全 文 ：第 ws卷 第 t期
u s s w年 t 月
林 业 科 学
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¤±qou s s w
麦芽糖 !‘„„及 „…„对华北落叶松体细胞胚
成熟及生根的影响
齐力旺 韩一凡 韩素英 王建华
k中国林业科学研究院林业研究所 北京 tsss|tl
⁄¬¨·µ¬¦« ∞º¤¯§
k德国联邦林业研究中心 o林木育种与生物技术研究所 ∞¥¨µ¶º¤¯§¨µ≤«¤∏¶¶¨¨y otxvzzl
摘 要 } 研究了麦芽糖 !‘„„ !„…„对华北落叶松体细胞胚发生及体细胞胚根发生和再生完整植株的影响 ∀结果
表明 }在胚性愈伤组织继代 !增殖过程中 o以 s1x °ª#pt的 ‘„„代替 u ow p ⁄后 o有利于体细胞胚的成熟和根发生 ∀
在 „…„ ty °ª#pt时 o产生的华北落叶松体细胞胚 o能够再生良好植株 o„…„大于 us °ª#pt时对体细胞胚根的发育
不利 ∀在含 v h麦芽糖 !w h °∞Šwsss活性炭 t ª#pt的成熟培养基上 o华北落叶松每克愈伤组织子叶胚达 tsy1z个 o
生根率达 xz1{| h ~显著地提高了成熟体细胞胚及其根的质量 ∀
关键词 } 华北落叶松 o体细胞胚 o麦芽糖 o下胚轴
中图分类号 }≥zuu1vn z 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusswlst p ssxu p sy
收稿日期 }ussv p sy p vs ∀
基金项目 }国家/ {yv0项目/树木体细胞胚胎发生及其产业化与育种实验技术平台0kusst„„uwwsutl和国家转基因与产业化专项/优质 !杂种
落叶松抗旱基因工程育种研究0kussu2…2ssxl资助 ∀
Εφφεχτσ οφ ΜαλτοσεoΝΑΑ ανδ ΑΒΑ ον Σοµατιχ Ματυρατιον ανδ
Ραδιχλε Ροοτινγ οφ Λαριξ πρινχιπισ2ρυππρεχητιι
±¬¬º¤±ª ‹¤± ≠¬©¤± ‹¤± ≥∏¼¬±ª • ¤±ª¬¤±«∏¤
k Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Φορεστρψo Χηινεσε Αχαδεµψοφ Φορεστρψ Βειϕινγtsss|tl
⁄¬¨·µ¬¦«∞º¤¯§
k Φεδεραλ Ρεσεαρχη Χεντρε φορ Φορεστρψo Ινστιτυτε φορ Φορεστρψ Τρεε Βρεεδινγ ανδ Βιοτεχηνολογψ Εβερσωαλδερ Χηαυσσεε y otxvzz ΩαλδσιεϖερσδορφoΓερµανψl
Αβστραχτ } Œ± ²µ§¨µ·²¬°³µ²√¨ ∏´¤¯¬·¼ ²©¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²¶¤±§µ²²·¬±ª©µ¨ ∏´¨±¦¼¬± Λαριξ πρινχιπισ2ρυππρεχητιι ou ow2§¬¦«¯²µ²³«¨2
±²¬¼ ¤¦¨·¬¦¤¦¬§ku ow2⁄l º¤¶µ¨³¯¤¦¨§¥¼ ±¤³«·«¤¯ ±¨¨ ¤¦¨·¬¦¤¦¬§k‘„„l oº«¬¦«¬°³µ²√¨ §·«¨ ∏´¤¯¬·¼²© ¤¨µ¯¼¶·¤ª¨ °¨¥µ¼²¶o¤±§
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³¯¤±·°¨ §¬∏° k • °l ¤¶ª¨µ°¬±¤·¬²± °¨ §¬∏°©²µ¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²¶o¦²±·¤¬±¬±ª³«¯²µ²ª¯∏¦¬±²¯ k°Šl y °ª#pt º¤¶·«¨ ¥¨¶·¦²±2
¦¨µ±¬±ª °¨¥µ¼² ª¨µ°¬±¤·¬²± ¤±§µ²²·¬±ªq
Κεψ ωορδσ} Λαριξ πρινχιπισ2ρυππρεχητιι o≥²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²¶o ¤¯·²¶¨ o‹¼³²¦²·¼¯
植物体细胞胚胎发生是细胞工程中植株再生及体外快速繁殖的重要途径 o研究植物无性系的细胞起源
调控和发育 o有利于阐明植物有性胚及无性胚的发生机理 o是研究植物细胞全能性 !分化及其形态建成的理
想实验体系 o也是进行遗传转化k∞¯ ¬¯¶ot||x ~¨√¨ ¨ ετ αλqot||zl获得全能性原生质体再生植株和快速繁殖
的重要手段 o且在今后树木的大量繁殖 !品种改良 !林木更新 !沙漠改造等方面均有很大现实意义和经济效
益 ∀针叶树的体细胞胚胎发生研究始于 us世纪 zs年代后期 o{s年代后期得到迅速发展 o获得很大进展 ~但
作为针叶树中最大的松属k Πινυσlk…¨ ¦º¤µετ αλqot||s ~Š∏³·¤ ετ αλqot|{z ~¤¬± ετ αλqot|{|l和落叶松属kΛαρ2
ιξl k∞º¤¯§ ετ αλqot||x ~齐力旺等 ousstl等主要造林 !用材树种的体细胞胚胎发生仍有很大困难 ∀众所周知 o
植物细胞胚胎发生的首要环节是获得胚性愈伤组织 o这与外植体的胚性感受态密切相关k黄路等 ot|||l ~然
而 o不同类型的胚性愈伤组织发生体细胞胚的能力差异很大 o„…„被认为是体细胞胚成熟的关键因子k„°2
°¬µ¤·²ot|zw ~Ž¤°¤§¤ ετ αλqot|{t ~•¤­¤¶¨®¤µ¤± ετ αλqot|{z ~黄学林等 ot||xl o其作用主要是促进体细胞胚成
熟 o防止裂生多胚现象 o并与畸形胚的发生相关 ∀此外 o¬等kt||{l还进行了麦芽糖与 °∞Š对火炬松k Πινυσ
ταεδαl体细胞胚成熟的研究 o取得较大进展 o对控制畸形胚的发生和体细胞胚正常生根均有显著影响 ∀相对
而言 o落叶松的体细胞胚胎发生相对较难 o再生更属不易 o其中除了胚性愈伤组织的诱导 !筛选体细胞胚成熟
培养基外 o究其主要根源是胚状体根系发育不良 o这也是众多针叶树体细胞胚发生及微体快繁中极为棘手的
问题 ∀随着基因工程育种研究工作的日臻完善 o通过体细胞胚胎发生途径进行目的基因的遗传转化 o已经成
为介导针叶树种基因转化可行的主导体系 ∀为此 o调控体细胞胚成熟 !完善体细胞胚生根体系 o提高针叶树
体细胞胚的成苗率 o成为很多学者研究的关键技术之一 ∀本文在进行华北落叶松k Λαριξ πρινχιπισ2ρυππρεχητιιl
胚性愈伤组织诱导 !体细胞胚成熟 !基因转化研究的同时 o针对华北落叶松发生体细胞胚后成苗率不高 !难以
产生健康完整植株的重要问题 o研究了影响华北落叶松体细胞胚成熟及生根的关键因子 ∀
t 材料与方法
111 实验材料
于 y月中 !下旬 o采取优良单株华北落叶松未成熟球果子叶前合子胚作为外植体 ∀取出种子 ozs h酒精
浸泡 t °¬± !s1t h升汞溶液消毒 y °¬±o无菌水冲洗 x次 ~取出种仁 o将嫩胚连同长长的胚柄一起接种于诱导培
养基上 o每皿接种 ux个 ov次重复 ∀材料在 uv ∗ ux ε 条件下暗培养 otx ∗ ux §时根据诱导愈伤组织颜色 !形
态 !结构等特征以及显微观察结果区分出白色半透明的胚性愈伤组织 ot{ ∗ ux §继代一次 o继代培养用 ≥ n …
k‹v…’v 由 ≥培养基的 v1t °ª#pt增加至 z1zx °ª#ptl培养基 o附加 u ow p ⁄!…„ !Ž×依次减少为原来的 tΠu !
tΠx !tΠts ∀继代时收集组织块表面分化的新鲜愈伤组织 o选用一个胚性细胞系作为实验研究材料 ∀
112 培养基
t1u1t 诱导培养基 基本培养基为 ≥k∞º¤¯§ ετ αλqot||xl ~诱导培养基为 ≥基本培养基上附加 u ow p ⁄ s ∗
u1u °ª#pt o…„ !Ž×各 s ∗ s1{ °ª#pt o诱导胚性愈伤组织 ∀
表 1 附加麦芽糖 !ΠΕΓ4000 与蔗糖的体细胞胚成熟培养基
Ταβ . 1 Ματυρατιον µεδιυµ οφ σοµατιχ εµ βρψοσ χονταινινγ
ΠΕΓ4000 , µ αλτοσε ανδ συχροσε
培养基
 §¨¬∏° ‘²q
„…„Π
k°ª#ptl
麦芽糖
¤¯·²¶¨Πh
°∞Šwsss
Πh
活性炭 „¦·¬√¤·¨§
¦«¤µ¦²¤¯Πkª#ptl
蔗糖
≥∏¦µ²¶¨Πh
„°t ty w v t v
„°u ty s y t v
„°v ty u x t t
„°w ty v w t s
„°x ty w v t s
„°y ty y s t s
t1u1u 增殖培养基 ktl ≥ n … n u ow p ⁄ s1tt
°ª#pt n …„ s1sw °ª#pt n Ž× s1su °ª#ptk简
称 ⁄l ~kul ≥ n … n ‘„„ s1x °ª#pt n …„ s1sw
°ª#pt n Ž× s1sw °ª#ptk简称 ‘l ~附加肌醇
ts ª#pt !酪氨酸 xss °ª#pt !水解酪蛋白k≤‹l
xss °ª#pt !谷氨酰胺 wxs °ª#pt !蔗糖 v h !琼
脂粉k≥¬ª°¤公司ls1v h o³‹ x1z ∀
t1u1v 体细胞胚成熟培养基 用 ≥ n …分别加
„…„ ts !ty !us !uz1v !vu !ws °ª# pt o均加入
°∞Šwsss z1x h !„ª‘’v x °ª#pt !≤‹xss °ª#
pt !谷氨酰胺 wxs °ª#pt !肌醇 tª#pt !蔗糖
u1x h !琼脂粉 s1v h o³‹ x1z o温度 uv ∗ ux ε o暗
培养 ∀
t1u1w 麦芽糖 !°∞Š培养基 ≥ n …n表 t设计 ∀
t1u1x 体细胞胚萌发培养基 kvl无激素的 • ° 培养基 ~kwl • ° n ‹v…’v ts °ª#pt n ∂…t v °ª#pt n活性
碳k„≤l s1y ª#pt nŒ…„ t °ª#pt n ‘„„ s1y °ª#pt ~kxl • ° n间苯三酚k°Šl x °ª#pt ~kyl无激素的 ≥ n …
培养基 ~kzl≥ n …n ‹v…’v ts °ª#pt n ∂…t v °ª#pt n „≤ s1y ª#pt n Œ…„ t °ª#pt n ‘„„ s1y °ª#pt ~k{l≥
n …n °Š x °ª#pt ~附加蔗糖 u1x h !琼脂粉 s1v h o³‹ x1z o光照强度 t yss ¬¯o温度 ux ε ∀
113 培养方法
将诱导培养基上产生的胚性愈伤组织分别转入含 s1tt °ª#pt u ow p ⁄的 ⁄培养基和含 s1x °ª#pt‘„„
的 ‘培养基上继代增殖 o继代 u次后进行显微观察 !照相 o以观察早期原胚发育状况 ∀
vx 第 t期 齐力旺等 }麦芽糖 !‘„„及 „…„对华北落叶松体细胞胚成熟及生根的影响
选取 ⁄和 ‘培养基上培养 ws §左右的华北落叶松胚性愈伤组织 o分别转入含不同浓度的 „…„的成熟
培养基上 o每培养皿接种 t1s ¦° ≅ t1s ¦° ≅ t1s ¦°的愈伤组织 x块 ox{ §后分别统计并计算体细胞胚的成熟
频率 }成熟频率 €落叶松子叶胚数k个lΠ新鲜愈伤组织kªl ∀
将上述成熟培养基上产生的成熟体细胞胚 o转入萌发培养基kvl !kwl !kxl !kyl !kzl !k{l上萌发培养 o再
生完整植株 o统计生根率 }生根率 €生根数Π接种体细胞胚数 ∀
另外 o选择 ⁄!‘培养基上增殖 ws §的华北落叶松胚性愈伤组织 o分别转接于含有不同浓度的麦芽糖和
°∞Šwsss的培养基上 ox{ §后 o统计子叶胚成熟频率 ∀
u 实验结果
211 华北落叶松胚性愈伤组织的诱导
华北落叶松未成熟胚接种在诱导培养基上培养 z §后 o外植体膨大 o颜色变化明显 ots ∗ tx §即有不同
类型的愈伤组织产生 }一种是顶部先膨大 o随后从基部产生白色略黄 !透明的丝状愈伤组织 o为胚性愈伤组
织 o细胞质很浓 o呈黑色 o先横向分裂出胚头 o再纵向分裂出胚柄 ~另一种是顶部膨大产生的浅黄白色 !结构稍
松 !质地软 !颗粒状愈伤组织 o为非胚性愈伤组织 ~ts ∗ tx §左右 o可见从膨大的胚乳处有细丝结构 !透明晶亮
的愈伤组织产生并不断增殖 o在解剖镜下 o可观察到细长结构 !带有胚柄的细胞团 o并明显可见许多早期原
胚 o称为胚性胚柄复合物 o该愈伤组织经显微镜检为二倍体 o表明是从胚发育而来k齐力旺等 ousstl ∀
212 ‘„„替代 2 ,4 − ⁄后对华北落叶松胚性愈伤组织的影响
将诱导培养基上产生的胚性愈伤组织 o分别转入含有 u ow p ⁄的 ⁄培养基和含 ‘„„的 ‘培养基上继代 !
增殖 o进行早期原胚的诱导发育培养 ∀研究发现 }在 ⁄培养基上 o胚性愈伤组织生长速度较快 o白色 !浅棕色
愈伤组织均具有粘性 o愈伤组织的表面 o仍有一些丝状结构 o经二次继代后在显微镜下可观察到很多的多细
胞早期原胚及一些正在发育中的后期原胚 o但有一部分早期原胚发育不太好 o胚头小k图版 ´ p tl ~在 ‘培
养基上的胚性愈伤组织 o生长速度比 ⁄培养基上稍慢 o白色至浅黄色 o粘软结构 ows §后显微镜下可观察到
早期原胚 o早期原胚的发育比 ⁄培养基上稍好 o胚头较大k图版 ´ p ul o且大小较均一 o表明 s1x °ª#pt的
‘„„配合 s1sw °ª#pt …„和 s1su °ª#pt Ž×的组合 o比 s1tt °ª#pt u ow p ⁄配合 s1sw °ª#pt…„和 s1su °ª
#ptŽ×组合的培养基 o更有利于华北落叶松早期原胚的发育 ∀发育良好的早期原胚 o在成熟培养基条件合
适的情况下 o更有可能提高成熟频率和转植株率 ∀
表 2 来源于 ∆与 Ν培养基每克愈伤组织在含有不同 ΑΒΑ
浓度成熟培养基上的体细胞胚发生数量
Ταβ . 2 Νυµ βερ οφ µ ατυρε σοµατιχ εµ βρψοσ περ γραµ εµ βρψογενιχ
τισσυε φροµ µεδιυµ ∆ ανδ Ν ον µατυρατιον µεδιυµ
χονταινινγ διφφερεντ χονχεντρατιον οφ ΑΒΑ
培养基
 §¨¬∏°
„…„Πk°ª#ptl
ts ty us uz1v vu ws
⁄ vw1x tws1u yv1u |w1v xw yx1x
‘ ww1{ tsx1z zv1y yx1x xu1{ w|1w
213 „…„对华北落叶松体细胞胚形态建成的影响
将 u1t中经 ⁄和 ‘培养基上培养 ws §后 o带有
早期原胚的愈伤组织分别转入含有不同浓度 „…„
的成熟培养基上 ∀经 us §培养 o愈伤组织逐渐由半
透明的白色变为浅黄色 o表面变得较为致密 !稍颗粒
状 ~vs §后 o在愈伤组织的表面出现一些浅黄色 !光
滑突起k图版 ´ p vl ∀随着进一步发育培养 o这些突
起纵向伸长 !呈圆柱状 ~wx §左右 o这些圆柱状物已
明显发育成一顶端有子叶的幼小体细胞胚 ∀x{ §后
观察体细胞胚发生数量k表 ul ∀
由表 u可见 o来源于 ⁄!‘培养基上的愈伤组
织 o都是在 „…„ ty °ª#pt的成熟培养基上体细胞胚产生数量最多 o„…„ us °ª#pt的培养基上次之 o在 „…„
为 ts °ª#pt的成熟培养基上产生数量最少 ~来源于 ‘培养基上的愈伤组织在成熟培养基上 o其体细胞胚产
生数量 o当 „…„浓度大于 us °ª#pt时 o随着 „…„浓度的增加 o体细胞胚数量减少 ∀相对而言 o来源于 ⁄培
养基上的体细胞胚发生数量比来源于 ‘培养基上的为多 o体细胞胚发生时间较早 o少数在培养 vu §后就可
见体细胞胚发生 o子叶很快展开 o但不正常体细胞胚较多 o大小不匀 o下胚轴短 !肿大 o子叶卷曲 !有玻璃化现
象k图版 ´ p xl o多重胚明显较多 o有一部分胚停止在圆球状而不再进一步形成子叶 ~而来源于 ‘培养基上
的愈伤组织 o虽然在体细胞胚发生数量上少于 ⁄培养基 o但体细胞胚质量明显好于 ⁄培养基上产生的体细
wx 林 业 科 学 ws卷
胞胚 o体细胞胚大小较均一 o正常胚明显较多 ∀表明在只含 ‘„„不含 u ow p ⁄的培养基上继代 o可以明显提
高成熟胚的质量 o对于成熟胚萌发根 !再生完整植株很有利 ∀
挑取上述成熟培养基中产生的子叶胚k图版 ´ p v l o转入体细胞胚萌发培养基中 ∀约 x §左右 o体细胞
胚膨大 o子叶由黄开始转绿 ~ts §左右 o子叶转为翠绿色 o逐渐张开 o下胚轴伸长k图版 ´ p wl o并在基部产生
微小的红色根尖 ~半个月左右 o嫩白根伸长 o一个月左右根系伸长 s1x ∗ t ¦°左右 ∀在萌发培养基上生根数
量见表 v ∀
表 3 不同来源 !不同培养基上华北落叶松体细胞胚的生根率与下胚轴伸长数 ≠
Ταβ . 3 Τηε ροοτινγ φρεθυενχψ ανδ ηψποχοτψλ ελονγατιον οφ σοµατιχ εµ βρψοσ ον διφφερεντ µεδιυµ
φροµ µεδιυµ ∆ ανδ Ν οφ Λ . πρινχιπισ2ρυππρεχητιι
培养基
 §¨¬∏° ‘²q
接种体细胞胚数
‘∏°¥¨µ²©¬±²¦∏¯¤·¨§
°¨¥µ¼²¶
下胚轴伸长的胚数
‘∏°¥¨µ²© °¨¥µ¼²¶º¬·«
«¼³²¦²·¼¯ ¨¯²±ª¤·¬²±
生根的胚数
‘∏°¥¨µ²©µ²²·¬±ª
°¨¥µ¼²¶
体细胞胚生根率
• ²²·¬±ª©µ¨ ∏´¨ ±¦¼Πh
⁄ ‘ ⁄ ‘ ⁄ ‘ ⁄ ‘
kvl xs ys tt wv | uw t{ ws
kwl xs vu uu us ty tw vu wv1zx
kxl vv wv tw u{ tt uv vv1vv xv1w|
kyl v| wu z uv x tu tu1{u u{1xz
kzl xt w{ tz us tv ty ux1w| vv1vv
k{l wx vy us ut tw tx vt1tt wt1yz
≠ kvl • °k±² «²µ°²±¨ l ~kwl • ° n ‹v…’v ts °ª#pt n ∂…t v °ª#pt n „≤ s1y ª#pt n Œ…„ t °ª#pt n ‘„„ s1y °ª#pt ~kxl • ° n °Š x °ª#pt ~
kyl≥ n …k±² «²µ°²±¨ l ~kzl≥ n …n ‹v…’vts °ª#pt n ∂…tv °ª#pt n „≤ s1y ª#pt n Œ…„ t °ª#pt n ‘„„ s1y °ª#pt ~k{l≥ n …n °Š x °ª#pt q
表 v表明 o来源于 ⁄培养基和 ‘培养基上的愈伤组织 o产生的体细胞胚生根率 o二者都是在 • ° n间苯
三酚 x °ª#pt的培养基上最好 o分别为 vv1vv h和 xv1w| h ~在 • ° n ‹v …’v ts °ª#pt n ∂…t v °ª#pt n „≤
s1y °ª#pt n Œ…„ t °ª#pt n ‘„„ s1y °ª#pt的培养基上次之 o最差的为无激素 ≥ n …培养基 o生根率为
u{1xz h ~≥ n …n间苯三酚 x °ª#pt比 ≥ n …培养基上 o生根率明显高 o说明间苯三酚对华北落叶松成熟胚的
下胚轴伸长 !根发生及再生完整植株有明显的促进作用 ∀同时 o一定浓度的 ‹v…’v !活性碳k„≤l !Œ…„及 ‘„„
的综合作用对华北落叶松成熟胚根发生及发育有促进作用 ∀另外 o同一萌发培养基上 o来源于 ‘培养基上
体细胞胚的生根率也明显高于 ⁄培养基上产生的体细胞胚 o在培养基kxl上 o来源于 ‘培养基上的体细胞胚
生根率为 xv1w| h o而来源于 ⁄培养基上的为 vv1vv h ∀在培养基kyl上 o来源于 ‘培养基上的体细胞胚的生
根率为 u{1xz h o而来源于 ⁄培养基上的为 tu1{u h ∀同时 o来源于 ‘培养基上的体细胞胚 o在再生植株的质
量上优于来源于 ⁄培养基上的体细胞胚 o经 ⁄培养基上培养后 o产生的一部分植株子叶肥厚 !有玻璃化现
象 o成为限制华北落叶松体细胞胚应用的关键因子 o表明 u ow p ⁄诱导时间过久会使体细胞胚顶端分生组织
发育不良k黄学林等 ot||xl ∀
214 麦芽糖对华北落叶松体细胞胚成熟及生根的影响
将 ‘!⁄培养基上培养 ws §的愈伤组织 o转入含有不同浓度的麦芽糖和 °∞Šwsss的成熟培养基上 o经过
w ∗ z周培养 o在愈伤组织表面 o陆续形成体细胞胚 o不同培养基上的体细胞胚成熟频率见表 w ∀
由表 w可见 o在 „…„浓度适宜的情况下 o来源于 ⁄和 ‘培养基上的愈伤组织 o二者都是在 v h麦芽糖配
合 w h °∞Šwsss !蔗糖为 s时 o体细胞胚成熟频率最高 o分别为每克愈伤组织 {u1z个子叶胚与 tsy1z个子叶
胚 ∀体细胞胚成熟培养基中 o用麦芽糖代替蔗糖 o即麦芽糖和 °∞Šwsss组合要比以前常用的蔗糖和 °∞Šwsss
组合好 o不但明显提高了体细胞胚成熟频率 o而且使体细胞胚发生时间提前一周 ~同时体细胞胚质量明显改
善 o体细胞胚比在蔗糖中体积小 o大小均一 o多重胚很少 o且大多数体细胞胚的下胚轴较长 o没有膨大 o子叶不
提前展开 o状似/子弹形0的长型体细胞胚多 ~比较而言 o在蔗糖和 °∞Šwsss组合的培养基上产生的体细胞
胚 o下胚轴较短的短胚较多 o这关系到体细胞胚的根发生 ~另外一些异常胚 o下胚轴膨大 !基部产生愈伤组织
或子叶卷曲的现象明显多 ∀
xx 第 t期 齐力旺等 }麦芽糖 !‘„„及 „…„对华北落叶松体细胞胚成熟及生根的影响
表 4 麦芽糖对来源于 ∆ 与 Ν培养基上愈伤组织体细胞胚发生及生根率的影响
Ταβ . 4 Εφφεχτ οφ µ αλτοσε ον τηε νυµ βερ ανδ ροοτινγ οφ εµ βρψοσ οφ Λ . πρινχιπισ2ρυππρεχητιι ον µεδιυµ ∆ ανδ Ν
培养基
 §¨¬∏° ‘²q
每克愈伤组织子叶胚
发生数量 ‘∏°¥¨µ²©
°¨¥µ¼²¶³¨µªµ¤° ¦¤¯ ¬¯
接种体细胞胚数
‘∏°¥¨µ²©¬±²¦∏¯¤·¨§ °¨¥µ¼²¶
生根的体细胞胚数
‘∏°¥¨µ²©µ²²·¬±ª °¨¥µ¼²¶
体细胞胚生根率
• ²²·¬±ª©µ¨ ∏´¨ ±¦¼Πh
⁄ ‘ ⁄ ‘ ⁄ ‘ ⁄ ‘
„°t y|1| xv1v ut tz y | u{1xz xu1|w
„°u ww1u vt1u tx ts x x vv1vv xs1ss
„°v zt1z vt1u uu tt | x ws1|t wx1wx
„°w {u1z tsy1z uz t| tu tt ww1ww xz1{|
„°x w|1y vv1t ty tu z y wv1zx xs1ss
„°y yy1u ys1y ut vv { t{ v{1ts xw1xx
将上述 „°¯ ∗ „°y培养基上产生的成熟胚 o接于无激素的 • ° 萌发培养基上 o其体细胞胚生根数量如
表 w o表明来源于 ⁄!‘培养基上的愈伤组织 o二者都是在 v h麦芽糖和 w h °∞Šwsss的培养基上产生的体细
胞胚生根率高 o分别为 ww1ww h和 xz1{| h o且下胚轴健壮 !根粗壮k图版 ´ p yl !子叶舒展 ~其次为麦芽糖
y h !°∞Šwsss和蔗糖均为 s的培养基 ∀另外 o麦芽糖 w h !°∞Šwsss v h !蔗糖 v h的组合 o根发生也较好 ∀实
验表明 o麦芽糖 v h配合 °∞Šwsss w h !无蔗糖时 o能显著提高华北落叶松体细胞胚的成熟频率和根发生频
率 o且产生的体细胞胚质量较高 ∀
v 讨论
¨√¨ k¨t||zl用杂种落叶松kΛαριξ ≅ λεπτοευροπαεαl未成熟合子胚诱导体细胞胚发生 o在早期子叶期观察到
xx h的体细胞胚发生 o在含有 „…„和糖的 tu种培养基上 o能够提高体胚成熟的质量 o只有 us !ws和 ys Λ°²¯
„…„ ot Λ°²¯ Œ…„以及 s1t或 s1u °²¯ 蔗糖的培养基上可以进行其发育 o每克鲜重的胚性培养物诱导体细胞
胚数量受胚性细胞系 !蔗糖浓度和 „…„浓度影响 ∀研究表明 }华北落叶松体细胞胚成熟频率和根发生频率
的高低 o受很多因子影响 o并不仅仅只与成熟培养基的成分及诱导条件有关 ∀初期胚性愈伤组织的诱导 !增
殖 !继代培养基中 o生长素的种类及浓度对体细胞胚成熟频率和根发生频率有重要的影响 o胚性愈伤组织在
不含 u ow p ⁄只含低浓度 ‘„„ks1x °ª#ptl !配合低浓度的 …„ks1sw °ª#ptl和 Ž×ks1sw °ª#ptl的培养基上
继代培养 o对于提高体细胞胚发生频率 !提高根发生频率是十分有益的 ∀u ow p ⁄作为华北落叶松胚性愈伤
组织初始诱导是必需的 o但长期在含有高浓度 u ow p ⁄的培养基上继代 o会导致体细胞胚成熟能力的丧失
kפ∏·²µ∏¶ ετ αλqot||tl ∀导致体细胞胚质量下降的原因 o可能是 u ow p ⁄影响了体细胞胚内储藏蛋白质的积
累 ∀继代过程中用 ‘„„代替 u ow p ⁄明显提高了成熟胚的质量 o提高了生根比率和转植株率 o减少了多重
胚 !畸形胚比例 o在以前有关落叶松体细胞胚胎发生的研究中未见报道 ∀
成熟胚转入萌发培养基后 o下胚轴能否正常伸长 !根系能否发生并健壮伸长生长 o不仅与初期诱导 !继
代 !成熟培养基的成分以及培养条件有关 o而且与萌发培养基中的基本培养基种类与激素及附加物有关 ∀以
往有关体细胞胚萌发的报道 o萌发培养基多数用与诱导培养基相同的基本培养基 o且不附加任何激素 o本次
试验表明 o华北落叶松体细胞胚萌发培养基用 • ° 基本培养基比 ≥或 ≥ n …好 o且培养基中附加低浓度的
Œ…„ !‘„„ !硼酸和间苯三酚明显促进根的发生 ∀由于体细胞胚在发育上的不同步性 o导致在萌发培养基上的
成熟胚所处的根发生阶段不同 o甚至有些体细胞胚无根原基 o这样低浓度的生长素和硼酸配合 o对体细胞胚
根的发生很有利 ∀另外 o培养基中加入间苯三酚 o明显促进体细胞胚生根 o这与本试验中华北落叶松组培无
根苗生根的结论是一致的 ∀
蔗糖 !°∞Š作为碳源和渗透调节剂 o能促进植物体细胞胚成熟 o在云南松k Πινυσ ψυννανενσισl !青 k Πιχεα
ωιλσονιιl !白 k Πιχεα µεψεριlk杨金玲等 ot||zl中被应用 o本次试验中以 y h的 °∞Šwsss和 v h的蔗糖获得了较
好的成熟频率 ∀同时 o有一部分成熟的华北落叶松体细胞胚 o下胚轴短且膨大 o根发生不好k图版 ´ p z o下l ∀
在 „…„适宜浓度的情况下 o培养基中合适的碳源和渗透压常常是影响体细胞胚成熟频率的重要因素之
yx 林 业 科 学 ws卷
一 o针对以上问题 o用麦芽糖代替蔗糖 o实验表明 ov h麦芽糖和 w h的 °∞Šwsss的组合 o体细胞胚成熟频率
高 o转植株率最高达 xz1{| h o且更重要的一点是体细胞胚质量大大优于蔗糖和 °∞Šwsss组合 o用麦芽糖诱
导的体细胞胚 o下胚轴较长 !健壮无膨大 !根系粗壮 !无玻璃化现象k图版 ´ p z o上l o体细胞胚大小均一 o很少
有多重胚发生 o子叶舒展 o无提前展开现象 ∀在 y h的麦芽糖 !无蔗糖与 °∞Š的培养基上 o胚成熟频率 !体细
胞胚质量稍次于 v h 麦芽糖和 w h °∞Šwsss 组合的培养基 ~华北落叶松体细胞胚成熟培养基 o以 w h 的
°∞Šwsss作为渗透剂 !v h的麦芽糖作为碳源代替蔗糖更能有效地提高其体细胞胚成熟频率和生根转植株
率 o¬等kt||{l在火炬松k Πινυσταεδαl体细胞胚发生的研究中曾有类似的结果 ∀
参 考 文 献
黄 路 o卫志明 q不同基因型玉米的再生能力和胚性与非胚性愈伤组织 ⁄‘„的差异 q植物生理学报 ot||| ouxkwl }vvu p vv{
黄学林 o李筱菊 q高等植物组织离体培养的形态建成及其调控 q北京 }科学出版社 ot||x }txs p usx
齐力旺 o韩一凡 o李 玲等 q应用 vtt2„最优回归设计研究 „…„ !°∞Šwsss及 „ª‘’v 对落叶松体细胞胚发生数量的影响 q生物工程学报 ousst otz
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杨金玲 o桂耀林 o杨映根等 q白 体细胞胚胎发生及其植株再生 q植物学报 ot||z ov|kwl }vtx p vut
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5大岗山森林生态系统研究6
王兵k中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所l等著
中国科学技术出版社出版
本书是中国森林生态系统定位研究网络k≤ƒ∞• ‘l系统丛书之一 ∀本书结合世界与我国森林生态系统定
位研究 o详细介绍了大岗山森林生态系统研究 !开发对策及/新林业理论0等内容及相关进展 ∀内容包括 }森
林植物资源和保护 ~群落演替评判 ~典型林地能量平衡与光合作用对比研究 ~养分循环与水量平衡以及大岗
山森林生态系统管理等 ∀
本书内容丰富 o观点新颖 o资料翔实 o可供林区建设与开发人员 o林学 !生态 !环境保护等领域的科研 !管
理人员以及大专院校的师生参考 ∀
zx 第 t期 齐力旺等 }麦芽糖 !‘„„及 „…„对华北落叶松体细胞胚成熟及生根的影响