全 文 ：第 v{卷 第 u期
u s s u年 v 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1v{ o‘²1u
¤µqou s s u
柞蚕抗菌肽 ⁄基因转化桉树培育抗青
枯病株系的研究
邵 志 芳
k深圳市莲花山公园管理处 深圳 xt{svyl
陈 伟 元
k深圳市梧桐山苗圃总场 深圳 xt{ttwl
罗 焕 亮 3
k深圳出入境检验检疫局 深圳 xt{swxl
叶 新 丰
k广东省肇庆林业局 肇庆 xuyswsl
张 景 宁
k华南农业大学 广州 xtsywul
摘 要 } 通过二次正交旋转组合设计对尾叶桉叶盘愈伤组织分化培养基优化 o获得尾叶桉k Ευχαλψπτυσ υρο2
πηψλιαl叶盘外植体的再生植株 ∀将携带外源目的基因的根癌农杆菌k Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσl与尾叶桉 ˜y无
性系叶盘共培养 o经愈伤组织诱导 !卡那霉素筛选和植株再生 o获得 us个小芽 o再将小芽转入附加卡那霉素
kŽ¤°lws Λª#°pt的 ∞vp …培养基中诱根 o获得 {株存活且可再生的转化子 ∀取转化苗叶片作胭脂碱合成酶活
性检测电泳后呈阳性 ~分别以 Χ2vu³2§≤×°及地高辛标记柞蚕抗菌肽 ⁄基因作探针 o与转化苗 ⁄‘„作点杂交及
≥²∏·«¨µ±印迹杂交检测 o结果均呈阳性 ∀以上结果表明 o柞蚕抗菌肽 ⁄基因已整合到尾叶桉基因组中 ∀将从
桉树青枯病重病区分离的强毒青枯菌k Πσευδοµονα󶳳ql株k||tstyl以 t ≅ ts|¦©∏#°pt浓度接种转化试管苗 o
以未经转基因的尾叶桉 ˜y 无性系试管苗为对照 o结果表明转化苗接种死亡率 xy1z h o对照死亡率为 {y1z h o
由此可推出导入柞蚕抗菌肽 ⁄基因的尾叶桉转化苗明显提高了对青枯菌的抗性 ∀
关键词 } 尾叶桉 o抗菌肽 ⁄o青枯病 o柞蚕
收稿日期 }usss2sv2sx ∀
基金项目 }广东省自然科学基金资助 o编号 }|xszzw
3 罗焕亮现为华南理工大学食品与生物工程学院在职博士生 ∀
ΣΤΥ∆ΙΕΣ ΟΝ ΤΗΕ ΙΝΤΡ Ο∆ΥΧΤΙΟΝ ΟΦ ΤΗΕ ΧΕΧΡ ΟΠΙΝ ∆ ΓΕΝΕ ΙΝΤΟ
ΕΥΧΑΛΨΠΤΥΣ ΥΡΟΠΗΨΛΛΑ ΤΟ ΒΡΕΕ∆ ΤΗΕ ΡΕΣΙΣΤΑΝΤ
ς ΑΡΙΕΤΙΕΣ ΤΟ ΠΣΕΥ∆ΟΜΟΝΑΣ ΣΟΛΑΝΑΧΕΑΡΥΜ
≥«¤² «¬©¤±ª
k Σηενζηεν Λιανηυασηαν Παρκ Σηενζηεν xt{svyl
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k Σηενζηεν Ωυτονγσηαν Νυρσεριεσ Σηενζηεν xt{ttwl
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k Σηενζηεν Ινσπεχτιον ανδ Θυαραντινε Βυρεαυ Σηενζηεν xt{swxl
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k Ζηαοθινγ Φορεστρψ Βυρεαυ Ζηαοθινγ xuyswsl
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k Σουτη Χηινα Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Γυανζηου xtsywul
Αβστραχτ } ׫¨ ¯¨ ¤©§¬¶¦²© Ευχαλψπτυσ υροπηψλλα º¤¶µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¨§¥¼ ∏¶¨ ²©·«¨ ∏´¤§µ¤·¬¦²µ·«²ª²±¤¯ µ²·¤·¬²± §¨¶¬ª±·²²³2
·¬°¬½¨ ·«¨ §¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± °¨ §¬∏°©²µ·«¨ ¦¤¯ ∏¯¶q׫¨ ¯¨ ¤©§¬¶¦¶²©·«¨ Ε qυροπηψλλα º¨ µ¨ ¦²2¦∏¯·¬√¤·¨§º¬·« Αγροβαχτεριυµ τυ2
µεφαχιεν󦤵µ¼¬±ª·«¨ ·¤µª¨·ª¨ ±¨ qus¶³µ²∏·¶º«¬¦«µ¨¶¬¶·¨§·²·«¨ Ž¤° º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ §¤©·¨µ¦¤¯ ∏¯¶¬±§∏¦¬±ª¤±§Ž¤°¶¨µ¨ ±¨2
¬±ªq{ ²∏·²©·«¨ °µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¨§©µ²°·«¨ µ²²·¬±ª°¨ §¬∏° ∞vp … ¶∏³³¯¬¨§º¬·«·«¨ ¶¤°¨ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±²©Ž¤°¦¤± ¥¨ ¦²±¶¬§¨µ¨§
¤¶·µ¤±¶ª¨±¬¦¶¨ §¨¯¬±ª¶q׫¨ ±²³¤¯¬±¨ ¶¼±·«¨·¬¦ ±¨½¼°¨ ¤¦·¬√¬·¼ ²©·«¨ ³µ¨ ¬¯°¬±¤µ¼·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± º¤¶§¨·¨¦·¨§¥¼ ¨¯ ¦¨·µ²2
³«²µ¨¶¬¶q˜¶¬±ª·«¨ ¤±·¬2¥¤¦·¨µ¬¤¯ ³¨ ³·¬§¨ ª¨ ±¨ ¤¯¥¨¯¯ §¨º¬·«Χ2vu³2§≤×° ²µ⁄ŒŠ ¤¶³µ²¥¨¶o·«¨ ¬±·µ²§∏¦¨§ª¨ ±¨ º¤¶§¨·¨¦·¨§
¬±·«¨ ³µ¨ ¬¯°¬±¤µ¼·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±¶·«µ²∏ª«§²·¥¯²·¬±ª¤±§≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ªqŒ±±²¦∏¯¤·¬²±²©·«¨ ³µ¨ ¬¯°¬±¤µ¼·µ¤±¶ª¨±¬¦¶¨ §¨2
¬¯±ª¶º¬·««¬ª«√¬µ∏¯ ±¨·Πσευδοµονασσολαναχεαρυµ k||tstyl ¦¤∏¶¨§¤§¨¤·«µ¤·¨ ²©xy qz h ovs h ²¯º¨ µ·«¤±·«¤·²©·«¨
¦²±·µ²¯ qŒ·º¤¶§¨ °²±¶·µ¤·¨§©µ²°·«¨ ¤¥²√¨ µ¨¶∏¯·¶·«¤··«¨ ¤±·¬2¥¤¦·¨µ¬¤¯ ³¨ ³·¬§¨ ª¨ ±¨ º¤¶¬±·¨ªµ¤·¨§¬±·²·«¨ ª¨±²°¨ ²©∞∏2
¦¤¯¼³·∏¶³¯¤±·¤±§·«¨ ·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·º¬·««¬ª«¨µµ¨¶¬¶·¤±¦¨ º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ §q
Κεψ ωορδσ} Ευχαλψπτυσ υροπηψλλαo≤ ¦¨µ²³¬± ⁄o…¤¦·¨µ¬¤¯2º¬¯·§¬¶¨¤¶¨ o Αντηεραεα περνψι
桉树k Ευχαλψπτυσl是国际公认的速生树种 ∀我国桉树人工林面积达 t1x ≅ tsy«°u ot|{u年 o在我国广
西发现柳桉k Ε qσαλιγνα ≥°¬·«l及巨桉k Ε qγρανδιχι ‹¬¯¯ ·¨¤¬§l人工林内发现青枯病k Πσευδοµονασ σο2
λαναχεαρυµ ∞qƒ q≥°¬·«l以来k曹季丹 ot|{ul o时有发生 o备受其害 o特别是经济性状优良的无性系尤为严
重 o甚至连片死亡 ∀影响到某些无性系的推广 ∀主要易感病的桉树有尾叶桉k Ε qυροπηψλια …¯¤¦®l !巨尾
桉k Ε qγρανδισ≅ Ε qυροπηψλιαl等发病率 u h ∗ ts h o严重时 vs h ∗ ws h k吴清平等 ot|{{l ∀目前 o在桉树
青枯病难以用化学防治的情况下 o培育抗病品种是解决的根本措施 ∀但目前的抗病品种资源选育尚未
成功 o故拟用基因工程将某些抗病基因导入桉树以获得抗病的株系 ∀
澳大利亚 ƒ²µ¥¬²公司及 ≤≥ו ’林业研究所等有桉树转基因的报道 ∀有关学者用不同方法将外源
基因转化于桉树获得瞬时表达 o尚未得到转基因植株k× ∏¨¯¬¨µ¨¶ ετ αλqot||t ~¤±§¨µ¶ ετ αλqot||u ~²µ¤¯ 2¨
­²ot||{ ~≥¨ µ¶¤±²ot||yl其中利用根癌农杆菌k Αγροβαχλερυµ τεχµεφαχιεµσl׬质粒介导于尾叶桉及赤桉k Ε q
χαµαλδενσισl的外植体中标出 Š˜≥基因及 ‘°× µ基因等k∏¦¬¤±¤§¨ ’¯¬√¨ ¬µ¤ot||z ~∏¯ ¬¯±¶ot||zl ∀
笔者首次应用人工合成蚕抗菌肽k≤ ¦¨µ²³¬±l⁄基因通过根癌农杆菌介导于尾叶桉 o获得抗青枯病的
转基因植株 ∀抗菌肽是从中国柞蚕kΑντηεραεα περνψιl蛹免疫血淋巴中分离的多肽 o具有广谱杀菌作用 o
对桉树青枯病假单胞杆菌k Πσευδοµονασ σολαναχεαρυµ ∞qƒ q≥°¬·«l有明显的杀灭效果k张景宁等 ot||xl ∀
根据抗菌肽的氨基酸序列设计合成其基因k徐飞等 ot|{{l o转入根癌农杆菌k李丹清等 ot||sl o先后转化
于烟草k黄自然等 ot||ul !桑树k管志文等 ot||w ~王勇等 ot||{l !水稻k简玉瑜等 ot||zl均获得成功并遗传
到子代具有抗病力 ∀抗菌肽基因转化桉树可以通过无性繁殖大量获得抗青枯病的种苗 o预期是防治青
枯病的新途径 ∀
t 材料与方法
111 材料
供试的桉树品种为尾叶桉k Ε qυροπηψλιαl˜y无性系 o由华南农业大学林学院森林培育教研室提供 o
系青枯病感病品种 ∀供试桉树青枯病假单孢杆菌k Πqσολαναχεαρυµl||tsuy !||tsty o由华南农业大学林学
院森保教研室提供 ∀抗菌肽 ⁄基因及根癌农杆菌 ≥∞o华南农业大学蚕业服装系生物技术室提供 ∀
112 方法
t1u1t 尾叶桉组织培养及植株再生 从无菌苗中剪取叶盘 u ∗ v °°u o接种于表 t培养基中诱导产生愈
伤组织 ∀采用二次正交旋转组合法k唐启义等 ot||zl设计 o调查愈伤组织诱发芽体的最佳配方 ∀从诱导
分化苗中筛选 ∞vp „及 ∞vp …培养基诱导生根 ∀最后将生根良好的组培苗 o经 tsss °ª#pt Ž±’w 液消毒
后移入炼基质中 o经 ts ∗ tw §成活 ∀
表 1 用于尾叶桉叶盘愈伤组织诱导试验的培养基
Ταβ .1 Τηε µεδιυµ υσεδ φορ χαλλυσινδυχινγ τεστ οφ Ε . υροπηλλα
培养基代码
‘²q²© ° §¨¬∏°
培养基组成
≤²°³²¶¬·¬²± ²© °¨ §¬∏°
∞up „
改良 ≥ n y2…„s qt n ‘„„t qs n Œ…„s qw
Œ°³µ²√¨ § ≥ n y2…„s qt n ‘„„t qs n Œ…„s qw
∞up …
改良 ≥ n y2…„s qu n ‘„„s qv
Œ°³µ²√ §¨ ≥ n y2…„s qu n ‘„„s qv
∞up ≤
改良 ≥ n y2…„s qx n ‘„„s qx n Œ…„s qu
Œ°³µ²√¨ § ≥ n y2…„s qx n ‘„„s qx n Œ…„s qu
t1u1u 抗菌肽 ⁄基因转化桉树 含抗菌肽
⁄基因的根癌农杆菌 ≥¨ o感染桉树叶盘 o在
≥固体培养基中预培养 u §o分别转入含不
同浓度的头孢酶素k≤ ©¨l及卡那霉素kŽ¤°l的
≥培养基中 o筛选转化子 ∀按 t1u1t的方法
获得转基因植株k黄自然等 ot||u ~管志文等 o
t||wl ∀
t1u1v 转基因植株的检测 转基因植株中
胭脂碱合成酶基因的检测 o按许耀kt|{zl及
蒋兴邦的kt|{yl方法进行 ∀地高辛k⁄ŒŠl标
v| 第 u期 邵志芳等 }柞蚕抗菌肽 ⁄基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究
记抗菌肽 ⁄基因作探针 o按照试剂盒中说明书进行 ∀对转基因桉树的 ⁄‘„进行点杂交及 ≥²∏·«¨µ± …¯²·2
·¬±ª检测k≥¤°¥µ²²® ετ αλqot|{|l ∀
t1u1w 转基因植株抗青枯病的抗性鉴定 桉树青枯病假单孢杆菌 ||tsty !||tsuy系在广东省雷州市采
集分离纯化的 o具有较强致病力 ∀浸根法接种 }先将待测的试管苗用剪刀剪伤部分须根 o用 t ≅ ts|¦©∏#
°pt的菌液浸渍后移入培养基瓶中培养 ∀对照为同期培养的无菌幼苗 o调查发病情况 ∀
u 结果与分析
211 尾叶桉叶盘愈伤组织诱导及植株再生
u1t1t 愈伤组织诱导 从无菌苗中剪取叶盘接种于不同 ≥培养基中 o其中以 ∞up …培养基k≥ n y2…„
s1u °ª#pt n ‘„„ s qv °ª#ptl效果最好 ∀约经 | §可分化出愈伤组织 o其生长致密 !呈绿色 !表面有突
起 o长势旺盛 o经 us ∗ vs §可转入分化培养基 ∀
u1t1u 愈伤组织分化不定芽 用二次正交旋转组合设计方案进行优选培养基配方 o经 ⁄°≥数据处理软
件分析 ∀调查每块愈伤组织分化的不定芽数 ∀设计方案中因素及其变化区设置如下 }因素 tk÷tly2…„
零水平为 s1{ °ª#pt o变化区为 s1u °ª#pt ~因素 uk÷ul‘„„ 零水平为 s1v °ª#pt o变化区为 s1v °ª#
pt ~≥培养基中 ≤¤un的浓度对分化有一定影响 o故以 ≤¤un 的浓度为因素 vk÷vl以常规 ≥培养基中
≤¤un浓度为零水平 o以常规浓度的 tΠw为变化区 ∀从分化芽的统计结果进行回归方差分析 o在回归模型
中模拟寻优得出最佳配方 ∀即当 ≤¤un浓度为 ≥培养基常规量的 s1xy倍时 o加入 y2…„ s1wy °ª#pt !
‘„„s1tv °ª#pt o愈伤组织的诱芽率kψl达最大值每块 w1wz个 ∀
u1t1v 幼芽诱导生根 设计诱导生根培养基是 ∞vp „ktΠu≥ n ‘„„s1t°ª#pt n Œ…„s qt°ª#ptl及 ∞vp …
ktΠu≥ n ‘„„s1x°ª#pt n Œ…„s qx°ª#ptl o分别将长约 u ∗ v ¦°的不定芽接入诱根培养基中 o发根时间
为 y ∗ { §o生根率均达 |s h以上 ∀ ∞vp „诱导发根数较多但偏弱 o不利于移植 o∞vp …发根虽偏少 o但较粗
壮 o移植成活率较高 o故选定 ∞vp …作为生根培养基 o获得尾叶桉叶盘外植体经愈伤再生的植株k图版 Œp
tl ∀
212 桉树叶盘对卡那霉素及头孢霉素的敏感试验
抗菌肽 ⁄基因载体 ≤²uw含有新霉素磷酸酶基因k‘°× p µl o对 Ž¤°起解毒作用 o用不同浓度 Ž¤°
的培养基以筛选转化子 o同时用不同浓度 ≤ ©¨以抑制残余的农杆菌的生长 ∀结果见表 u !v及图版 ´p u !
´p v o其中每一浓度统计 vs个组织块 o以 {s h k即 uw个l以上的组织块所具有的共同特征表示该浓度的
生长分化情况 ∀
表 2 桉树叶盘对卡那霉素的敏感性试验
Ταβ .2 Τηεσενσιτιϖετεστ οφ Ε . υροπηψλια το Καµ
Ž¤°浓度
Ž¤° ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±kΛª#°ptl
生长分化情况
Šµ²º·«²©§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±
sk≤Žl 分化 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±
ts 分化 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±
us 分化 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±
vs 分化 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±
ws 持绿 Ž¨ ³¨ªµ¨ ±¨
xs 持绿 Ž¨ ³¨ªµ¨ ±¨
ys 黄化 ×∏µ± ¼¨ ¯¯²º
zs ∗ uss 枯萎变黑 • ¬¯·¤±§¥¯¤¦®
表 3 桉树叶盘对头孢霉素的敏感性试验
Ταβ .3 Τηεσενσιτιϖετεστ οφ Ε . υροπηψλια το Χεφ
≤ ©¨浓度
≤ ©¨¦²±¦¨±·µ¤·¬²±kΛª#°ptl
生长分化情况
Šµ²º·«²©§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±
sk≤Žl 分化 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±
tss 分化 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±
vss 分化 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±
xss 持绿 Ž¨ ³¨ªµ¨ ±¨
zss 持绿 Ž¨ ³¨ªµ¨ ±¨
|ss 局部失绿 °¤µ·¯¼ ²¯¶¨ ªµ¨ ±¨
ttss 黄化 ×∏µ± ¼¨ ¯¯²º
tvss ∗ txss 黄化萎缩 ∞·¬²¯¤·¬²± º¬·«¨µ
试验提示卡那霉素 ws Λª#°pt的浓度是临界点 o叶盘所诱导产生的愈伤组织色绿 !较致密 o可满足
w| 林 业 科 学 v{卷
分化不定芽的要求 ∀头孢霉素 zss Λª#°pt的浓度足以抑制农杆菌而对叶盘无不良影响 ∀为使试验顺
利进行 o第 t批有效抑制农杆菌生长后 o可渐次降低头孢霉素的浓度 o以利叶盘的分化 ∀
212 抗菌肽 ⁄基因转化苗的获得及鉴定
u1v1t 转基因苗的筛选 经头孢霉素及卡那霉素的筛选 o在诱导培养基k∞tp …l中培养 us§开始形成愈
伤组织 o待生长稳定体积增大后 o作第 t次继代 o待长至旺盛期后转入分化培养基k∞tp „l以诱导分化不
定芽 o由于卡那霉素的影响 o部分幼芽变黄 o而绿色的幼芽则可长成幼苗 ∀待不定芽长至 t1u ∗ v1s ¦°
时 o转入含临界浓度卡那霉素的诱根培养基k∞vp …l以诱导生根 ∀本实验共获得 us株小苗 o其中 {株能
再生成完整的植株 o占 ws h ∀见图版 ´p w !´p x !´p y ∀
u1v1u 转基因桉树的鉴定
胭脂碱的检测 }抗菌肽 ⁄基因载体 ≤²uw质粒中含有胭脂碱合成酶基因 o处于抗菌肽 ⁄基因下游 o
电泳检测结果见图 t ∀表明转基因桉树呈阳性反应 ∀
⁄‘„点印迹杂交及 ≥²∏·«¨µ±印迹杂交 }取胭脂碱阳性反应的植株 o用 Α2vu °2§≤×°标记的抗菌肽 ⁄基
因作探针 o对转基因苗的 ⁄‘„作点杂交 ∀见图 u !v o结果表明转基因桉树呈阳性反应 ∀然后用地高辛
k⁄ŒŠl标记的抗菌肽 ⁄基因作探针 o进行 ≥²∏·«¨µ±印迹杂交亦呈阳性 o见图 w !x ∀
图 t 转化苗胭脂碱电泳检测结果
ƒ¬ª1t ׫¨ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶µ¨¶∏¯·²©‘²³¯¬±¨ ©µ²°·µ¤±ª¨±¬¦¶¨ §¨¯¬±ª
t }标准胭脂碱 !精氨酸混合物k‘’° n „µªl ~u ∗ w }Ž¤°• 苗 o其
中 u !v呈阳性 ow呈阴性 Ž¤°• ¶¨ §¨¯¬±ªou ¤±§v º µ¨¨ ³²¶¬·¬√¨ ¤±§
w¬¶ ±¨ ª¤·¬√¨~x }非转化桉树植株 k阴性对照l ‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦
¶¨ §¨¯¬±ªk¦²±·µ²¯l
图 u 抗菌肽基因转化菌 ⁄‘„点杂交
kΑ2vu °2§≤×°标记l检测
ƒ¬ª1u ׫¨ §²·¥¯²·¬±ªµ¨¶∏¯·²©·µ¤±¶ª¨±¬¦
¶¨ §¨¯¬±ªº¬·«³µ²¥¨ ¤¯¥¨¯¯ §¨º¬·«Α2vu °2§≤×°
t q≤²uw重组质粒k阳性对照lt q≤²uw µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§
k³²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯lu ov1 转基因桉树植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶¨ §¨2
¬¯±ª~w1 非转化桉树植株k阴性对照l‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶¨ §¨2
¬¯±ªk±¨ ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯l
图 v 抗菌肽基因转化苗 ⁄‘„点杂交k⁄ŒŠ标记l检测
ƒ¬ª1v ׫¨ §²·¥¯²·¬±ªµ¨¶∏¯·²©·µ¤±¶ª¨±¬¦¶¨ §¨¯¬±ªº¬·«³µ²¥¨ ¤¯¥¨¯¯ §¨º¬·«⁄ŒŠ
t q非转化桉树植株k阴性对照l‘²±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶¨ §¨¯¬±ªk±¨ ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯l ~
u1≤²uw重组质粒k阳性对照l≤²uw µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§k³²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯l ~
v ∗ x1转基因桉树植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶¨ §¨¯¬±ª

212 转基因桉树对青枯病抗性的检测
将第 t批 {株呈 ≥²∏·«¨µ±印迹杂交阳性的植株进行无性繁殖获得一批小苗 ∀随机取 vs株 o另取 tx
x| 第 u期 邵志芳等 }柞蚕抗菌肽 ⁄基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究
株非转基因植株作对照 ∀用浸根法接种桉树青枯病假单孢杆菌kt ≅ ts|¦©∏#°ptl ovs ? t ε otsss ¬¯下培
养 z§o两者无大差异 ots§后 o对照区发病 ts株 o转基因区没有明显症状 ~vs§后 o对照区仅存活 u株 o转
基因区存活 tv株 ∀见图版 ´p z o对照区发病率 {y1z h o转基因桉树为 xy1z h o而且发病期延缓 ∀
tl 蓝玲 1 桑组织培养及抗菌肽基因转化技术研究 1 华南农业大学硕士论文 1t||z
图 w 转化苗 ⁄‘„ ≥²∏·«¨µ±杂交检测
kΑ2vu °2§≤×°标记l
ƒ¬ª1w ׫¨ ¶²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ªµ¨¶∏¯·²©⁄‘„ ©µ²°·µ¤±¶ª¨±¬¦¶¨ §¨¯¬±ª
º¬·«³µ²¥¨ ¤¯¥¨¯¯ §¨º¬·«Α2vu °2§≤×°
t q≤²uw 重组质粒 k阳性对照l ≤²uw µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§k³²¶¬·¬√¨
¦²±·µ²¯l ~u1 非转化桉树植株 k阴性对照l ‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶¨ §¨¯¬±ª
k±¨ ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯l ~v1转基因桉树植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶¨ §¨¯¬±ª
图 x 转化苗 ⁄‘„ ≥²∏·«¨µ±杂交检测k⁄ŒŠ标记l
ƒ¬ª1x ׫¨ ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ªµ¨¶∏¯·²©⁄‘„ ©µ²°·µ¤±¶ª¨±¬¦
¶¨ §¨¯¬±ªº¬·«³µ²¥¨ ¤¯¥¨¯¯ §¨º¬·«⁄ŒŠ
t q≤²uw 重组质粒 k阳性对照l ≤²uw µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§k³²¶¬·¬√¨
¦²±·µ²¯l ~~u ∗ v1 转基因桉树植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶¨ §¨¯¬±ª~w1 非转化桉
树植株k阴性对照l‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶¨ §¨¯¬±ªk±¨ ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯l
试验结果表明 o抗菌肽 ⁄基因通过根癌农杆菌介导于尾叶桉树叶盘 o诱导成苗 o经卡那霉素筛选转
化子 o通过胭脂碱 !点杂交及 ≥²∏·«¨µ±印迹杂交 o证明抗菌肽 ⁄基因整合到桉树基因组中 ∀接种青枯菌
后 vs§存活率达 wv1v h o较对照区ktv1v h l明显提高 o且发病较慢 ∀说明转基因桉树提高了其对青枯病
的抗病力 ∀
v 讨论
外源基因对木本植物的遗传转化已在桑树tlk管志文等 ot||w ~王勇等 ot||{l柑桔k陈善春等 ot||zl !
杨树k李强等 ot||yl等木本植物获得成功 o其成功的关键在于建立与之相关的植株组织培养再生技术 ∀
本文结合前人在桉树组织培养方面的经验 o应用二次正交旋转组合设计对再生体系进行优化 o获得比较
理想的结果 o为下一步的目的基因转化奠定基础 o也说明本文的结果是可行的 ∀
对植物青枯病的致死性 o我们一般认为是由于细菌在植物导管中大量繁殖 o堵塞导管影响水分运输
而使植物致死 ∀而本文获得的抗菌肽基因的转化株对青枯病的抗性 o是由于其产生的抗菌肽向导管分
泌抑杀细菌 o还是由于抗菌肽存在于根部的活细胞阻碍青枯菌的侵入或其他机理尚有待进一步的研究 ∀
≥²³«¬¤等kt|||l及 ≤¤µ¯等kt|||l最新的研究结果表明 o从昆虫中获得的抗菌肽不但具有抗细菌的作用 o
而且具有抗真菌的作用 o由此可推测 o本研究在获得的抗青枯病的桉树转化子的同时 o也是对桉树真菌
病害的预防 ∀
转化子中外源基因能否保持及遗传的问题也是值得注意的 ∀从目前的结果看 o经二次继代仍可获
得目的基因 ∀ ∏¯¯¬±¶等kt||zl认为无性繁殖是对外源基因的遗传性优先保留的方法 o因为有性选育的
时间长且由于产生姐妹染色体的交叉互换 o很容易导致目的基因的丢失或基因功能的稀释 ∀目前 o该桉
树在生产上主要以无性繁殖为主 o因而 o对外源目的基因的保持及遗传是有利的 o但尚须经多代的跟踪
检测 ∀
参 考 文 献
曹季丹 1巴西柳桉 !巨桉青枯病调查初报 1广西林业科技资料 ot|{u ow }vs ∗ vt
y| 林 业 科 学 v{卷
陈善春 o张进红 o高峰等 1 根癌农杆菌介导菌肽 ⁄基因转化柑桔的研究 1 中国农业科学 ot||z ovskvl }z ∗ tv
管志文 o张清杰 o黄自然等 1农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入桑树的研究 1 蚕业科学 ot||w ousktl }t ∗ y
黄自然 o李乃坚 o袁四清等 1农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入烟草的研究 1 华南农业大学学报 ot||u otvkwl }t ∗ x
蒋兴邦 o邵启全 o吴春法等 1植物基因工程研究的潜在受体 ) ) ) 甘蓝 1遗传学报 ot|{y otvktl }wv ∗ wz
简玉渝 o吴新荣 o莫豪葵等 1应用基因枪将柞蚕抗菌肽基因导入水稻获抗白枯病株系 1 华南农业大学学报 ot||z ot{kwl }t ∗ z
李丹清 o徐 飞 o黄自然等 1人工合成的抗菌肽 ⁄基因转入根癌农杆菌 1 蚕业科学 ot||s otykul }tts ∗ ttu
李 强 o韩一凡 1 木本植物分子生物学的研究进展 1 世界林业研究 ot||y ovkwl }ts ∗ ty
唐启义 o冯光明 1 实用统计分析及其计算机处理平台 1北京 }中国农业出版社 ot||z ozz ∗ |t
王 勇 o贾士荣 o陈爱玉等 1抗菌肽基轩转入桑树获得抗病基因植株 1蚕业科学 ot||{ ouwkvl }tvy ∗ tws
吴清平 o梁子超 1 桉树抗青枯病树种的筛选 1 华南农业大学学报 ot|{{ o|kwl }wt ∗ wx
徐 飞 o施 文 o王启松等 1柞蚕抗菌肽 ⁄基因的合成 o科学通报 ot|{{ outktl }yxy ∗ yx|
许 耀 o贾敬芬 o郑国昌等 1植物组织中冠瘿碱合成本酶活性检测的一种简便有效的方法 ∀遗传 ot|{z o|kxl }wt ∗ wv
张景宁 o张清杰 o黄自然等 1柞蚕抗菌肽对桉树青枯病假单孢杆菌的杀菌作用 1 华南农业大学学报 ot||x otyktl }|z ∗ tsu
≥¤°¥µ²²®oƒµ¬·¶¦« ∞ ƒ o¤±¬¤·¬¶× q分子克隆实验指导 1 金冬雁 o黎孟枫译 1 北京 }科学出版社 }t|{| ot ∗ tsyu
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图版说明 ∞¬³¯¤±¤·¬²± ²©³¯¤·¨
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右图示 ≤ ©¨浓度为 ttss Λª#°pt的生长表现 ~´p w转基因桉树叶盘愈伤组织分化不定芽 ~´p x转基因桉树诱导生根 ~´p y转基因桉树
移栽苗 ~´p z转基因桉树对青枯病的抗病力检测 o„ }培养瓶接种 tx §结果 o左瓶为对照 o右瓶为转基因植株 ~…}左示对照接种植株根变
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z| 第 u期 邵志芳等 }柞蚕抗菌肽 ⁄基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究
邵志芳等 }柞蚕抗茵肽 ⁄基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究 图版 ´
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