全 文 ：第 wt卷 第 u期
u s s x年 v 月
林 业 科 学
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¤µqou s s x
银杏胚轴 !子叶诱导胚状体发生及成苗的研究 3
郭长禄t ou 陈力耕t 何新华t ov ≥¼¨ § „¶ª¤µ×²µ¬t 袁海英t
kt q浙江大学农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 杭州 vtssu| ~
u q哈尔滨工业大学海洋学院 威海 uywus| ~ v q广西大学农学院 南宁 xvsssxl
关键词 } 银杏 ~胚轴 ~子叶 ~胚状体发生 ~植株再生
中图分类号 }≥zt{1wy ~≥zuu1vn z ~±|wv1t 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsu p stz{ p sw
收稿日期 }ussv p ts p vt ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助项目kvsszsyvwl ∀
3 陈力耕为通讯作者 ∀
Στυδψ ον Σοµατιχ Ε µ βρψογενεσισ οφ Εµ βρψονιχ Αξισ ανδ Χοτψλεδον
ιν Γινκγο βιλοβα ανδ Πλαντλετ Φορµατιον
Š∏² ≤«¤±ª¯∏tou ≤«¨ ± ¬ª¨±ªt ‹¨÷¬±«∏¤tov ≥¼¨ §„¶ª¤µ×²µ¬t ≠∏¤± ‹¤¬¼¬±ªt
kt qΚεψΛαβορατορψοφ Μινιστρψοφ Αγριχυλτυρε φορ Γροωτη ∆εϖελοπµεντ ανδ Βιοτεχηνολογψοφ Ηορτιχυλτυραλ Πλαντo Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ Ηανγζηου vtssu| ~
u qΣχηοολοφτηε Οχεαν oΗαρβιν ινστιτυτε οφτεχηνολογψ Ωειηαι uywus| ~v qΑγριχυλτυραλ Χολλεγε οφ Γυανγξι Υνιϖερσιτψ Ναννινγ xvsssxl
Αβστραχτ} ∞°¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶¤±§¦²·¼¯ §¨²± ²©¬°°¤·∏µ¨ ¤±§ °¤·∏µ¨ °¨¥µ¼²¶ º¨ µ¨ ¬±§∏¦¨§¤¶ ¬¨³¯¤±·¶©²µ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶¬±
Γινκγο βιλοβαq • ¶¨∏¯·¶¶«²º¨ §¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²¶¦²∏¯§ ¥¨ ¬±§∏¦¨§ ²±¯¼ ·«µ²∏ª« °¨¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶¤±§¦²·¼¯ §¨²± ²©¬°°¤·∏µ¨
°¨¥µ¼²¶q Žn ‘„„ t °ª#pt n yp…„ t °ª#pt º¤¶·«¨ ¥¨¶·°¨ §¬∏°©²µ¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶©µ²° °¨¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶o¤±§
¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶µ¤·¨ º¤¶wx qu{ h q Ž n ‘„„ t qx °ª#pt n yp…„ t °ª#pt º¤¶·«¨ ¥¨¶·°¨ §¬∏° ©²µ¶²°¤·¬¦
°¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶©µ²° ¦²·¼¯ §¨²±o¤±§¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶µ¤·¨ º¤¶tu q| h q׫¨ ªµ²º·«¤±§§¨√¨ ²¯³°¨ ±·²©¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²¶
º¨ µ¨ ³µ²°²·¨§¥¼ ¤§§¬±ªts h ¦²¦²±∏·°¬¯®¬±·² Žo¤±§vw qw{ h ¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²¶¦²∏¯§§¨√¨ ²¯³¬±·² ³¯¤±·¶q
Κεψ ωορδσ} Γινκγο βιλοβα~ °¨¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶~¦²·¼¯ §¨²±~¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶~³¯¤±·ª¨ ±¨ µ¤·¬²±
银杏k Γινκγο βιλοβαl素有裸子植物/活化石0之称 o在植物学上具有重要的研究价值 ~同时银杏的经济价
值也很高 o既可作为园林绿化树种 o也是优良用材树种 o且其种子 !叶片富含营养与药用成分 o用途广泛 ∀然
而银杏是雌雄异株植物 o实生苗定植后一般需要 us ∗ vs ¤才能开花结果 !分出雌雄 o常规育种时间长 !效率
低 ∀栽培过程中结实晚 o早期收益低 ∀因此应用生物技术改良品种和进行优良品种的快繁 o前景都十分广
阔 ∀us世纪 vs年代以来 o银杏组织培养主要以胚k¬ot|vwl !配子体k×∏¯ ¦¨®¨ ot|xz ~•²«µot|{sl及营养器官
k罗紫娟 ot|{xl为材料 o对胚胎学 !形态发生及离体培养等进行研究 o但由于银杏离体培养分化特别困难 o均
未得到丛生芽和胚状体 ~直到 |s年代 o才相继采用不同的外植体 o如花粉k¤∏µ¤¬± ετ αλqot||v¤l !雌配子体
k¤∏µ¤¬± ετ αλqot||v¥l !未成熟胚k¤∏µ¤¬± ετ αλqot||yl !成熟胚k吴元立等 ot||{l o成功地诱导出胚状体 o但是
这些胚状体最多也只是生长到显微结构上的子叶期 o最长不过 t °° o便不再生长 o褐化死亡 ∀本研究从银杏
未成熟胚的胚轴和子叶中得到胚状体 o并获得完整植株 ∀
1 材料与方法
t qt 材料 佛手银杏种子 }|月中旬k未成熟胚l和 ts月下旬k成熟胚l采集于浙江大学华家池校区果园内 ∀
t qu 方法 愈伤组织和胚状体的诱导 }取银杏种子 o去除肉质外种皮 o清洗 !晾干 ∀剥去骨质中种皮 o用
zs h的乙醇浸泡约 vs¶后 os qt h的 ‹ª≤¯ u 浸泡 { ∗ ts °¬±o无菌水冲洗 v ∗ x次 o用无菌滤纸吸去种子表面水
份 o在操净台中取出胚 o切除胚根 o将胚轴和子叶分开 o分别接种于附加了不同激素的诱导培养基上 ou次重
复 o诱导愈伤组织和胚状体发生 ∀接种后 us§统计胚轴和子叶的愈伤组织诱导率k表 tl oxs§统计胚状体的
诱导情况k表 ul ∀诱导胚状体的多少用每克愈伤组织所含的胚状体数来表示 ∀
将诱导出胚状体的愈伤组织在无菌条件下取出 o剥离胚状体 o接种于分别含有不同浓度的活性炭ks ou o
v ow ª#ptl !蔗糖ks ots ovs ows oxs ª#ptl和椰汁ks ots h ous h ovs h l的 ≥ !Žk即改良 ≥培养基 o是 ≥培
养基组分中 ª≥’w#z‹u ’改为 v1z ª#pt oŽ‹u°’w 改为 t1z ª#pt o其他同 ≥l !≥ n Œ…„ s qx °ª#pt培养基
上 o研究其对胚状体成苗的影响 ∀
t qv 培养条件 培养温度kux ? ul ε o光照强度 u sss ¬¯o光照时间 ty «#§pt ∀基本培养基为 ≥ !• «¬·¨ !Žo
用 s qt °²¯#pt ‹≤¯ 或 t °²¯#pt ‘¤’‹调节 ³‹值 o在灭菌前各基本培养基 ³‹值为 x q{ o无特殊说明的 o培养
基中的蔗糖浓度均为 vs ª#pt o琼脂为 { ª#pt otut ε 灭菌 tx °¬±∀
2 结果与分析
u qt 银杏胚轴 !子叶愈伤组织诱导 由表 t可知 }相同条件下 o银杏未成熟胚胚轴和子叶愈伤组织诱导率
差别不大 o成熟胚子叶比胚轴更易产生愈伤组织 o未成熟胚的子叶和胚轴愈伤组织诱导率都好于成熟胚 ∀但
无论成熟胚还是未成熟胚 o胚轴产生的愈伤组织k图版Œp tl质量较好 o质地细腻 !均匀一致 ~而子叶产生的愈
伤组织质量较差 o不均匀 o尤其部分成熟胚子叶只表面愈伤化 o伸长较快 o生长一段时间后 o愈伤组织易开裂 ∀
试验发现 o把长度为 v °°以上的子叶切割开培养 o较整个培养 o诱导愈伤组织的效果好 o可能是培养基和子
叶的接触面积加大 o增加了培养基和激素对子叶的作用 ∀v种基本培养基中 o• «¬·¨培养基诱导愈伤组织的
效果都比较差 o在 ≥培养基中附加激素 ‘„„ks qx ∗ t qx °ª#ptl和 yp…„ t °ª#pt有利于愈伤组织的诱导 o
而 u owp⁄t °ª#pt和 Ž× t °ª#pt不利于愈伤组织的形成 ∀无论胚成熟与否 o≥培养基和 Ž培养基都能很
好地诱导子叶和胚轴愈伤组织的发生 ∀
表 1 银杏胚轴 !子叶愈伤组织诱导 ≠
Ταβ . 1 Χαλλυσφορµατιον οφ εµ βρψονιχ αξισ ανδ χοτψλεδον
培养基
 §¨¬∏°
激素
‹²µ°²±¨ ¶Π
k°ª#ptl
胚轴 ∞°¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶ 子叶 ≤²·¼¯ §¨²±
成熟胚 ¤·∏µ¨ °¨¥µ¼²¶ 未成熟胚 Œ°°¤·∏µ¨ °¨¥µ¼²¶ 成熟胚 ¤·∏µ¨ °¨¥µ¼²¶ 未成熟胚 Œ°°¤·∏µ¨ °¨¥µ¼²¶
接种胚数
Ν
愈伤诱导率
ΦΠh
接种胚数
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愈伤诱导率
ΦΠh
接种胚数
Ν
愈伤诱导率
ΦΠh
接种胚数
Ν
愈伤诱导率
ΦΠh
≥ ‘„„ s qx ys |v qvv vs tss ww |x qwx yy |{ qw|
≥ ‘„„ t n yp…„ t x{ {| qyy y| |{ qxx vy |z quu yv tss
≥ ‘„„ t qx n yp…„ t vy |t qyz ys tss yy |{ qw{ wu tss
≥ u owp⁄t n Ž× t ys zs wz {| qvy v| zy q|u xu |w quv
• «¬·¨ ‘„„ t n yp…„ t vy zx ww {{ qyw w{ {v qvv wv |s qzs
• «¬·¨ u owp⁄t n Ž× t vu xs yv yt q|s ww xw qxx wy yx quu
Ž ‘„„ s qx ys |s zw |{ qyx vy |w qww yx |{ qwy
Ž ‘„„ t n yp…„ t w| |t q{w xv |{ qtt v| |z qww y{ |{ qxv
Ž ‘„„ t qx n yp…„ t v| {| qzw wy |z q{v xw |y qvs yu tss
≠ Ν }‘∏°¥¨µ²©¬±²¦∏¯¤·¨§ °¨¥µ¼²¶~Φ}≤¤¯ ∏¯¶¬±§∏¦·¬²±©µ¨ ∏´¨ ±¦¼ q
u qu 胚轴 !子叶胚状体的诱导 愈伤组织产生后 o部分愈伤组织可分化产生胚状体 o其中有 {种培养基可产
生胚状体k表 ul o而且只有未成熟胚的胚轴和子叶能分化胚状体 o成熟胚的胚轴和子叶均不能分化 ∀未成熟
胚胚轴胚状体分化效果好于子叶 o在 Ž n ‘„„ t °ª#pt n yp…„ t °ª#pt培养基上分化率最高 o分化率为
wx qu{ h k图版 Œp w oxl o每克愈伤组织最多可产生胚状体 vu qx个 o平均达 t{ qvv 个 ∀子叶在 Ž n ‘„„ t qx
°ª#pt n yp…„ t °ª#pt培养基上分化率最高 o分化率为 tu q| h k图版 Œp u ovl o每克愈伤组织最多可产生胚
状体 tx q{v个 o平均 | qtz个 ∀从激素水平来说 o与诱导愈伤组织的效果相似 o以 ‘„„和 yp…„配比为最佳 o既
有利于愈伤组织的形成 o也有利于进一步分化胚状体 ~而 Ž×和 u owp⁄不能诱导胚状体的发生 ∀相对 ≥培
养基来说 oŽ培养基更有利于胚轴和子叶胚状体的发生 ∀
u qv 活性炭 !蔗糖 !椰汁对胚状体成苗的影响 胚状体在 ≥ !Ž!≥ n Œ…„ s qx °ª#pt培养基上不能生
长 o褐化死亡 ∀当活性炭增加到 v ª#pt时 o胚状体在 ≥ n Œ…„ s qx °ª#pt培养基上稍有生长 o但也褐化死
亡 o而在 Ž培养基上则生长发育较好 o有 ts h胚状体生长成苗k图版 Œp zl o说明添加活性炭 v ª#pt有利于
胚状体的生长发育 ∀
|zt 第 u期 郭长禄等 }银杏胚轴 !子叶诱导胚状体发生及成苗的研究
表 2 银杏胚轴 !子叶胚状体诱导
Ταβ . 2 Σοµ ατιχ εµ βρψο ινδυχτιον οφ εµ βρψονιχ αξισ ανδ χοτψλεδον
培养基
 §¨¬∏°
激素
‹²µ°²±¨ ¶Π
k°ª#ptl
外植体k未成熟胚l
∞¬³¯¤±·
kŒ°°¤·∏µ¨ °¨¥µ¼²l
愈伤诱导率
≤¤¯ ∏¯¶¬±§∏¦·¬²±
©µ¨ ∏´¨ ±¦¼Πh
胚状体诱导率
Œ±§∏¦·¬²±©µ¨ ∏´¨ ±¦¼
²© °¨¥µ¼²¶Πh
每克愈伤组织胚状体数
‘∏°¥¨µ²© °¨¥µ¼²¶
³¨µªµ¤° ¦¤¯ ∏¯¶
每克愈伤组织平均胚状体数
 ¤¨± ±∏°¥¨µ²© °¨¥µ¼²¶
³¨µªµ¤° ¦¤¯ ∏¯¶
≥ ‘„„ t n yp…„ t 胚轴 ∞°¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶ |{ qxx ts qtw v qxt ∗ tx qs { qvv
≥ ‘„„ t qx n yp…„ t 胚轴 ∞°¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶ tss y qyz w qvu ∗ tz qx ts
Ž ‘„„ s qx 胚轴 ∞°¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶ |{ qyx x qwt u qxs ∗ tu qx y q{t
Ž ‘„„ t n yp…„ t 胚轴 ∞°¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶ |{ qtt wx qu{ v quw ∗ vu qx t{ qvv
Ž ‘„„ t qx n yp…„ t 胚轴 ∞°¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶ |z q{v u{ quy x q{v ∗ vs q{v tx quy
≥ ‘„„ t n yp…„ t 子叶 ≤²·¼¯ §¨²± tss y qvx v qvv ∗ ts q{v y qyz
Ž ‘„„ t n yp…„ t 子叶 ≤²·¼¯ §¨²± |{ qxv w qwt w qtz ∗ tv qvv z qxs
Ž ‘„„ t qx n yp…„ t 子叶 ≤²·¼¯ §¨²± tss tu q|s t qyz ∗ tx q{v | qtz
蔗糖对胚状体生长发育也有一定影响 o在蔗糖浓度为 ts ª#pt的条件下 o胚状体在各培养基上 o不再生
长 o而且很快变黄 !死亡 o可能蔗糖的浓度太低 o不能为胚状体的生长提供足够的营养 ∀而随着蔗糖浓度的升
高 o胚状体推迟变黄 o当浓度为 ws ª#pt时 oŽ培养基上有 t| quv h胚状体生长成苗k图版 Œp {l ∀但蔗糖浓
度升至 xs ª#pt时 o胚状体又不能继续生长发育 o说明 Ž培养基为基本培养基较好 o胚状体最适的蔗糖浓
度为 ws ª#pt o过高过低都不利于胚状体的生长发育 ∀胚状体成苗率低 o也许是其他条件还不适宜胚状体的
生长发育所致 ∀
添加不同浓度的椰汁于 ≥ !≥ n Œ…„ s qx °ª#pt培养基上 o虽然都能使胚状体稍有生长 o但不久都褐
化死亡 ∀在 Ž培养基中添加椰汁 o胚状体的发育明显得到改善 o在添加 ts h椰汁的培养基上 o有 vw qw{ h胚
状体生长成苗k图版 Œp |l o当浓度升高到 us h时 o有 y q| h的胚状体发育成苗 o当浓度再升高 o胚状体虽然稍
有生长 o但不久褐化死亡 ∀说明在 Ž培养基上添加 ts h椰汁对胚状体生长发育的促进效果最好 o浓度太高
不利于胚状体继续发育成苗 o也说明 Ž培养基有利于胚状体成苗 ∀
3 结论与讨论
未成熟胚处于植株的发育早期 o脱分化后容易再分化 o是组织培养中常用的外植体 ∀有人认为被子植物
k∂¤¶¬¯ot|{zl和裸子植物k„·µ¨¨ ετ αλqot||vl未成熟胚诱导胚状体发生优于成熟胚 o许多难分化的作物诱导
分化获得成功 o大部分先是以未成熟胚为外植体获得的 ∀本试验采用佛手银杏成熟胚和未成熟胚的胚轴 !子
叶为外植体 o结果只有未成熟胚胚轴 !子叶能够诱导出胚状体 o也说明了未成熟胚分化能力强于成熟胚 ∀
Ž培养基较 ≥培养基更易于形成胚状体 o这可能由于 Ž培养基提供了更适合胚状体形成的营养条
件 ∀从外植体来看 o未成熟胚的子叶 !胚轴都能诱导出胚状体 o子叶最大诱导率为 tu q| h o培养基为 Ž n
‘„„ t qx °ª#pt n yp…„ t °ª#pt ~胚轴最大诱导率为 wx qu{ h o培养基为 Ž n ‘„„ t °ª#pt n yp…„ t °ª
#pt ∀胚轴比子叶更易于分化胚状体 ∀
由于选材和其他因素的影响 o胚状体生长能力较差 o许多情况下不能进一步生长发育k¬∏ ετ αλqot||sl ∀
银杏胚状体进一步发育也出现了类似的问题 ∀本试验发现分别在 Ž培养基中附加适量的活性炭 !蔗糖 !椰
汁处理胚状体 o都能在不同程度上促进胚状体发育成苗 ∀王伏雄等kt|yxl认为椰汁对银杏未成熟胚的生长
发育有促进作用 ∀本试验通过附加 ts h椰汁 o胚状体的生长发育较好 ovw qw{ h的胚状体发育成苗 o也进一步
说明了椰汁有利于银杏胚状体生长发育 ∀
参 考 文 献
罗紫娟 qt|{x q银杏茎段的组织培养 q植物生理学通讯 oktl }vx p vy
王伏雄 o陈祖铿 qt|yx q银杏幼胚离体培养的研究 ) ) ) 椰子乳汁对幼胚生长的影响 q植物学报 otvkvl }uuw p uv{
吴元立 o严学成 qt||{ q银杏成熟胚培养的细胞组织学观察 q林业科学 ovwkwl }{ p tv
„·µ¨¨≥  oƒ²º®¨ ≤ qt||v q∞°¥µ¼²ª¨ ±¼ ²©ª¼°±²¶³¨µ°¶}¤§√¤±¦¨¶¬± ¶¼±·«¨·¬¦¶¨ §¨·¨¦«±²¯²ª¼ ²©¦²±¬©¨µ¶q°¯ ¤±·≤¨¯¯ ׬¶¶∏¨ ’µª¤± ≤∏¯·∏µ¨ ovx }t p vx
s{t 林 业 科 学 wt卷
¤∏µ¤¬± ⁄o≤«¨ ±¬¨∏¬oŠ∏¬¯¯ µ¨qt||v¥q⁄¬µ¨¦· °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶©µ²° ©¨ °¤¯¨ «¤³¯²¬§³µ²·²³¯¤¶·¶²© Γινκγο βιλοβα qo¤ °¨ §¬¦¬±¤¯ º²²§¼ ¶³¨¦¬¨¶q °¯ ¤±·≤¨¯¯
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×∏¯ ¦¨®¨ • qt|xz q׫¨ ³²¯¯¨ ± ²© Γινκγο βιλοβα }Œ± √¬·µ²¦∏¯·∏µ¨ ¤±§·¬¶¶∏¨ ©²µ°¤·¬²±q„°¨ µ¬¦¤²∏µ±¤¯ …²·¤±¼oww }ysu p ys{
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t{t 第 u期 郭长禄等 }银杏胚轴 !子叶诱导胚状体发生及成苗的研究