全 文 ：第 v{卷 第 t期
u s s u年 t 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1v{ o‘²1t
¤±qou s s u
利用 • „°⁄标记技术对桦树种间亲缘关系的分析
姜 静 杨传平 刘桂丰 刘玉喜 任旭琴
k东北林业大学 哈尔滨 txsswsl
关键词 } • „°⁄o桦树 o种间 o亲缘关系 o杂交育种
收稿日期 }usss2s|2ux ∀
ΑΝΑΛΨΣΙΣ ΟΦ ΓΕΝΕΤΙΧ ΡΕΛΑΤΙΟΝΣΗΙΠ ΟΦ ΒΕΤΥΛΑ ΑΜΟΝΓ
ΣΠΕΧΙΕΣ ΥΣΙΝΓ ΡΑΠ∆ ΜΑΡ ΚΕΡ
¬¤±ª¬±ª ≠¤±ª≤«∏¤±³¬±ª ¬∏Š∏¬©¨ ±ª ¬∏≠∏¬¬ • ±¨ ÷∏´¬±
k Νορτηεαστ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Ηαρβιν txsswsl
Αβστραχτ } • „°⁄·¨¦«±¬´∏¨ º¤¶∏¶¨§·²§¨·¨¦··«¨ ª¨ ±¨·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¤°²±ª¶¨√¨ ± Βετυλᶳ¨¦¬¨¶quvv ²¯¦¬¬±·²·¤¯ º¨ µ¨
¤°³¯¬©¬¨§¥¼ ∏¶¬±ªtw µ¤±§²° ³µ¬°¨ µ¶q׫¨ ³¨µ¦¨±·¤ª¨ ²©³²¯¼°²µ³«¬¦ ²¯¦¬√¤µ¬¨§©µ²° tu qsu h ·²vy q|t h o¬± º«¬¦« Βq
χοστατα «¤§·«¨ «¬ª«¨¶·√¤µ¬¤·¬²±¯¨ √¨ ¯q׫¨ §¨±§µ²ªµ¤° ²©ª¨ ±¨·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³ º¤¶¦²±¶·µ∏¦·¨§²±·«¨ ¥¤¶¬¶²©·«¨ ª¨ ±¨ ·¬¦
§¬¶·¤±¦¨¶¤°²±ª¶³¨¦¬¨¶q„¦¦²µ§¬±ª·²ª¨ ±¨·¬¦§¬¶·¤±¦¨ ¬± °²µ¨·«¤±t quu o¶¬¬¶³¨¦¬¨¶º¨ µ¨ ¦¯∏¶·¨µ¨§¬±·²·º²ªµ²∏³¶oº«¨µ¨
Βqφρυτιχοσαλ º¤¶²±¨ ªµ²∏³¤±§²·«¨µ¶o¬±¦¯∏§¬±ª ΒqδαϖυριχαoΒqπενδυλαoΒqπλατψπηψλλαoΒqσχηµιδτιι ¤±§ Βqχοσταταo
º¨ µ¨ ªµ²∏³¨§·²ª¨·«¨µqŒ·¬±§¬¦¤·¨§·«¤··«¨ µ¨¶∏¯·²©ª¨ ±¨·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³²¥·¤¬±¨ §¥¼ • „°⁄·¨¦«±¬´∏¨ º¤¶¦¯²¶¨ ¼¯ ¦²±¶¬¶·¨±·
º¬·«·«¤·¦¯¤¶¶¬©¬¨§¥¼ ·µ¤§¬·¬²±¤¯ °²µ³«²¯²ª¬¦¤¯ ¦¯¤¶¶¬©¬¦¤·¬²±q׫¨ ¤±¤¯¼¶¬¶²© ª¨ ±¨·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¤°²±ª Βετυλα ¶³¨¦¬¨¶
º²∏¯§√¤¯¬§¯¼ ª∏¬§¨ ·«¨ ³¤µ¨±·¤¯ ¶¨¯¨ ¦·¬²± ¤±§¬±·¨µ¶³¨¦¬¨¶¦µ²¶¶¬±ª©²µΒετυλᶳ¨¦¬¨¶q
Κεψ ωορδσ} • „°⁄o ΒετυλαoŒ±·¨µ¶³¨¦¬¨¶o Š¨ ±¨·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³o≤µ²¶¶2¥µ¨ §¨¬±ª
桦木属k Βετυλαl在我国约有 vs种 o主要分布于东北 !华北 !华中 !西南以及西北等广大地区 ∀其中能
被开发利用的乔木有 uv种 o这些树种的生长特性 !抗性及木材物理性质差异很大 o每一树种各有其优缺
点k中国植物志第十一卷 ot|z|l ∀如果开展杂交育种研究 o可以综合两个或多个树种的优良特性 ∀由于
种间杂交更容易发生在亲缘关系较近的种间 o为此 o对桦树种间亲缘关系的分析 o是进行种间杂交的前
提k王明庥 ot|{{l ∀本文应用 • „°⁄技术 o在 ⁄‘„水平上鉴定几种桦树的亲缘关系 o为开展种间杂交亲
本的选配 o充分挖掘基因资源提供科学依据 ∀
表 1 桦树样品来源
Ταβ .1 Τηεσουρχεσ οφσαµπλεσ οφ Βετυλα
树种
≥³¨¦¬¨¶
采集地
°µ²√ ±¨¤±¦¨¶
个体数
‘²q²©¬±§¬√¬§∏¤¯¶
枫桦 Β qχοστατα 帽儿山 ¤²¨µ¶«¤± {
赛黑桦 Β qσχηµιδτιι 新滨县 ÷¬±¥¬± ≤²∏±·¼ |
黑桦 Β qδαϖυριχα 哈尔滨植物园 ‹¤µ¥¬± „µ¥²µ¨·∏° y
柴桦 Β qφρυτιχοσαλ 哈尔滨植物园 ‹¤µ¥¬± „µ¥²µ¨·∏° x
白桦 Β qπλατψπηψλλα 帽儿山 ¤²¨µ¶«¤± |
欧洲白桦 Β qπενδυλα 芬兰 ƒ¬±¯¤±§ tt
1 材料与方法
t1t 试验材料 欧洲白桦k Β qπενδυλαl
k由芬兰林木育种基金会提供l !枫桦
k Β qχοσταταl !赛黑桦k Β qσχηµιδτιιl !白桦
k Β qπλατψπηψλλαl的种子 o于 t||{ ) sx 播
种于塑料大棚中 oy月中旬采集幼叶k p
zs ε 冰箱中保存备用 ∀黑桦k Β qδαϖυρι2
χαql !柴桦k Β qφρυτιχοσαλl试材于 t||{年
早春分别采自哈尔滨市植物园k表 tl ∀
t1u 总 ⁄‘„提取与浓度的测定 ≤ׄ…法提取总 ⁄‘„ o利用美国 °∞• ŽŒ‘∞∞• 公司生产的 ˜∂Π∂t≥
≥³¨¦·µ²°¨ ·¨µ¤°¥§¤ …¬²ts测定所提 ⁄‘„的含量和纯度 ∀
t1v 引物筛选 参阅国内外有关研究文献 o参照 ’³¨µ²±公司的引物序列 o在 פŽ¤•¤公司合成了 zx个
ts碱基长度的寡核苷酸引物 o分别扩增桦树 u个 ⁄‘„样品 o筛选出扩增性强 !重复性好 !多态性高的 tw
个引物k表 ul o用于全部桦树 ⁄‘„样品的扩增 ∀
表 2 14 个随机引物序列
Ταβ .2 Σεθυενχεσ οφ 14 αρβιτραρψ πριµερσ
引物名称
‘¤°¨ ²©³µ¬° µ¨¶
序列 xχ2vχ
≥¨ ∏´¨ ±¦¨¶xχ2vχ
引物名称
‘¤°¨²©³µ¬°¨ µ¶
序列 xχ2vχ
≥¨ ∏´¨ ±¦¨¶xχ2vχ
’°„ ) su ׊≤≤Š„Š≤׊ ’°± ) sx ≤≤Š≤Š×≤×׊
’°„ ) tw ×≤׊׊≤׊Š ’°± ) tt ×≤×≤≤Š≤„„≤
’°„ ) t| ≤„„„≤Š×≤ŠŠ ’°± ) sz ≤≤≤≤Š„׊Š×
’°„ ) s| ŠŠŠ×„„≤Š≤≤ ’°‘) sz ≤„Š≤≤≤„Š„Š
’°… ) sz ŠŠ×Š„≤Š≤„Š ’°Ž) su Š×≤×≤≤Š≤„„
’°… ) tz „ŠŠŠ„„≤Š„Š ’°Ž) tz ≤≤≤„Š≤׊׊
’°≤ ) tu ׊×≤„×≤≤≤≤ ’°≤ ) tw ׊≤Š×Š≤×׊
t1w °≤• 扩增及产物的鉴定 • „°⁄2
°≤• 扩增是在 °¨ µ®¬±2∞¯ °¨ µ|yss扩增仪
上进行 o每 us ˏ反应体积中含 ws ±ª
⁄‘„模板 ovs ±ª引物 os1u °°²¯Πw ≅
§‘×°k≥¤±ª²± 产品l ot ≅ 缓冲液 ot˜
פ´ ⁄‘„聚合酶k°µ²°¨ ª¤产品l ∀扩增程
序为 }|w ε 加热 v °¬±o使模板 ⁄‘„变性 o
然后进入下列温度循环 }|w ε 变性 t
°¬± !vz ε 退火 t °¬± !zu ε 延伸 u °¬±o共
计 ws个循环 ∀循环结束后在 zu ε 延伸
z °¬±o以保证 ⁄‘„延伸彻底 ∀
°≤• 扩增反应结束后 o采用 t ≅ ׄ∞电泳缓冲液 o在 t1x h的琼脂糖凝胶中k含 ∞…s1x Λª#°ptl电泳
分离扩增产物 o同时 o在适当的位置上加上一个已知分子量的 ⁄‘„ 标准样品ktss¥³ ⁄‘„ ¤§§¨µ购自
…Œ公司l o电泳结束后在 ˜∂°凝胶成像系统下观察照相 ∀
t1x 数据统计与分析 电泳图谱中的每一条带均代表了引物与模板 ⁄‘„互补的一对结合位点 o可记
为一个分子标记 o根据分子量标准对照反应产物在胶上的对应位置 o估计扩增产物的分子量大小 o有带
的记为 t o无带的记为 s o形成 sΠt矩阵图输入计算机 ∀
采用 • „°⁄¬¶·¤±¦¨ 软件包 o用 ∞¬¦²©©¬¨µετ αλqkt||ul遗传距离公式计算个体间的遗传距离 o用 ‘¨¬ª«2
¥²µ) ²¬±¬±ª方法构建个体间树状聚类图 ∀与 „’∂ „分析软件连用 o计算种间的遗传距离 o应用 ≥ׄ2
׌≥׌≤„分析软件 o构建了供试桦树的亲缘关系聚类图 ∀
2 结果与分析
u1t 多态位点比率 多态位点百分率可作为度量遗传变异水平高低的指标 o对 y种桦树 w{个个体进
行了 • „°⁄分析 ∀共检测到 uvv个位点 o位点范围在 uxs ∗ usss¥³之间k图 t !ul o多态位点百分率在
tu1su h ∗ vy1|t h之间 o多态位点比率由大到小依次为枫桦 !欧洲白桦 !白桦 !赛黑桦 !黑桦和柴桦k表
vl o结果表明 }枫桦的遗传变异水平最高 o柴桦的遗传变异水平较低 ∀
图 t 引物 ’°Ž2su扩增的电泳图谱
ƒ¬ªqt °µ²©¬¯¨ ³µ²§∏¦¨§¥¼·«¨ ³µ¬°¨ µ’°Ž2su
t ∗ |赛黑桦 t ∗ | Βqσχηµιδτιι ots ∗ tu柴桦 ts ∗ tu Βqφρυτιχοσαλo
tv分子量标准 tv ²¯ ¦¨∏¯¤µº¨ ¬ª«·°¤µ®¨µktss¥³⁄‘„ ¤¯§§¨µl q

图 u 引物 ’°±2sx扩增的电泳图谱
ƒ¬ªqu °µ²©¬¯¨ ³µ²§∏¦¨§¥¼ ³µ¬°¨ µ’°±2sx
t ∗ |白桦 t ∗ | Βqπλατψπηψλλαots ∗ tu黑桦 ts ∗ tu Βqδαϖυριχαo
tv分子量标准 tv ²¯ ¦¨∏¯¤µº¨ ¬ª«·°¤µ®¨µktss¥³⁄‘„ ¤¯§§¨µl q
u1u 遗传距离聚类分析 利用 „’∂ „软件分析了桦树的 • „°⁄扩增数据 o得到种间的遗传距离矩阵
k表 wl o将遗传距离矩阵输入 ≥ׄ׌≥׌≤„软件分析 o构建了供试桦树的亲缘关系聚类图k图 vl o结果显
xxt 第 t期 姜 静等 }利用 • „°⁄标记技术对桦树种间亲缘关系的分析
表 3 桦树多态位点百分率
Ταβ .3 Τηε περχενταγε οφ πολψµορπηιχ λοχι οφ Βετυλα
树种
≥³¨¦¬¨¶
个体数
‘²q²©¬±§¬√¬§∏¤¯¶
位点总数
ײ·¤¯ ²¯¦¬
多态位点数
‘²q²©³²¯¼°²µ³«¬¦ ²¯¦¬
多态位点比率
°°k h l
枫桦 Β qχοστατα { uvv {y vy1|t
赛黑桦 Β qσχηµιδτιι | uvv yz u{1zy
黑桦 Β qδαϖυριχα y uvv vs tu1{{
柴桦 Β qφρυτιχοσαλ x uvv u{ tu1su
白桦 Β qπλατψπηψλλα | uvv z{ vv1w{
欧洲白桦 Β qπενδυλα tt uvv {s vw1vv
示 }在 t1uu的遗传距离上 y种
桦树分为两大类群 o即柴桦单
独为 t类 o其它聚为 t类 ∀第
二类群中 o在 t1us的遗传距离
上又分为两个亚群 o即黑桦 !欧
洲白桦 !白桦聚为 t亚群 o赛黑
桦和枫桦聚为另 t亚群 ∀
3 讨论
v1t 桦树遗传变异的分析
桦树在我国的分布极广泛 o遍布十几个省区 ∀由于桦树分布区内气候和地理条件的多样性造成了种间
遗传变异的复杂性 ∀在所分析的几种桦树中枫桦是桦树中最耐阴者k周以良 ot||wl o其遗传变异水平最
高 o因而具有较大的选择潜力 o对这一基因资源需要充分挖掘 !合理利用 ∀
表 4 桦树间的遗传距离矩阵
Ταβ .4 Ματριξ οφ γενετιχ διστανχεσ βετωεεν Βετυλα σπεχιεσ
枫桦
Β qχοστατα
赛黑桦
Β qσχηµιδτιι
白桦
Β qπλατψπηψλλα
欧洲白桦
Β qπενδυλα
黑桦
Β qδαϖυριχα
柴桦
Β qφρυτιχοσαλ
枫桦 Β qχοστατα s1ssss s1ssss s1ssss s1ssss s1ssss s1ssss
赛黑桦 Β qσχηµιδτιι s1|yxx s1ssss s1ssss s1ssss s1ssss s1ssss
白桦 Β qπλατψπηψλλα s1xx|z t1tyws s1ssss s1ssss s1ssss s1ssss
欧洲白桦 Β qπενδυλα s1{zz{ t1uzs{ s1|xw| s1ssss s1ssss s1ssss
黑桦 Β qδαϖυριχα s1{vzw t1vsux s1||su t1uttx s1ssss s1ssss
柴桦 Β qφρυτιχοσαλ s1y|yv t1uu|| s1|s{w t1s|u{ t1vzvz s1ssss
图 v 桦树种间遗传距离聚类图
ƒ¬ªqv ⁄¨ ±§µ²ªµ¤° ¤°²±ª Βετυλᶳ¨¦¬¨¶¥¤¶¨§²±·«¨
ª¨ ±¨ ·¬¦§¬¶·¤±¦¨¶ª¨ ±¨ µ¤·¨§¥¼ ≥ׄ׌≥׌≤„
t柴桦 Β qφρυτιχοσα ou黑桦 Β qδαϖυριχα ov 欧洲白桦 Β qπενδυλα o
w白桦 Β qπλατψπηψλλαox赛黑桦 Β qσχηµιδτιι oy枫桦 Β qχοστατ q
v1u 几种桦树种间亲缘关系的比较 经典的分类方
法将桦木属分为西桦组k Σεχτ qΒετυλαστερl和桦木组
kΣεχτ qΒετυλαl o本实验分析的桦树均属于桦木组k郑
万钧 ot|{xl o应用 • „°⁄标记技术对几种桦树亲缘关
系的分析结果与传统的形态分类结果基本一致 o只是
枫桦和赛黑桦在经典分类中亲缘关系较远 o而利用
• „°⁄技术分析则亲缘关系很近 ∀
v1v 开展桦树种间杂交的建议 研究表明 o杂交更
容易发生在亲缘关系较近的种间 ∀本实验利用 • „°⁄
分子标记技术对几种桦树亲缘关系的分析结果是 o亲
缘关系较近的有 u组 o即黑桦 !欧洲白桦与白桦组 o赛
黑桦与枫桦组 ∀在杂交育种研究中建议首先选定这
u组进行杂交可配性试验 o进行桦树种间杂交尝试 o
同时应考虑亲本双方的优缺点能互补 o亲本的优良性
状要突出 o才有希望达到育种目标 ∀
参 考 文 献
王明庥主编 q林木育种学概论 1北京 }中国林业出版社 ot|{{
郑万钧 1中国树木志 q北京 }中国林业出版社 ot|{x
中国植物志第十一卷 q中国科学院中国植物志编辑委员会 q北京 }科学出版社 ot|z|
周以良 1中国小兴安岭植被 q北京 }科学出版社 ot||w
yxt 林 业 科 学 v{卷