全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
香菇病毒 HKB（Lentinula edodes mycovirus HKB，
LeV），存在于多数感染病毒的香菇中。最近有报道
检测到一条与其基因组相关的 dsRNA，分子大小为
11 282 bp，编码两个阅读框 ORF1 和 ORF2，ORF1
编码一个假定蛋白，ORF2 推测编码 RNA 依赖的
RNA 聚合酶［1］。LeV 是一种真菌病毒，具有潜隐性
的特点，在生产过程中人们不易辩认和排除［2］。通
常感染病毒的香菇可以完成自身正常的生命周期，
病毒在很长的时期内不会产生明显的症状，但也会
偶尔出现异常症状。如基质表面白色绒毛菌丝生长
不足或转色不完全［3］，子实体畸型等，这些症状往
往导致严重的经济损失。因此，为满足香菇菌株质
收稿日期 ： 2013-09-23
基金项目 ：福建省科技厅自然科学基金项目（2013J01080）
作者简介 ：郭杰，男，助理农艺师，硕士，研究方向 ：食用菌病害 ；E-mail ：gjfywx_2008@163.com
通讯作者 ：吴小平，男，教授，博士，研究方向 ：食用菌教学与科研 ；E-mail ：fjwxp@126.com
香菇 dsRNA 病毒 LeV 的 RT-PCR 检测
郭杰1，2  吴小平1
（1. 福建农林大学生命科学学院，福州 350002 ；2. 三门峡农业科学研究院，三门峡 472000）
摘 要： 香菇病毒 HKB（Lentinula edodes mycovirus HKB，LeV）是一种具有潜隐性特点的真菌病毒，广泛存在于香菇菌株中。
为了快速、准确地检测出 LeV，根据 LeV 病毒基因组序列（AB.429556.2）的信息，设计合成一对引物，对 25 个香菇菌株进行 RT-
PCR 检测，在 20 个香菇菌株中分别扩增出 LeV 病毒基因组特有的条带，在 5 个香菇菌株中未能扩增出条带。通过对 25 个香菇菌
株进行 dsRNA 提取检测，结果也表明不存在扩增片段的菌株提取不到 dsRNA，存在扩增片段的菌株能够提取得到 dsRNA。因此建
立的 RT-PCR 方法可以快速检测到香菇 dsRNA 病毒 LeV，能够对香菇的质量检测提供技术支持。
关键词 ： dsRNA 真菌病毒 RT-PCR 香菇
RT-PCR Detection of dsRNA Virus LeV in Lentinula edodes
Guo Jie1，2 Wu Xiaoping1
（1. College of Life Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002 ；2. Institute of SanMenxia Agriculture Science，
Sanmenxia 472000）
Abstract:  Lentinula edodes mycovirus HKB（LeV）is a fungal virus with the potential symptoms and exists widely in Lentinula edodes
strains. In order to detect LeV from abundant strains rapidly and accurately, a pair of primers were designed according to the sequence of LeV
（AB.429556.2）and amplified by RT-PCR method. In a total of 25 strains, 20 strains were positive for LeV and 5 strains were negative. The
result of dsRNA extraction also showed dsRNA were obtained in the positive strains and the negative strains were not. In conclusion, the study
proved that RT-PCR is a rapid and sensitive method for detection of LeV in Lentinula edodes strains and can attribute to the control of strains
quality.
Key words:  dsRNA Mycovirus RT-PCR Lentinula edodes
量检测和无毒化生产的需要，本试验根据 LeV 基因
序列，拟建立快速、简单的 RT-PCR 方法用于香菇
病毒 LeV 感染的检测诊断。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 香菇菌株 236，Cr33，庆科 20，
春 菇 一 号， 香 安，9319，L0200，L0205，L0213，
L0228，L0232，L0284，L0312，L0318，L0327，
L0328，L0334，L0364，L0368，L0391，L0610，
L0612，L0617，L0620， 感 染 LeV 的 菌 株 L0183［4］
均为福建农林大学菌物研究中心保存。
1.1.2 培养基 PDA 培养基 ：马铃薯 200 g，葡萄糖
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期148
20 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL。
PDB 培养基 马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，H2O
1 000 mL。
1.1.3 主要试剂 RT 试剂，DNase Ⅰ和 S1 Nuclease
购 自 Fermentas 公 司 ；PCR 试 剂，pMD18-T，E.coli
DH5α 购自 TaKaRa 公司 ；Trizol 试剂盒购自 Invitro-
gen 公司 ；其它试剂均为国产。根据 LeV 的 ORF2
序列信息（GenBank ：AB.429556.2）设计 1 对引物 ：
LeVY-02-S ：5-ACAGTAGCGGTATCTCA-3，LeVY-
02-A ：5-GCCAGGCAGTTTAGT-3。
1.2 方法
1.2.1 菌丝体的制备 供试香菇菌种转接于试管中
活化（含 PDA 培养基），满管后转接于 500 mL 三角
瓶中（含 200 mL PDB 培养基），25℃下静置培养 15
d，过滤收集菌丝体，用滤纸吸干，-20℃保存备用。
1.2.2 香 菇 dsRNA 和 RNA 的 提 取 供 试 菌 株
dsRNA 和 RNA 的提取方法分别参照 dsRNA 技术［4］
和 Trizol 试剂盒操作说明书。
1.2.3 香菇 dsRNA 病毒 RT-PCR 检测反应体系 RT
反应体系，首先在 0.2 mL PCR 管中加入 RNA 模版
（100 ng），10 μmol/L 引物 LeVY-02-A 1 μL，二甲亚
砜 1 μL，补 DEPC 水至 10 μL，100℃保温 5 min，然
后迅速放置冰上 5 min。再添加 5×RT Buffer 4 μL、
10 mmol/L dNTPs 2 μL、40 U/μL Rnase inhibitor 0.5
μL、200 U/μL 反 转 录 酶 M-MuLV 0.5 μL、 用 DEPC
水补充至 20 μL，反应总体积为 20 μL，反应程序为
42℃反应 1 h，70℃灭活 10 min 立刻置于冰上，-20℃
保存。
RT 反应结束后取 1 μL RT 产物进行 PCR 反应，
添加 10×PCR Buffer 3 μL（含 15 mmol/L MgCl2），2.5
mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.3 μL、
10 μmol/L 引 物（LeVY-02-S，LeVY-02-A） 各 1 μL，
用 DEPC 水补充至 30 μL，反应总体积为 30 μL，反
应程序为 95℃预变性 5 min，95℃ 45 s，最佳退火
温 度 52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，25 个 循 环，72 ℃ 延 伸
10 min。
1.2.4 病 毒 核 酸 类 型 鉴 定 利 用 DNase Ⅰ 和 S1
Nuclease 鉴定该病毒基因组的核酸类型，分别参照
DNase Ⅰ和 S1 Nuclease 的操作说明书。
1.2.5 RT-PCR 产物的克隆和测序 琼脂糖凝胶电
泳检测 RT-PCR 产物后，随机选取 3 个菌株扩增的
目的片段经 PCR Fragment Recover Kit 回收纯化，与
pMD18-T Vector 连接后转化 E.coli.DH5α 菌株感受态
细胞，挑取阳性克隆子，菌落 PCR 验证后，送上海
生工生物工程公司进行测序，测序结果运用 NCBI
Blast 进行同源性搜索比较分析。
2 结果
2.1 RT-PCR检测
LeVY-02 引 物 RT-PCR 结 果（ 图 1） 表 明， 在
25 个 香 菇 菌 株 中，236、L0200、L0328、L0284、
L0620 菌株不存在特异性目的片段，其余菌株均
存在一条大小约 434 bp 的特异性目的片段。因此，
236、L0200、L0328、L0284、L0620 菌 株 中 不 含 有
香菇真菌病毒，其余 20 个菌株中可能含有香菇真菌
病毒 LeV。
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M L0200 ᒶ、20 L0617 俉ᆹ L0368
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bp
bp
bp
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Cr33 9319 L0610 L0328 L0284 L0312 L0620 L0364
236 L0183 L0232
M ᱕㧷аਧ L0205 L0213 L0228 L0318 L0612 L0391 L0327 L0334
M ：DL2000 Markers
图 1 RT-PCR 检测香菇真菌病毒 LeV 的琼脂糖凝胶电泳
图谱
2014年第1期 149郭杰等 ：香菇 dsRNA 病毒 LeV 的 RT-PCR 检测
2.2 序列分析
L0183、L0232、L0617 菌 株 RT-PCR 扩 增 的 目
的片段克隆测序后，结果（图 2）表明 3 个片段的
序列分别与 LeV（AB.429556.2）对应序列的相似性
为 98%（L0232）、99%（L0183）、99%（L0617）。
由此，可以认为存在扩增片段的 20 个菌株中含有香
80LeV.seq
80L0183.seq
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80L0232.seq
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434L0183.seq
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图 2 多序列比对结果
菇真菌病毒 LeV，但其 dsRNA 可能有差异。
2.3 病毒核酸类型
经过 DNase Ⅰ和 S1 Nuclease 鉴定该病毒基因组
的核酸类型为 dsRNA（图 3）。通过 dsRNA 的提取
结果也表明不存在扩增片段的菌株提取不到 dsRNA，
存在扩增片段的菌株能够提取得到 dsRNA。
M L0183 L0232 L0617
23130
bp
9416 11282
bp
dsRNA
M ：λDNA/Hind Ⅲ Markers
图 3 香菇真菌病毒 LeV 基因组琼脂糖凝胶电泳
3 讨论
通常 dsRNA 病毒可以通过电子显微镜进行病
毒颗粒的检测［5-8］，但是电镜检测需要的样品量大，
过程复杂且灵敏度相对较低，对于一些特殊的病毒，
电镜也无法进行检测。已有研究表明，LeV 是一种
线性真菌病毒，通过电子显微镜没有发现同 dsRNA
相关的病毒颗粒，通过原子力显微镜才获得了病毒
的分子成像［1］，但昂贵的设备，更高要求的检测
方法令一般的研究单位难以负担。dsRNA 病毒还
可以通过提取病毒基因组进行检测［9-11］，但传统的
dsRNA 提取技术检测香菇病毒，经常性地出现杂带
影响或提取不到 dsRNA［4］。RT-PCR 检测是一种常
规的检测技术，在动植物病毒检测方面已有多篇报
道［12-14］，在食用菌 dsRNA 病毒检测中也有相关报
道［15，16］，但在国内尚未见利用 RT-PCR 对香菇病毒
HKB（LeV）检测的报道。经过 LeV 的 RT-PCR 检
测试验证实，RT-PCR 方法较其他检测方法，不需要
特殊且贵重的仪器设备，也无需活性病毒，只要存
在未降解的核酸片段，且达到检测的最低病毒量就
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期150
能够检测，具有操作简单，快速、灵敏性高的特点，
可以避免提取病毒颗粒和基因组等检测方法操作繁
琐或效果不理想等问题。
香菇 LeV 病毒 RT-PCR 检测方法还需要继续完
善，如进行 RT-PCR 方法的优化试验，提高检测的
经济性 ；或开发具有荧光素标记或其他发光物质标
记的 RT-PCR，提高检测结果的可视性 ；或在香菇病
毒分子生物学的深入研究下，完成病毒基因组的全
序列分析，建立核酸分子杂交检测方法，免疫学血
清检测方法，酶联免疫吸附检测方法和蛋白质微列
阵检测方法等，开发出简便、灵敏的病毒检测试纸条，
无论是在研究上或应用上都具有广泛的现实意义。
4 结论
建立了一种可对香菇 LeV 病毒核酸进行扩增的
RT-PCR 方法，适用于香菇 LeV 病毒的诊断和快速
检测。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）