¯ ·¬°¨ ²±·«¨ ¶¨ªµ¨ª¤·¬²±µ¤·¬²©²µ¦²±¬§¬¤¯ ³µ²ª¨ ±¼ ²© ‹ ¬¶²¯¤·¨¶
菌株编号 Œ¶²¯¤·¨ ‘²q σ uz o υ x| o ω zz o Ε tsu
u1u 继代培养对 §¶• ‘„ 传递的影响 试验对 uxs和 vxw号菌株进行了研究 o选择的两菌株均含有多条
y{t 林 业 科 学 ws卷
§¶• ‘„组分 o有利于对各组分的 §¶• ‘„在传递中的监测 ∀结果表明 o无论是在光照条件下 o还是在黑暗条件
下转管培养 o移植 vs代后 o菌株的培养性状均未发生改变 ~经 §¶• ‘„检测 o两个菌株的 §¶• ‘„片段数也都没
有减少 o各片段的分子量与继代培养前的相同 o说明 §¶• ‘„可通过菌丝体的继代培养稳定传递 ∀
u1v 营养体亲和性对通过菌丝融合传递 §¶• ‘„的影响
天然 ‹菌株转化 ∂ 菌株 x个 ‹菌株对 {个 ∂ 菌株进行弱毒力转化的结果k见表 ul表明 o‹菌株对 ∂
菌株的转化率从 s ∗ tss h不等 o说明 ‹菌株尽管与 ∂ 菌株的 ∂ ≤Š不同 o但大多可获得一定的转化率 ∀表 u
还显示 o‹菌株对同一 ∂ ≤Š的 ∂ 菌株的转化率基本相同 o如 szz号菌株对 s{x !s{y和 s{z号菌株的转化率均
在 zx h ∗ {s h之间 ∀
表 2 栗疫菌 Η菌株对 ς 菌株的转化
Ταβ . 2 Ηψποϖιρυλενχε χονϖερσιον οφ Η ισολατεστο ς ισολατεσιν Χ . παρασιτιχα
§¶• ‘„供体
§¶• ‘„ §²±²µ
受体
• ¦¨¬³¬¨±·
转化率
≤²±√¨ µ¶¬²±µ¤·¨Πh
§¶• ‘„供体
§¶• ‘„ §²±²µ
受体
• ¦¨¬³¬¨±·
转化率
≤²±√ µ¨¶¬²±µ¤·¨Πh
szz s{v us uzz txt s
szz s{t {x uzz txu s
szz s{y {s uzz t{| s
szz s{z zx uzz t|s s
szz txt x vxw s{v tss
szz txu s vxw s{t tss
szz t{| s vxw s{y tss
szz t|s x vxw s{z tss
uxs s{v vs vxw txt tss
uxs s{t ys vxw txu tss
uxs s{y yx vxw t{| tss
uxs s{z ys vxw t|s tss
uxs txt tx vyz s{v ts
uxs txu s vyz s{t zs
uxs t{| x vyz s{y {s
uxs t|s s vyz s{z {s
uzz s{v s vyz txt s
uzz s{t s vyz txu s
uzz s{y s vyz t{| s
uzz s{z s vyz t|s s
‹菌株对不同 ∂ ≤Š的 ∂ 菌株的转化能力和转化率很不相同 o如 ‹ 菌株 szz !uxs和 vyz号能全部转化
s{t !s{y和 s{z号 v个菌株 o且转化率都较高k可达 tss h l o但对 txt !txu !t{|和 t|s号菌株的转化率很低 o都
不能完全转化这 w个菌株 ∀ ‹菌株 vxw号的转化能力最强 o能转化供试的 {个 ∂ 菌株 o转化率均为 tss h ∀
∂ ≤基因的差异对菌株间传递 §¶• ‘„效率的影响 将不同类型的弱毒性 §¶• ‘„病毒ku{s ovxw和 szzl分
别转入 s{y和 t{|菌株中 o再将后者分别与相差不同 ∂ ≤ 基因数量的野生型毒力菌株进行配对培养 o两周后
检测弱毒性特征的转化率 o结果见表 v ∀
表 3 带有不同 ς Χ等位基因的菌株间 δσΡ ΝΑ的传递率
Ταβ . 3 Τηε τρανσµισσιον ρατε οφ τηε δσΡ ΝΑ βετωεεν ισολατεσ ωιτη διφφερεντ ς Χ αλλελε
∂ ≤基因差异
⁄¬©©¨µ¨±¦¨ ²© ∂ ≤ ª¨ ±¨
病毒类型 ∂¬µ∏¶·¼³¨
u{s vxw szz uxs
加权平均
• ¬¨ª«·¨§ °¨ ¤±
单基因差异 ’±¨ ¤¯¯¨ ¯¨ §¬©©¨µ±¨ · |s1y x{1y wy1z zu1w zs1{
双基因差异 ⁄¬©©¨µ¨±·¤··º² ∂ ≤ ª¨ ±¨ ²¯¦¬ zx1s ws1u vs1w ys1y w{1v
三基因差异 ⁄¬©©¨µ¨±·¤··«µ¨¨ ∂ ≤ ª¨ ±¨ ²¯¦¬ ws1s uu1y tw1u u{1{ uy1{
四基因差异 ⁄¬©©¨µ¨±·¤·©²∏µ∂ ≤ ª¨ ±¨ ²¯¦¬ uy1w ty1w tv1{ {1x ty1u
z{t 第 t期 王克荣等 }栗疫菌弱毒力特征的传递及其影响因素
在不同营养体亲和群k∂ ≤Šl的菌株间 o各种类型的 §¶• ‘„仍可获得一定的转化率 o本研究只进行四个
∂ ≤基因差异以内的菌株间的转化试验 o同一 ∂ ≤Š的菌株间的 §¶• ‘„转化率一般为 tss h o在两个 ∂ ≤ 基因
差异的水平上 o平均转化率可达 w{1v h ∀从表 v可以看出 o病毒在单个 ∂ ≤基因差异的菌株间的平均转化率
明显高于两个 ∂ ≤基因差异的菌株间的转化率 o而在四个 ∂ ≤ 基因差异的菌株间 o弱毒性特征的转化率平均
只有 ty1u h o因此 o∂ ≤基因对菌株间菌丝有效融合的影响似乎具有累加效应 ~同时还可看出 o§¶• ‘„片段的
数量似乎也影响菌株间的转化率 ∀
3 讨 论
光照和培养时间对 ‹菌株分生孢子后代的分化率均有影响 ∀延长培养时间和提供光照条件 o可提高桔
黄色菌落单孢后代的百分率 o其中又以光照作用更明显 ∀光暗交替培养 |s §后 o桔黄色菌落单孢后代的比
例上升达 ws h以上 o表明 §¶• ‘„可通过分生孢子传递给后代的效率不稳定 o会因受到外界环境条件的影响
而发生波动 ∀ ∂¤± „¯ ©¨ ±等kt|z{l曾报道 o新移植的弱毒力菌株产生的分生孢子中 o|| h会形成弱毒力菌株 o
而培养了 u ∗ |个月的弱毒力菌株的分生孢子中 o仅有不足 ws h能形成弱毒力菌株 o本研究的结果大致与此
相似 ∀光照和延长培养时间会降低弱毒力菌株的传递效率 o这从理论上说 o对利用 ‹菌株防治栗疫病的效
果很有影响 o但实际上的影响可能并不大 o因为只要 ‹ 菌株侵染进栗树树皮组织 o菌丝一般是在形成层扩
展 o不存在表生问题 o因而可避免光照的影响 ∀
对含 §¶• ‘„的两个菌株连续移植了 vs代 o均未发现培养性状发生改变 o表明这两个菌株的培养性状是
相当稳定的 ∀对这两个菌株经移植不同代数的后代进行 §¶• ‘„ 检测 o两个菌株均未发生病毒片段丢失现
象 ∀
在光照下培养和延长培养时间 o虽可提高其产生野生型分生孢子比率 o但在同样条件下进行菌丝块移植
培养 o都仍保持其弱毒力菌株的特征 ∀二者似乎矛盾 o出现此种现象的原因可能是 }光照影响菌丝中 §¶• ‘„
进入分生孢子这一过程 o但并不影响菌丝中 §¶• ‘„的增殖和扩散 ∀
菌株间的营养体不亲和性是弱毒力转化的主要障碍k见表 ul o但这种营养体不亲和性只在 ∂ ≤ 基因差异
较多的情况下才体现出来 o菌株间的 ∂ ≤基因差异在 w个以下时 o一般都有不同程度的转化率 ∀表 v的数据
表明 o病毒类型不同 o其在菌株间的转化率也有明显差异 ou{s病毒的转化率显著高于 vxw和 szz病毒 ∀
参 考 文 献
王克荣 o邵见阳 o陆家云 q苏皖地区栗疫病菌营养体亲和性研究 q南京农业大学学报 ot||t otwkwl }ww p w{
王克荣 o邵见阳 o陆家云 q栗疫病菌的致病力分化 q果树科学 ot||v otsktl }ux p u{
周而勋 o王克荣 o刘凤权等 q单克隆抗体检测栗疫病菌 §¶• ‘„的研究初报 q植物病理学报 ot||x ouxktl }|t p |u
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¤¦⁄²±¤¯§ • oƒ∏¯¥µ¬ª«·⁄ • q…¬²¯²ª¬¦¤¯ ¦²±·µ²¯ ²©¦«¨¶·±∏·¥¯¬ª«·}∏¶¨ ¤±§ ¬¯°¬·¤·¬²± ²©·µ¤±¶°¬¶¶¬¥¯¨«¼³²√¬µ∏¯ ±¨¦¨ q°¯ ¤±·⁄¬¶¨¤¶¨ ot||t ozx }yxy p yyt
²µµ¬¶× o⁄²§§¶„ qŒ¶²¯¤·¬²± ¤±§¤±¤¯¼¶¬¶²©§²∏¥¯ 2¨¶·µ¤±§¨§ • ‘„ ©µ²° √¬µ∏¶2¬±©¨¦·¨§³¯¤±·¤±§©∏±ª¤¯ ·¬¶¶∏¨ q°«¼·²³¤·«²¯²ª¼ ot|z| oy| }{xw p {x{
∂¤± „¯ ©¨ ± ‘Žq…¬²¯²ª¼ ¤±§³²·¨±·¬¤¯ ©²µ§¬¶¨¤¶¨ ¦²±·µ²¯ ²©«¼³²√¬µ∏¯ ±¨¦¨ ²© Ενδοτηια παρασιτιχα q„±± • √¨ °«¼·²³¤·«²¯ ot|{u ous }vw| p vyu
∂¤± „¯ ©¨ ± ‘Žo¤¼±¨ ¶• „ o…²º°¤± × q≥·¤¥¬¯¬·¼ ²© Ενδοτηια παρασιτιχα «¼³²√¬µ∏¯ ±¨¦¨ ¬± ¦∏¯·∏µ¨ q°«¼·²³¤·«²¯²ª¼ ot|z{ oy{ }tszx p tsz|
Šµ¨±·¨ o≥¤∏µ¨·≥ q. «¼³²√¬µ∏¯ ±¨¦¨ ¬¨¦¯∏¶¬√¨ o¨¶·2¨¯¯¨ ¦²±·µ²¯i¨ ³¤µ§¨¶§i·¨µ°¬±¤±·¶¦¼·²³¯¤¶°¬´∏¨¶‚ ≤²°³·¨¶µ¨±§∏¶«¨ ¥§²°¤§¤¬µ¨¶§¨¶¶i¤±¦¨¶§¨ Œ. „¦¤§i°¬¨
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