全 文 ：第 v{卷 第 w期
u s s u年 z 月
林 业 科 学
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银杏 ΛΕΑΦΨ同源基因的分离与克隆
张建业 陈力耕 胡西琴
k浙江大学园艺系 杭州 vtssu|l
何新华
k广西大学园艺系 南宁 xvsssxl
关键词 } 银杏 o雄株 o ΛΕΑΦΨo基因
收稿日期 }usst2ts2t{ ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助项目k批准号 }vsszsyvwl ∀
ΛΕΑΦΨ ΗΟΜΟΛΟΓΟΥΣ ΓΕΝΕ ΧΛΟΝΕ∆ ΙΝ ΜΑΙ∆ΕΝΗΑΙΡ ΤΡΕΕk ΓΙΝΚΓΟ ΒΙΛΟΒΑ Λ ql
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k ∆επαρτµεντ οφ Ηορτιχυλτυρε oΖηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ Ηανγζηουvtssu|l
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Αβστραχτ } ׫¨ ©¯²º¨ µ2°¨ µ¬¶·¨°2¬§¨±·¬·¼ ª¨ ±¨ ΛΕΑΦΨ¬¶¤§¨√¨ ²¯³°¨ ±·¤¯ ¶º¬·¦«o¶∏©©¬¦¬¨±·©²µ©¯²º¨ µ¬±¬·¬¤·¬²±¬± §¬√¨ µ¶¨
³¯¤±·¶qΓινκγο βιλοβᬶ¤®¬±§²©ª¼°±²¶³¨µ°o¤±§¤§¬²¨ ¦¬²∏¶·µ¨¨¶³¨¦¬¨¶q׫¨ ±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ⁄‘„ ¶¨ ∏´¨±¦¨ º¤¶¦¯²±¨ §©µ²°
·«¨ ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ ²©·«¨ ·¨±§¨µ¯ ¤¨√¨ ¶¦²¯¯¨ ¦·¨§©µ²°¤°¤¯¨·µ¨¨¬± Γινκγο βιλοβαq¦√ q⁄¤©∏¶«²∏q׫¨ ¤±¤¯¼¶¬¶²©⁄‘„ ¶¨2
∏´¨ ±¦¨ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ¬±§¬¦¤·¨§·«¤··«¨ ª¨ ±¨ º¤¶¦²°³²¶¨§²©vwxs ¥³o¤±§¬±©¨µµ¨§·«¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ·² ΛΕΑΦΨ ª¨ ±¨ ²©·«¨ °¤¯¨
Γινκγο q≤²°³¤µ¬±ª·«¨ ª¨ ±¨ º¬·« ΛΕΑΦΨ ª¨ ±¨ ²©·«¨ ©¨ °¤¯¨ Γινκγο µ¨³²µ·¨§¬±·«¨ µ¨ ¤¯·¬√¨ µ¨©¨µ¨±¦¨¶o·«¨ µ¤·¨²©«²°²¯²ª¼
º¤¶|| h o²±¯¼ ¤¯¦®¬±ªv ±∏¦¯¨ ²·¬§¨¶q׫¨ µ¨¶¨¤µ¦«º²µ® ¤¯¬§¤¶²∏±§©²∏±§¤·¬²±©²µ¶·∏§¬±ª·«¨ µ¨ª∏¯¤·¬²± ¤±§¦²±·µ²¯ ¬¯±ª
©¯²º¨ µ¬±ª °¨ ¦«¤±¬¶°¬± Γινκγο βιλοβαq¤··«¨ °²¯ ¦¨∏¤µ¯ √¨¨ ¯¬±·«¨ ©∏·∏µ¨ q
Κεψ ωορδσ} Γινκγο βιλοβα qo ¤¯¨o ΛΕΑΦΨo Š¨ ±¨
银杏k Γινκγο βιλοβα ql o又名白果 o公孙树 o著名的孑遗植物 o是珍贵的药用 !材用 !观赏用树种 ∀但
银杏的童期很长 o实生树开花需要 us ¤以上 ∀为缩短银杏童期 o果树工作者从栽培方式 !传统育种进行
了大量的研究 o但成效不大 ∀近年来应用分子生物学研究植物上的开花取得了很大进展 ∀t||u年 o• ¬¨2
ª¨¯等从拟南芥菜中克隆到 ΛΕΑΦΨ基因 o指出 ΛΕΑΦΨ是一个花分生组织特征基因 o并调控植物开花的时
间k • ¬¨ª¨¯ ετ αλqot||ul ∀ °¨ ±¤等将拟南芥菜 ΛΦΨ基因转入柑桔 o得到的转基因柑桔 o当年开花 o且果实
正常 o其种子当年播种 o翌年春天即开花结果k°¨ ±¤ ετ αλqousstl ∀说明 ΛΕΑΦΨ基因的大量表达可促进
植物提早开花 o这也在拟南芥菜 !欧洲山杨k • ¬¨ª¨¯ ετ αλqot||xl !水稻k‹¨ ετ αλqousssl得到了证明 ∀银
杏雌雄异株 o其雌雄株在染色体核型 !过氧化物同工酶谱等都有较大差异k梁立兴 ot|{{l ∀但银杏雌雄
株 ΛΕΑΦΨ基因是否存在差异 o以及雌雄株开花的分子调控机理 o国内外未见报道 ∀笔者克隆了银杏雄
株 ΛΕΑΦΨ全长基因 o以比较银杏雌雄株 ΛΕΑΦΨ基因的异同 o为研究银杏开花的分子调控机理 o并通过
转 ΛΕΑΦΨ基因来培育童期短的银杏奠定基础 ∀
1 材料与方法
t1t 材料 ktl植物材料 以银杏品种大佛手雄株 w月中旬幼嫩的叶片为材料提取基因组 ⁄‘„ o采自
浙江大学园艺系果园 ∀kul菌株和质粒 大肠杆菌k Ε qχολιl׊t和质粒 ³˜≤t|本实验室保存 ∀kvl化学
试剂 ×w ⁄‘„连接酶 !³˜≤°2×载体 !÷2Š¤¯ !Œ°×Š !§‘×° !Ταθ³¯∏¶⁄‘„聚合酶均购自上海生物工程公司 ~
限制性内切酶购自 °µ²°¨ ª¤公司 ~⁄usss ⁄‘„ ¤µ®¨µ购自 פŽ¤•¤公司 ~氨苄青霉素k„°³l购自华美生
物工程公司 ∀其他试剂均为国产分析纯试剂 ∀kwl寡核苷酸引物 设计 x对引物 o委托上海生物工程公
司合成 ∀引物如下 }
上游引物 t }xχ „׊Š„×≤≤„Š„„„≤××××≤≤׊≤ vχ 下游引物 t }xχ ××≤≤׊„Š„Š„Š×Š×Š×≤≤„„≤Š vχ
上游引物 u }xχ „׊×׊„׊ŠŠ„„Š≤Š≤„„ŠŠ≤× vχ 下游引物 u }xχ ××≤„≤„Š≤„≤Š„„ׄ≤×≤≤׊×× vχ
上游引物 v }xχ ≤≤≤≤„׊ŠŠ×„„××׊ׄ„≤×ׄ vχ 下游引物 v }xχ ׊≤„×׊×≤×≤≤≤׊„ŠŠ××≤×× vχ
上游引物 w }xχ „×ׄ××≤×××≤„≤„Š„„≤„≤≤×≤ vχ 下游引物 w }xχ ׊„ׄ≤×≤„„≤„×ׄ≤„׊Š≤„× vχ
上游引物 x }xχ „׊×××׊ŠŠ„Š≤„≤×ׄ≤≤Š„„ vχ 下游引物 x }xχ ×≤„„׊„ŠŠ××≤×׊Š≤××××≤× vχ
t1u 方法 ktl基因组 ⁄‘„与质粒 ⁄‘„的提取 用改良 ≤ׄ…法提取叶片基因组 ⁄‘„作为模板 ∀碱
法小批量抽提质粒kƒµ¨§¨µ¬¦® ετ αλqot||{l ∀kul°≤• 扩增方法k在 ‹≠…„Œ⁄ °≤• ∞÷°• ∞≥≥中进行l根据国
外发表的银杏k品种不明l雌株 ΛΦΨ基因k¬¦«¤¨¯ ετ αλqousssl o设计 x对引物 o进行 °≤• 反应 ∀反应体
系为 }ts ≅ °≤• 缓冲液k不含 ªun lx1s ˏoª≤uku1x °°²¯#ptlw1s ˏo§‘×°混合物k§„×° o§××° o§≤×° o
§Š×°各自 u1x °°²¯#ptlw1s ˏo上下游引物均为kts Λ°²¯#ptlt ˏo模板 ⁄‘„kxs ±ª#ˏptlt1s ˏoΤαθ2
³¯∏¶酶kx个活性单位#ˏptls1x ˏo加灭菌双蒸水至总体积 xs ˏ∀扩增参数为 }|w ε 预变性 x °¬±o然后
图 t °≤• 扩增产物琼脂糖凝胶电泳
ƒ¬ªqt „ª¤µ²¶¨ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨·²ªµ¤³«²©°≤• ¤°³¯¬©¬¨§³µ²§∏¦·¶
泳道  ⁄usss ⁄‘„ ¤¯§§¨µo  ⁄usss o„ o…o≤ o⁄o∞
为 °≤• 产物 ¤±¨  ⁄usss ⁄‘„ ¤¯§§¨µ~¤±¨
„ o…o≤ o⁄o∞ ¤µ¨ °≤• ³µ²§∏¦·¶q
|w ε ows ¶oxu ε ows ¶ozu ε oys ¶o进行 vx 个循环 o再
zu ε 延伸 ts °¬±∀kvl⁄‘„片段重组入质粒载体 °≤•产
物在 t h 的琼脂糖凝胶上电泳 o同时点 ⁄usss ⁄‘„
¤¯§§¨µo用 ±Œ„ ∏´¬¦®胶回收试剂盒从凝胶上回收 !纯化
目的条带 ∀将回收产物连接到 ³˜≤°2×载体上 o连接产
物转化大肠杆菌 ׊t菌株感受态细胞 o通过蓝白斑筛
选 !°≤• 验证 !质粒长度对比和酶切鉴定获得重组质粒
k≥¤°¥µ²²® ετ αλqot||xl ∀kwl⁄‘„序列测定 委托上海
晶泰生物技术有限公司测序 ∀
2 结果与分析
u1t °≤• 产物的获得和克隆 用 t !u !v !w !x等 x对引
物 o从银杏叶片基因组中相应地扩增出 x个不同的 ⁄‘„
片段 }„ o…o≤ o⁄o∞o在 t h琼脂糖凝胶上电泳 o结果如图
t o显示各片段长度分别为 w{s ¥³!zss ¥³!zxs ¥³!{ss ¥³!
zys¥³左右 ∀用 ±Œ„ ∏´¬¦®胶回收试剂盒从胶上回收 !纯
化 ⁄‘„ ∀将纯化的 ⁄‘„片段用 ³˜≤°2×载体连接 o连接产物转化大肠杆菌 ׊t菌株感受态细胞 o在含氨苄
青霉素 !÷2ª¤¯及Œ°×Š的 …平板上涂布转化细胞 o获得白色菌落 ∀挑取这些菌落培养 !提取质粒 o经长度
对比k图 ul和酶切k∞¦²•Œ和 ÷«² 双´酶切lk图 vl鉴定 o获得重组质粒 „ o…o≤ o⁄o∞∀
图 u 重组质粒琼脂糖凝胶电泳
ƒ¬ªqu „ª¤µ²¶¨ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨·²ªµ¤³«
²©µ¨¦²°¥¬±¤·¬²± ³¯¤¶°¬§
t q°˜≤t|质粒 u qv ow ox oy重组质粒
„ o…o≤ o⁄o∞q¤±¨ ¯ °˜≤t| ³¯¤¶°¬§q¤±¨
u ∗ y µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§„ o…o≤ o⁄o∞q
图 v ∞¦²• ´和 ÷«²´双酶切产物琼脂糖凝胶电泳
ƒ¬ªqv „ª¤µ²¶¨ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨·²ªµ¤³«µ¨¦²°¥¬±¤±·
³¯¤¶°¬§¶§¬ª¨¶·¨§¥¼ ∞¦²• ´ ¤±§÷«²´
 }⁄usss ¤µ®¨µt ou qv ow ox重组质粒 „ o…o≤ o⁄o∞酶切
¤±¨  ⁄usss ¤¯§§¨µq¤±¨ ¯∗ x §¬ª¨¶·¨§³µ²§∏¦·¶²©
µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§„ o…o≤ o⁄o∞q
u1u 基因序列与同源性分析 测定重组质粒 „ !… !≤ !⁄!∞的序列 o表明所克隆的 ⁄‘„片段分别长 w{s
¥³!y|{¥³!zxt¥³!{sz¥³和 zzw¥³∀将所获得的基因片段序列拼接起来 o在 ª¨ ±¨ ¥¤±®中进行检索 o发现该
{yt 林 业 科 学 v{卷
序列与文献报道的银杏雌株 ΛΕΑΦΨ基因核苷酸序列同源性高达 || h o蛋白质序列同源性达 || h ∀序列
首端有起始密码子 o末端为终止密码子 o我们推断是全长的 ΛΕΑΦΨ基因 o该全长基因核苷酸序列及推测
的氨基酸序列如图 w ∀从内含子边界特征和多种植物 ΛΕΑΦΨ基因同源性比较 o确定了该基因的内含子
位置 ∀该基因含 u个内含子 ov个外显子 ∀与雌株 ΛΕΑΦΨ基困相比较 o雄株 ΛΕΑΦΨ基因少 v个碱基 o突
变均在植物 ΛΕΑΦΨ基因的非保守区内k图 w中阴影部分为植物 ΛΕΑΦΨ基因保守区l ∀
|yt 第 w期 张建业等 }银杏 ΛΕΑΦΨ同源基因的分离与克隆
图 w 银杏雄株 ΛΕΑΦΨ基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
k小写字母部分为内含子 !阴影部分为多种植物 ΛΕΑΦΨ同源基因的保守区l
ƒ¬ªqw ‘∏¦¯¨ ²·¬§¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ²© ΛΕΑΦΨ¤±§·«¨ ¬±·¨µµ¨§¶¨ ∏´¨±¦¨ ²©¤°¬±²¤¦¬§©²µ·«¨ °¤¯¨ Γινκγο
kŒ±·µ²±¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶¤µ¨ ª¬√¨ ±¬±·«¨ ¶°¤¯¯¯¨·¨µ¶q׫¨ ¶«¤§²º ³¤µ·¶¤µ¨ ·«¨ ¦²±¶¨µ√¨ µ·¬√¨ µ¨ª¬²±¶²© ΛΕΑΦΨ©²µ§¬√¨ µ¶¨ ³¯¤±·¶l
对于银杏的雌雄株的花芽形态分化已有报道k史继孔等 ot||{ ~张万萍等 ousstl ∀但从分子水
平上研究银杏的开花调控机制 o尚未见报道 ∀银杏雌雄株 ΛΕΑΦΨ基因序列的高度同源并不能说明
ΛΕΑΦΨ在银杏雌雄株体内的表达也很相似 o何况银杏雌株 ΛΕΑΦΨ基因的功能研究也还没有报道过 ∀银
杏作为一种很古老的雌雄异株的裸子植物 o其开花的调控可能是比较特殊的 ∀另外 o从分子水平研究银
杏的开花机理 o还有助于弄清植物开花功能的进化与演变 ∀这些都需要进一步研究 oΛΕΑΦΨ基因的成
功克隆为此打下了一个很好的基础 ∀
参 考 文 献
梁立兴 编著 q中国银杏 q济南 }山东科学技术出版社 ot|{{ oux ∗ uy
史继孔 o樊卫国 o文晓鹏 q银杏雌花芽形态分化的研究 q国艺学报 ot||{ ouxktl }vv ∗ vy
张万萍 o史继孔 o樊卫国等 q银杏雄花芽的形态分化 q园艺学报 ousst ou{kvl }uxx ∗ ux{
ƒµ¨§¨µ¬¦®  o„∏¶∏¥¨¯ ετ αλq精编分子生物学实验指南 q王海林译 q北京 }科学出版社 ot||{
‹¨ «o«∏ ± o⁄¤¥¬× ετ αλq×µ¤±¶©²µ°¤·¬²±²©µ¬¦¨ º¬·«·«¨ Αραβιδοπσισ©¯²µ¤¯ µ¨ª∏¯¤·²µΛΕΑΦΨ¦¤∏¶¨ ¤¨µ¯¼ «¨ ¤§¬±ªq×µ¤±¶ª¨ ±¬¦• ¶¨qusss o|kvl }uuv ∗ uuz
Ž¨¯¯¼ „ o…²±±¯¤±§¨µ … ¤±§ ¨¨ ®¶2 • ¤ª±¨ µ⁄ • q‘ƒo·«¨ ·²¥¤¦¦²«²°²¯²ª²© ΦΛΟ2ΡΙΧΑΥΛΑ¤±§ ΛΕΑΦΨo¬¶·µ¤±¶¦µ¬³·¬²±¤¯ ¼¯ ¬¨³µ¨¶¶¨§¬± ¥²·«√¨ ª¨·¤2
·¬√¨¤±§©¯²µ¤¯ ° µ¨¬¶·¨2°¶q°¯ ¤±·≤¨¯¯qt||x oz }uux ∗ uvw
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°¨ ±¤o¤µ·¬±2×µ¬¯¯²  o∏¤µ¨½ ετ αλq≤²±¶·¬·∏·¬√¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²© Αροβιδοπσισ ∞„ƒ≠ ²µ„°∞ׄ„t ª¨ ±¨ ¶¬± ¦¬·µ∏¶µ¨§∏¦¨¶·«¨¬µ¶ª¨ ±¨ µ¤·¬²±·¬°¨q‘¤·q
…¬²·¨¦«±²¯ qousst ot|kvl }uyv ∗ uyz
≥¤°¥µ²²®oƒµ¬·¶¦« ∞ ƒ o¤±¬¤·¬¶× 著 q分子克隆实验指南 q第二版 q金冬雁 o黎孟枫等译 o候云德等校 q北京 }科学出版社 ot||x ouy ∗ yy
• ¬¨ª¨¯ ⁄o„¯ √¤µ¨½ o≥°¼·« ⁄ • o≠¤±²©¶®¼  ƒ ¤±§  ¼¨¨ µ²º¬·½ ∞  qΛΕΑΦΨ¦²±·µ²¯¶©¯²µ¤¯ ° µ¨¬¶·¨°¬§¨±·¬·¼¬± Αραβιδοπσισq≤¨¯¯ot||u oy| }{wv ∗ {x|
• ¬¨ª¨¯ ⁄¤±§‘¬¶¶²± ’ q„ §¨√¨¯²³° ±¨·¤¯ ¶º¬·¦«¶∏©©¬¦¬¨±·©²µ©¯²º µ¨¬±¬·¬¤·¬²±¬± §¬√ µ¨¶¨ ³¯¤±·¶q‘¤·∏µ¨ ot||x ovzz }w|x ∗ xss
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