全 文 ：第 ww卷 第 v期
u s s {年 v 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1ww o‘²1v
¤µqou s s {
桑树景天庚酮糖 p t oz p二磷酸酶基因的克隆 !
原核表达与植物表达载体的构建 3
冀宪领t 盖英萍u 马建平t 牟志美t
kt1 山东农业大学林学院 泰安 uztst{ ~ u1 山东农业大学生命科学学院 泰安 uztst{l
摘 要 } 景天庚酮糖 p t oz p 二磷酸酶k≥…°¤¶¨l是卡尔文循环过程中的关键酶 ∀利用 • „≤∞技术得到景天庚酮
糖 p t oz p二磷酸酶基因全长 ¦⁄‘„ o命名为 ΜΣΒΠασε kŠ¨ ±…¤±®登录号 }⁄±||xvwyl ∀ ΜΣΒΠασε 全长为 t xuz ¥³o该序
列含有 t个 t tz| ¥³的完整开放读码框 o编码 v|v个氨基酸 o蛋白质理论分子质量约为 wu1y ®∏o等电点为 x1{x o其氨
基酸序列与其他植物中已分离的 ≥…°¤¶¨ 有很高的同源性 ∀对 ΜΣΒΠασε编码的蛋白质k命名为 ≥…°¤¶¨l进行结构预
测分析表明 o该蛋白富含无规卷曲k¦²¬¯l o高达 yw1u| h o其次是 Αp螺旋k«¨ ¬¯¬l o为 uu1t| h o而 Βp折叠k¶·µ¤±§l只有
tv1xu h ∀将 ΜΣΒΠασε编码区插入原核表达载体 ³∞×vs¤ k n l o并转化到大肠杆菌菌株 …ut中 o经过 Œ°×Š诱导 o
≥…°¤¶¨ 融合蛋白在 …ut 菌株中成功表达 ∀将得到的 ΜΣΒΠασε 编码区插入植物表达载体 ³…Œtut 中 o构建了
ΜΣΒΠασε植物表达载体 ³…Œtut2≥…°∀
关键词 } 桑树 ~基因克隆 ~原核表达 ~植物表达载体 ~景天庚酮糖 p t oz p二磷酸酶
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u ~≥{{{1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lsv p ssyu p s{
收稿日期 }ussz p su p uz ∀
基金项目 }ussu年山东省农业良种产业化开发资助项目kussuuu{l ∀
3 牟志美为通讯作者 ∀
Χλονινγ ανδ Προκαρψοτιχ Εξπρεσσιον οφ τηε Σεδοηεπτυλοσε21 ,72Βισπηοσπηατασε χ∆ΝΑ
φροµ Μυλβερρψ ανδ Χονστρυχτιον οφ Πλαντ Εξπρεσσιον ςεχτορ
¬÷¬¤±¯¬±ªt Š¤¬≠¬±ª³¬±ªu ¤¬¤±³¬±ªt ∏«¬°¨ ¬t
kt1 Χολλεγε οφ Φορεστρψo Σηανδονγ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ται. αν uztst{ ~ u1 Χολλεγε οφ Λιφε Σχιενχε o
Σηανδονγ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ται. αν uztst{l
Αβστραχτ} ≥¨ §²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ k≥…°¤¶¨l ¬¶¤ ®¨ ¼ ±¨½¼°¨ ¬±·«¨ µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬√¨ ³«¤¶¨ ²© ≤¤¯√¬± ¦¼¦¯¨ q „ ©∏¯¯ 2
¯¨ ±ª·«¦⁄‘„ ±¨¦²§¬±ª≥…°¤¶¨ k§¨¶¬ª±¤·¨§¤¶ ΜΣΒΠασε oŠ¨ ±…¤±®¤¦¦¨¶¶¬²± ‘²q⁄±||xvwyl º¤¶¦¯²±¨ §©µ²° °∏¯¥¨µµ¼k Μορυσ
αλβα √¤µq µυλτιχαυλισl ¥¼ µ¤³¬§¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²©¦⁄‘„ ±¨§¶k• „≤∞l q׫¨ ¦⁄‘„ º¤¶t xuz ¥³¦²±·¤¬±¬±ª¤t tz| ¥³²³¨ ±
µ¨¤§¬±ª©µ¤°¨ º«¬¦«º¤¶§¨§∏¦¨§©²µ ±¨¦²§¬±ª¤ ³¨ ³·¬§¨ ²©v|v ¤°¬±²¤¦¬§¶º«²¶¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ°¤¶¶º¤¶¬±©¨µµ¨§·² ¥¨ wu1y ®∏
º¬·«¬·¶¬¶²¨ ¯¨ ¦·µ¬¦³²¬±·¤·x1{x1 ≥¨ ∏´¨ ±¦¨ ¦²°³¤µ¬¶²±¤±¤¯¼¶¬¶¶«²º¨ §·«¤··«¨ ¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ©µ²° °∏¯¥¨µµ¼
k≥…°¤¶¨l «¤§«¬ª««²°²¯²ª¼·²≥…°¤¶¨¶©µ²° ²·«¨µ³¯¤±·¶qŒ·º¤¶³µ²¶³¨¦·¨§·«¤··«¨ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ²© ≥…°¤¶¨ º¤¶µ¬¦«¬± ¦²¬¯¶
¤±§«¨ ¬¯¬¨¶o¤±§º¤¶³²²µ¬±¶·µ¤±§¶q׫¨ ¦²§¬±ªµ¨ª¬²±²©·«¨ ΜΣΒΠασε º¤¶¬±¶¨µ·¨§¬±·²¤± ¬¨³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µo³∞×vs¤k n l o
¤±§·µ¤±¶©²µ°¨ §¬±·² Εσχηεριχηια χολι …u¯ q ׫¨ ©∏¶¬²± ³µ²·¨¬± º¤¶¶∏¦¦¨¶¶©∏¯¯ ¼ ¬¨³µ¨¶¶¨§ º¬·«Œ°×Š ¬±§∏¦·¬²±q ׫¨ ³¯¤±·
¬¨³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µº¬·«·«¬¶©µ¤ª°¨ ±·∏±§¨µ·«¨ ¦²±·µ²¯ ²©vx≥ ³µ²°²·¨µº¤¶¦²±¶·µ∏¦·¨§q׫¨ ª¨ ±¨ ¦¯²±¨ §¬±·«¬¶¶·∏§¼ °¤¼ ¥¨ ¤±
¤¶¶¨·¬±·«¨ °∏¯¥¨µµ¼ ª¨ ±¨ ±¨ª¬±¨ µ¨¬±ª¤±§·«¨ µ¨¶∏¯·¶°¤¼ ¥¨ «¨ ³¯©∏¯ ·²©∏µ·«¨µ¶·∏§¼·«¨ µ¨ª∏¯¤·¬²± ²©≥…°¤¶¨ q
Κεψ ωορδσ} ∏¯¥¨µµ¼ k Μορυσ αλβα √¤µq µυλτιχαυλισl ~ ª¨ ±¨ ¦¯²±¬±ª~ ³µ²®¤µ¼²·¬¦ ¬¨³µ¨¶¶¬²±~ ³¯¤±· ¬¨³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µ~
¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨
增加绿色植物光合同化 ≤’u 的能力 o对提高农作物产量和缓解大气环境中 ≤’u 浓度日益升高的威胁有
重要意义 ∀因此 o提高光合效率一直是植物学 !农业 !林业等领域的学者和生产者努力的一个方向k马为民
等 oussvl ∀景天庚酮糖 p t oz p二磷酸酶k≥…°¤¶¨l是卡尔文循环过程中的关键酶 o它不可逆地催化景天庚酮
糖 p t oz p二磷酸去磷酸化 o生成景天庚酮糖 p z p磷酸 o景天庚酮糖 p z p磷酸经过一系列酶促反应转变为
≤’u的受体核酮糖 p t ox p二磷酸k•∏¥¬¶¦²lk„±­¤ ετ αλqoussul ∀≥…°¤¶¨ 活性轻微受抑制 o就会导致卡尔文循
环更新能力的减弱 !光合活性的下降 ∀因此 o≥…°¤¶¨ 是植物光合作用途径的主要限速酶之一 ∀ ¬¼¤ª¤º¤等
kusstl报道 o把聚球藻k Σψνεχηοχοχχυσ ¶³q °≤≤z|wul中的 ƒ…°Π≥…°¤¶¨ 基因转入烟草k Νιχοτιανα ταβαχυµ ¦√ q
÷¤±·«¬l 叶绿体中 o在大气中 ≤’u 浓度为 vys Λ°²¯#°²¯ p t条件下 o光合效率和 • ∏¥¬¶¦²活性升高 o明显提高了
转基因烟草光合固定 ≤’u 的效率和糖类的累积 o同时也加速了其生长 ∀该研究首次表明了改变一个酶就能
显著地提高植物的光合作用 ∀ פ°²¬等kussyl也证明把 ≥…°¤¶¨ 基因转入烟草 o转基因植株的生长速度 !生长
量和光合能力明显高于野生植株 ∀因此 o≥…°¤¶¨ 是一个可以利用基因工程提高光合同化 ≤’u 效率的酶 ∀
桑树k Μορυσl是一种重要的多年生经济林木 o桑叶是桑蚕k Βοµβψξ µοριl的主要食物来源 o桑叶的产量和
质量直接影响蚕茧的产量和质量k¤¬± ετ αλqousssl ∀依靠常规的育种方法和栽培措施的改善 o已很难使桑叶
的产量和质量明显地提高 o利用基因工程技术改良桑树品质是当今桑树育种的新方向k潘一乐 ousssl ∀目前
有关桑树 ≥…°¤¶¨ 基因的克隆还未见报道 ∀本研究以湖桑 vu号桑树k Μορυσ αλβα √¤µq µυλτιχαυλισl的叶片为材
料 o利用同源克隆方法和 • „≤∞技术成功克隆出 ≥…°¤¶¨ 基因全长 ¦⁄‘„ o命名为 ΜΣΒΠασε 并进行了序列分
析 o成功地在大肠杆菌中表达了该蛋白 ~同时构建了 ≥…°¤¶¨ 基因植物表达载体 o为利用基因工程提高桑叶
的产量和质量提供了有效的候选基因 o为深入研究其分子调控机制奠定了基础 ∀
t 材料与方法
111 材料
叶片取自湖桑 vu号健康枝条梢部 w ∗ y位叶片 o液氮速冻后 p {s ε 保存备用 ∀质粒载体 ³⁄t{2× √¨ ¦·²µ
¶¼¶·¨° !פ´ ⁄‘„ 聚合酶 !§‘×° !§≤×°和 ⁄‘„凝胶回收试剂盒 !⁄‘„ ƒµ¤ª°¨ ±·°∏µ¬©¬¦·¬²± Ž¬·∂ µ¨qu1s !反转录酶
2∂ !末端脱氧核糖核酸转移酶kק×l !÷2ª¤¯ 和 Œ°×Š均购自大连宝生物工程有限公司 ∀所有引物k表 tl均
由上海生物工程公司合成 o大肠杆菌k Εσχηεριχηια χολιl菌株 ⁄‹xΑ!…ut o原核表达载体 ³∞×vs¤k n l及植物表
达载体 ³…Œtut由山东农业大学作物生物学国家重点实验室提供 ∀
表 1 χ∆ΝΑ克隆所用引物序列
Ταβ .1 Τηε πριµερσ υσεδ ιν τηε χ∆ΝΑ χλονινγ
引物名称
°µ¬°¨ µ±¤°¨
核苷酸序列
‘∏¦¯ ²¨·¬§¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶
×tx Š„≤×≤ׄŠ„≤Š„≤„×≤Š„k×ltx
≥× Š„≤×≤ׄŠ„≤Š„≤„×≤Š„
≥…°2t ××≠ŠŠ‘Š„≠Š„• ≤„• ≠בŠ≤
≥…°2u ׊ • ×ב„≤• ×≤‘ŠŠ‘„≤≤„×
v≥ • ×≤≤׊Š„„„≤×׊„Š„Š≤≤„≤×
v≥‘ ≤××׊„Š„ׄ≤„≤׊Š„ŠŠ„„Š
Šty ŠŠ≤≤„≤Š≤Š×≤Š„≤ׄŠ×„≤ kŠlty
Š× ŠŠ≤≤„≤Š≤Š×≤Š„≤ׄŠ×„≤
x≥ • „Š≤≤„≤„≤׊„„×≤≤„≤≤××
x≥‘ ŠŠ„„≤××≤≤×≤ŠŠ„„≤„„Š≤„
≥…בx ×≤ׄŠ„„׊Š„Š„≤„„Š×„×≤„≤×
≥…בv Š≤ŠŠ≤≤Š≤×ׄ׊≤„Š≤„Š≤×≤≤„„≤
≥…×x Š„ׄ×≤„׊Š„Š„≤„„Š×„×≤„≤×
≥…×v Š≤ŠŠ≤≤Š≤׊≤„Š≤„Š≤×≤≤„„≤„
112 方法
t1u1t • ‘„的提取及 ¦⁄‘„ 的合成 取 t ª桑树叶片置于预冷的研钵中 o加液氮快速研磨成粉末状 o利用
≤ׄ…法k刘洋等 oussyl提取 • ‘„ o以总 • ‘„为模板 o以 ×tx为引物 o利用 2∂ 反转录酶合成 ¦⁄‘„ 第一
链 o置 p {s ε 保存备用 ∀
t1u1u ΜΣΒΠασε中间片段的克隆 利用 …„≥×分析 ‘≤…Œ已经登录的 ≥…°¤¶¨ 氨基酸序列的保守区域 o设计
一对兼并引物 ≥…°2t !≥…°2u用于扩增 ΜΣΒΠασε中间片段 ∀反应条件 }|w ε 预变性 x °¬± ψk|w ε 变性t °¬±o
xx ε 退火 t °¬±ozu ε 延伸 t °¬±l o共 vx个循环后再 zu ε 延伸 ts °¬±∀反应结束后用 t1u h的琼脂糖凝胶
电泳检查 °≤• 产物 o回收目的片段进行克隆测序 ∀
t1u1v ΜΣΒΠασε的 v. • „≤∞ 根据所克隆到的中间片段测序结果 o设计特异引物 v≥• 和 v≥‘o分别与 ×tx和
≥×作嵌套 °≤• o扩增目的基因的 v.端 ∀取 t ˏ¦⁄‘„做模板 o反应条件为 }|w ε 预变性 x °¬± ψk|w ε 变性
t °¬±oxy ε 退火 t °¬±ozu ε 延伸 t °¬±l o共 vx个循环后再
zu ε 延伸 ts °¬±∀反应结束后用 t1u h的琼脂糖凝胶电泳检
查 °≤• 产物 o回收目的片段进行克隆测序 ∀
t1u1w ΜΣΒΠασε的 x. • „≤∞ 将 t1u1t得到的反转录产物 o采
用 ⁄‘„ ƒµ¤ª°¨ ±·°∏µ¬©¬¦·¬²± Ž¬·∂ µ¨qu1s试剂盒纯化 o利用 ק×
进行加尾反应 o将反应产物 p us ε 贮存备用 ∀根据已知的中
间片段设计特异引物 x≥• 和 x≥‘与 Šty和 Š× 作嵌套 °≤• o
扩增目的基因的 x.端 ∀反应条件为 }|w ε 预变性 x °¬± ψk|w
ε 变性 t °¬±ox{ ε 退火 t °¬±ozu ε 延伸 t °¬±l o共 vx个循环
后再 zu ε 延伸 ts °¬±∀反应结束后用 t1u h的琼脂糖凝胶电
泳检测 °≤• 产物 o回收目的片段进行克隆测序 ∀
t1u1x 扩增产物的克隆与序列测定 用 ⁄‘„凝胶回收试剂
盒回收 °≤• 扩增产物 ∀回收产物与 ³⁄t{2×载体进行连接 o
连接产物转化大肠杆菌 ⁄‹xΑ∀在含氨苄青霉素的培养基上
进行蓝白斑筛选 ∀随机挑取白色菌落 o进行菌落 °≤• 鉴定 ∀
vy 第 v期 冀宪领等 }桑树景天庚酮糖 p t oz p二磷酸酶基因的克隆 !原核表达与植物表达载体的构建
由上海生物工程公司用测序仪 „…Œ°•Œ≥× vzz ⁄‘„ ≥¨ ∏´¨±¦¨µ进行序列测定 ∀
t1u1y ΜΣΒΠασε全长序列的获得与序列分析 根据已测定片段的序列及其重叠区域 o拼出目的基因的全长
¦⁄‘„ o用 ⁄‘„„‘及 ⁄‘„≤¯ ∏¥软件进行序列分析 ∀
图 u ΜΣΒΠασε植物表达载体构建示意图
ƒ¬ªqu ⁄¬¤ªµ¤° ²© ΜΣΒΠασε ³¯¤±·¨ ¬³µ¨¶¶¬²± √ ¦¨·²µ
„ }空载体 ³…Œtut °¯ ¤±· ¬¨³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µ³…Œtut ~ …}插入
ΜΣΒΠασε 编码区的 ³⁄t{2× 载体 ׫¨ ³⁄t{2× º¬·« ·«¨
ΜΣΒΠασε ¦²§¬±ªµ¨ª¬²±¬±¶¨µ·¨§³²¶¬·¬√¨¯¼ ~≤ }在 Ξβα´和 Νοτ´位
点之间正向插入 ΜΣΒΠασε 编码区的植物表达载体 ³…Œtut
׫¨ ΜΣΒΠασε ¦²§¬±ª µ¨ª¬²± º¤¶¬±¶¨µ·¨§¬±·² ·«¨ ³¯¤±· ¬¨³µ¨¶¶¬²±
√ ¦¨·²µ³…Œtut ¤··«¨ Νοτ´ ¤±§ Ξβα´ ¶¬·¨¶³²¶¬·¬√¨ ¼¯ q
图 t 原核表达载体 ³∞×vs¤2≥…°构建图
ƒ¬ªqt ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²© Ε qχολι ¬¨³µ¨¶¶¬²±
√¨ ¦·²µ³∞×vs¤2≥…°
t1u1z 原核表达载体的构建与鉴定 根据已克隆的
ΜΣΒΠασε核苷酸序列 o设计一对引物 ≥…×x和 ≥…×v o扩
增 ΜΣΒΠασε的编码区 o琼脂糖凝胶电泳检测 °≤• 产
物 o回收目的片段与 ³⁄t{2× 载体进行连接 o连接产
物转化大肠杆菌 ⁄‹xΑ∀筛选阳性克隆测序验证后利
用 ∞q q‘q„ qא °¯¤¶°¬§ ¬±¬Ž¬·´试剂盒提取重组质
粒 ∀利用 ΕΧο• ∂ 和 Νοτ ´ 酶切重组质粒 o回收
ΜΣΒΠασε片段 o将之与同样酶切的载体 ³∞×vs¤k n l连
接 o转化 Ε qχολι …u¯ 感受态细胞 o对重组质粒进行酶
切鉴定 o选择阳性克隆 o命名为 ³∞×vs¤2≥…°k图 tl ∀
t1u1{ ≥…°¤¶¨ 融合蛋白诱导表达与 ≥⁄≥2°„Š∞电泳
分析 含重组质粒的大肠杆菌 …ut菌株接种于 x °
的 …液体培养基中 ovz ε 培养过夜 o然后按 tΒux的
比例接种 s¯s °新鲜的 …液体培养基培养 v ∗ w «o
至 ’⁄值为 s1x左右 o加入终浓度 t °°²¯#pt的 Œ°×Š
诱导表达 ∀vz ε 继续培养 w «o收集培养菌体经x sss
µ#°¬±pt离心后 o弃上清 o加入 u ≅ ≥⁄≥2°„Š∞上样缓冲
液混匀 ∀ ≥⁄≥2°„Š∞电泳检测kts h 分离胶 ox h 浓缩
胶l ∀
t1u1| ΜΣΒΠασε 植物表达载体的构建与鉴定 根据
已知的 ΜΣΒΠασε核苷酸序列 o设计一对引物 ≥…בx和
≥…בv o扩增 ΜΣΒΠασε的编码区 o琼脂糖凝胶电泳检测
°≤• 产物 o回收目的片段与 ³⁄t{2× 载体进行连接 o
连接产物转化大肠杆菌 ⁄‹xΑ∀筛选阳性克隆提取重
组质粒 ∀利用 Ξβα ´和 Νοτ ´酶切重组质粒 o回收
ΜΣΒΠασε 片段 o与经过同样双酶切的植物表达载体
³…Œtut相连 ∀连接产物转化 ⁄‹xΑ大肠杆菌感受态细
胞 o在含 xs °ª #pt的卡那霉素的 …平板上进行筛
选 ∀随机挑取菌落 o进行 °≤• 扩增和酶切鉴定 o选择
阳性克隆 o命名为 ³…Œtut2≥…°k图 ul ∀
u 结果与分析
211 ΜΣΒΠασε的体外扩增与克隆
利用一对兼并引物 ≥…°2t和 ≥…°2u o进行 • ×2°≤• o
琼脂糖凝胶电泳检测到 t 条大小约 xts ¥³的条带
k图 v„l o与所预测的片段大小基本一致 ∀将该片段进
行序列测定 !同源性比较 o发现它与其他植物 ≥…°¤¶¨ 基因的核苷酸序列同源性较高 o表明在桑树中成功分离
到 ≥…°¤¶¨ 基因的中间片段 ∀根据已分离到的桑树 ≥…°¤¶¨ 基因中间片段设计特异引物 v≥• 和 v≥‘o分别与
×tx和 ≥×作嵌套 °≤• o扩增目的基因的 vχ端 o扩增到 xws ¥³左右的片段k图 v…l ∀对其进行序列分析 o表明该
片段是目的基因的 vχ端的序列 ∀根据已分离到的桑树 ≥…°¤¶¨ 基因中间片段设计特异引物 x≥• 和 x≥‘分别
与 Šty和 Š×作嵌套 °≤• o进行 xχ• „≤∞o扩增出 yws ¥³左右的片段k图 v≤l ∀进行序列分析表明该片段为目
的基因的 xχ端片段 ∀通过以上三步克隆测序 o拼接出桑树 ≥…°¤¶¨ 基因k ΜΣΒΠασεl的 ¦⁄‘„全长序列 ∀
wy 林 业 科 学 ww卷
图 v 桑树 ≥…°¤¶¨ 基因 ΜΣΒΠασε的扩增
ƒ¬ªqv Œ¶²¯¤·¬²± ²© ΜΣΒΠασε ¥¼ • ×2°≤• ©µ²° °∏¯¥¨µµ¼
k„l ΜΣΒΠασε 中间片段的 °≤• 扩增 Œ¶²¯¤·¬²± ²© °¬§§¯¨
©µ¤ª° ±¨·²© ΜΣΒΠασε ~k…l ΜΣΒΠασε vχ端片段的 °≤• 扩增
Œ¶²¯¤·¬²± ²©vχ ©µ¤ª°¨ ±·²© ΜΣΒΠασε ~k≤l ΜΣΒΠασε xχ端片段的
°≤• 扩增 Œ¶²¯¤·¬²± ²©xχ ©µ¤ª° ±¨·²© ΜΣΒΠασε ~t }tss ¥³ ⁄‘„
¤¯§§¨µ°¤µ®¨µ~u }°≤• 产物 °≤• ³µ²§∏¦·q
212 ΜΣΒΠασε的序列分析
分离得到 ΜΣΒΠασε 全长为 t xuz ¥³o阅读框位于 tvv ∗
t vtt ¥³之间 o共编码 v|v个氨基酸k图 wl ∀将推测出的氨基
酸全序列与其他植物同源序列比较发现 o该序列与拟南芥
kΑραβιδοπσιστηαλιαναl !菠菜k Σπιναχια ολεραχεαl !小麦k Τριτιχυµ
αεστιϖυµl !水稻k Ορψζα σατιϖαl的 ≥…°¤¶¨ 序列高度同源 o同源性
分别为 {v1s h !{s1| h !zx1t h !yu1x h k图 wl o进一步证明本
试验克隆得到的基因为编码桑树 ≥…°¤¶¨ 的全长 ¦⁄‘„ ∀由图
w可以看出 o在所有的 ≥…°¤¶¨ 氨基酸序列中 o有 x个 ≤¼¶是保
守的 o其中的  和 ≈ 形成 ≤ŠŠ×k„Π±l≤ 结构 o这一结构被认
为是很多酶的氧化还原活性位点 o参与光的调节反应kƒ²¬ ετ
αλqot|{v ~⁄∏±©²µ§ ετ αλqot||{l ∀由图 w还可以发现 o不同植
物的 ≥…°¤¶¨ 氨基酸序列的 ‘p末端同源性较低 o但它们都具
有叶绿体蛋白转移肽的共同特征 o即含有较多的 ≥¨ µo较少的
„¶³!Š¯ ∏ kƒ∏­¬°²µ¬ ετ αλqot||{ ~√²± ‹ ¬¨­±¨ ετ αλqot|{|l ∀因
此 o由全长 ¦⁄‘„推演出的氨基酸的 ‘p末端可能包含有引
导蛋白质由细胞质转移到叶绿体的转移肽序列 ∀利用
ׄ• Š∞×°k«·³}ΠΠººº q¦¥¶q§·∏q§®Π¶¨µ√¬¦¨¶Π·¤µª¨·³l软件 ‘p末端进行分析 o发现其存在一个具有 xx个氨基酸
残基的叶绿体转移肽序列 o转移肽的断裂位点应该在 ¼¶xx p ≥¨ µxy区域 ∀ ≥…°¤¶¨ 成熟蛋白应含有 vv{个氨
基酸残基 o分子量为 vx ∗ vy ®∏o这与前人的研究结果是一致的k‘¬¶«¬½¤º¤ ετ αλqot|{t ~≤¤§¨·ετ αλqot|{zl ∀
213 ΜΣΒΠασε所编码的蛋白质特性分析
用 „±·«¨ ³µ²·软件对 ΜΣΒΠασε编码的蛋白质的基本特性进行分析 ∀结果为 }相对分子质量是 wu1y ®∏o等
电点为 x1{x ∀经信号肽检测证明 ≥…°¤¶¨ 为非分泌性蛋白k±²±2¶¨¦µ¨·²µ¼ ³µ²·¨¬±lk«·³}ΠΠ³¶²µ·q«ª¦q­³Π©²µ°q
«·°¯ l ∀对 ≥…°¤¶¨ 进行结构预测分析 o结果表明该蛋白富含无规卷曲k¦²¬¯l o高达 yw1u| h o其次是 Αp螺旋
k«¨ ¬¯¬l o为 uu1t| h o而 Βp折叠k¶·µ¤±§l只有 tv1xu h k图 xl ∀ ≥…°¤¶¨ 的 u个亚基配对形成一个功能二聚
体 o每个亚基都是由许多的 Αp螺旋和 Βp折叠通过无规卷曲联系在一起折叠形成的k图 ylk«·³}ΠΠ±³¶¤2³¥¬¯q
¬¥¦³q©µΠ¦ª¬2¥¬±Π±³¶¤p ¤∏·²°¤·q³¯ ‚ ³¤ª¨ €Π‘°≥„Π±³¶¤p ³µ¨§¤q«·°¯ l ∀
213 原核表达载体的构建
筛选出的阳性克隆的插入序列经测序证明为 ΜΣΒΠασε的编码区k数据未附l ∀利用 ΕΧο• ∏和 Νοτ ´酶
切重组质粒 o回收 ΜΣΒΠασε片段 o将之与同样酶切的载体 ³∞×vs¤k n l连接 o转化 Ε qχολι …u¯ 感受态细胞 o选
择阳性克隆 o命名为 ³∞×vs¤2≥…°∀对 ³∞×vs¤2≥…°进行酶切鉴定和 °≤• 分析 o均可获得 t条 t uss ¥³左右的
片段 o长度与 ΜΣΒΠασε ¦⁄‘„编码区片段相同k图 zl o经测序证实阅读框没有发生碱基突变和移码错位 ∀因
此可以确定目的基因已整合到 ³∞×vs¤k n l载体上 ∀
214 πΕΤ30α2ΣΒΠ融合蛋白的诱导表达分析
重组质粒 ³∞×vs¤2≥…°转入大肠杆菌 …ut后 o用 Œ°×Š诱导其表达 o≥⁄≥2°„Š∞结果k图 {l显示 o诱导培养
后的菌体蛋白与未诱导的对照菌 !空载体转化菌相比 o有 t条非常明显的表达增强蛋白条带 o证实所构建的
基因重组菌经诱导能够表达外源蛋白 ∀参照相对分子量标准 o初步测定目的蛋白相对分子质量约 xt ®∏o与
预期相符 ∀目的蛋白组分主要集中于菌体沉淀中 o破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达 ∀
215 植物表达载体构建
筛选出的阳性克隆的插入序列经测序证明为 ΜΣΒΠασε编码区k数据未附l ∀利用 Ξβα´和 Νοτ´酶切重
组质粒 o回收 ΜΣΒΠασε片段 o将之与经过同样双酶切的植物表达载体 ³…Œtut相连 ∀连接产物转化 ⁄‹xΑ大肠
杆菌感受态细胞 o选择阳性克隆命名为 ³…Œtut2≥…°∀对 ³…Œtut2≥…°进行酶切和 °≤• 分析鉴定 o均可获得 t
条 t uss ¥³左右的片段 o长度与 ΜΣΒΠασε ¦⁄‘„编码区片段相同k图 |l o经测序证实阅读框没有发生碱基突
变和移码错位 ∀因此 o可以确定目的基因已整合到 ³…Œtut载体上 ∀
xy 第 v期 冀宪领等 }桑树景天庚酮糖 p t oz p二磷酸酶基因的克隆 !原核表达与植物表达载体的构建
图 w 不同植物来源的 ≥…°¤¶¨ 的同源性比较
ƒ¬ªqw „¯¬ª±° ±¨·²©¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© ≥…°¤¶¨ º¬·«·«²¶¨ ²©²·«¨µ³¯¤±·≥…°¤¶¨¶
同源比较图用 ⁄‘„„‘分析软件完成 ∀相同的氨基酸序列用黑色框起 ~同源的氨基酸序列用灰色框起 ∀序列中
的原点代表缺少的氨基酸 o保守的半胱氨酸在其上方用数字标出 ∀ ≥…°¤¶¨ 的来源为 }拟南芥 k„„|ttvzl ~水稻
k„„suuxx|l ~菠菜k„„…{ttswl ~小麦k≤„„wyxszl ∀ „¯¬ª±° ±¨·º¤¶³¨µ©²µ°¨ §∏¶¬±ª·«¨ ⁄‘„„‘³µ²ªµ¤° qŒ§¨±·¬¦¤¯ ¤°¬±²
¤¦¬§¶º µ¨¨ ¥¯¤¦®¶«¤§¨§¤±§¶¬°¬¯¤µ¤°¬±² ¤¦¬§¶º µ¨¨ ªµ¤¼ ¶«¤§¨§q ׫¨ §²·¶¬ª±¶µ¨³µ¨¶¨±··«¨ ¤°¬±² ¤¦¬§ª¤³¶¬±·µ²§∏¦¨§·²
°¤¬¬°¬½¨ ¶¬°¬¯¤µ¬·¼q ׫¨ ¬§¨±·¬¦¤¯ ≤¼¶ µ¨¶¬§∏¨¶ º µ¨¨ ±∏°¥¨µ¨§ ¤¥²√¨ ·«¨ ° q ׫¨ ¤¯¬ª±¨ § ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶¬±¦¯∏§¨§ ·«²¶¨ ©µ²°
Αραβιδοπσισ τηαλιανα k „„|ttvzl o Ορψζα σατιϖα k „„suuxx|l o Σπιναχια ολεραχεα k „„…{ttswl o Τριτιχυµ αεστιϖυµ
k≤„„wyxszl q
图 x ≥…°¤¶¨ 的二级结构预测分析
ƒ¬ªqx ≥¨ ¦²±§¤µ¼ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ³µ¨§¬¦·¬²± ²© ≥…°¤¶¨
«}Αp螺旋 ‹¨¯¬¬~¦}无规卷曲 ≤²¬¯~¨}Βp折叠 ≥·µ¤±§q
yy 林 业 科 学 ww卷
图 y ≥…°¤¶¨ 的三维结构预测
ƒ¬ªqy °µ¨§¬¦·¨§·µ¬§¬°¨ ±¶¬²±¤¯
¶·µ∏¦·∏µ¨ ²© ≥…°¤¶¨
图 z 原核表达载体 ³∞×vs¤2≥…°的酶切和 °≤• 鉴定
ƒ¬ªqz Œ§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²© ¬¨³µ¨¶¶¬²± √ ¦¨·²µ²©
³∞×vs¤2• ≤× ¥¼ µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨§¬ª¨¶·¬²± ¤±§°≤•
 }⁄‘„分子标准 usss ⁄‘„ °¤µ®¨µusss ~
„ }酶切产物 • ¶¨·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨ §¬ª¨¶·¬²± ³µ²§∏¦·~
…}°≤• 产物 °≤• ³µ²§∏¦·q
图 { ≥⁄≥2°„Š∞电泳分析融合蛋白 ≥…°¤¶¨
在大肠杆菌 …ut中的表达
ƒ¬ªq{ ≥⁄≥2°„Š∞ ¤±¤¯¼¶¬¶²©·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©
µ¨¦²°¥¬±¤±·³µ²·¨¬± ≥…°¤¶¨ ¬± Ε qχολι …ut
t }Œ°×Š诱导的含 ³∞×vs¤ k n l的 …ut菌体 ³∞×vs¤k n l2·µ¤±¶©²µ°¨ §
…ut º¬·«Œ°×Š¬±§∏¦·¬²±~u }未经Œ°×Š诱导的含 ³∞×vs¤k n l的 …ut
菌体 ³∞×vs¤ k n l2·µ¤±¶©²µ°¨ § …utº¬·«²∏·Œ°×Š ¬±§∏¦·¬²±~v }未诱导
的含 ³∞×vs¤2≥…°的 …ut菌体 ³∞×vs¤2≥…° ·µ¤±¶©²µ°¨ § …ut º¬·«²∏·
Œ°×Š¬±§∏¦·¬²±~w }Œ°×Š诱导的含 ³∞×vs¤2≥…°的 …ut菌体 ³∞×vs¤2
≥…°·µ¤±¶©²µ°¨ §…ut º¬·«Œ°×Š¬±§∏¦·¬²±~  }标准分子量蛋白 °µ²·¨¬±
°¤µ®¨µ~箭头所示为表达的融合蛋白 ׫¨ ¤µµ²º ³²¬±··²·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±
µ¨¦²°¥¬±¤±·³µ²·¨¬±q
图 | 植物表达载体 ³…Œtut2≥…°的 °≤• 和酶切鉴定
ƒ¬ªq| Œ§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©³¯¤±·¨ ¬³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µ
²©³…Œtut2≥…° ¥¼ °≤• ¤±§µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨ §¬ª¨¶·¬²±
 }⁄‘„分子标准 usss ⁄‘„ °¤µ®¨µusss ~
„ }酶切产物 • ¶¨·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨ §¬ª¨¶·¬²± ³µ²§∏¦·~
…}°≤• 产物 °≤• ³µ²§∏¦·q
v 讨论
目前已从小麦 !拟南芥和菠菜等多种植物中分离得到 ≥…°¤¶¨ 基因及其¦⁄‘„ o不同植物的 ΣΒΠασε包含了
不同数目和长度的外显子和内含子k•¤¬±¨ ¶ ετ αλqot||u ~ • ¬¯¯¬±ª«¤° ετ αλqot||w ~ ‹¤«± ετ αλqot||{l ∀拟南芥
和衣藻的 ΣΒΠασε在基因组中都是单拷贝 o但由于存在基因复制 o在不同倍性的生物体基因组中 ΣΒΠασε 的拷
贝数较为复杂k•¤¬±¨ ¶ετ αλqousssl ∀在对 ΣΒΠασε结构的研究中发现拟南芥 ΣΒΠασε的上游序列中含有 u个与
Œ2¥²¬同源的 Š„ׄ框 o这是一段存在于许多光调节基因启动子区域的保守 ⁄‘„ 序列k • ¬¯¯¬±ª«¤° ετ αλqo
t||w ~Š¬¯°¤µ·¬± ετ αλqot||sl ~在小麦的 ΣΒΠασε的启动子内具有一个与核内 • ƒt ⁄‘„结合蛋白作用的结合
zy 第 v期 冀宪领等 }桑树景天庚酮糖 p t oz p二磷酸酶基因的克隆 !原核表达与植物表达载体的构建
位点kŽ¤·¤ª¬µ¬ετ αλqot||ul ∀通过对该酶基因结构的研究 o有助于了解其表达调控机制 ∀≥…°¤¶¨ 基因的表达
调控与卡尔文循环中其他核基因编码的酶一样 o主要是在转录水平上进行的 o受到光 !植物生长发育和己糖
水平的调节k • ¬¯¯¬±ª«¤° ετ αλqot||w ~²±¨ ¶ ετ αλqot||yl ∀ •¤¬±¨ ¶等kt|||l认为可能存在一个共同的未知因
子 o控制着这些基因的转录 o但其具体的机制目前还不清楚 ∀利用转基因技术控制植株的 ≥…°¤¶¨ 活性 o可以
进一步研究该酶的作用及其催化活性与植物各种代谢的关系 o有助于阐明 ≥…°¤¶¨ 的作用机制 ∀本研究成功
克隆出 ≥…°¤¶¨ 基因全长 ¦⁄‘„ o构建了原核表达载体 o成功地在大肠杆菌中表达了该蛋白 ~同时构建了
≥…°¤¶¨ 基因植物表达载体 o为深入研究该基因的作用机制奠定了基础 ∀
ƒ…°¤¶¨ 是调控光合和 °’wvp 循环的关键酶之一 o该酶催化一个不可逆的反应 o使果糖 p t oy p二磷酸
kƒ…°l转变成果糖 p y p磷酸和无机磷酸k°¬lk唐功利等 ousstl ∀ ƒ…°¤¶¨Π≥…°¤¶¨ 是从聚球藻k Σψνεχηοχοχχυσ¶³q
°≤≤z|wul 中分离出来的一种酶 o它能催化 ƒ…°或景天庚酮糖 p t oz p二磷酸k≥∏…°l去磷酸化反应 o该酶促反
应有助于 ≤¤¯√¬±循环中原碳受体 ) ) ) 核酮糖 p t ox p二磷酸k•∏…°l的更新 ∀这一反应在高等植物中是被 u
个独立的酶 ƒ…°¤¶¨ 和 ≥…°¤¶¨ 所催化k马为民等 oussvl ∀对 Š¨ ±…¤±®数据库中不同物种来源的 ≥…°¤¶¨ !ƒ…°¤¶¨
和 ƒ…°¤¶¨Π≥…°¤¶¨ 的蛋白质氨基酸序列进行 …„≥×k«·³}ΠΠººº q±¦¥¬q±¯ ° q±¬«qª²√Π…„≥×Πl分析发现 o所有物种
的 ≥…°¤¶¨ 基因有一个共同的进化起源 ∀不同物种的 ≥…°¤¶¨ !ƒ…°¤¶¨ 和 ƒ…°¤¶¨Π≥…°¤¶¨ 蛋白氨基酸序列具有一
定的同源性ku{ h ∗ vu h lk图 tsl ∀这些保守的氨基酸序列可能反映出这 v种酶在功能或结构上的相似性 o
同时也表明这 v种酶可能具有共同的进化起源 o即 ≥…°¤¶¨ 和 ƒ…°¤¶¨ 可能是由兼有这 u种酶功能的 ƒ…°¤¶¨Π
≥…°¤¶¨ 经过长时间的进化分化而来k‹¤±±¤¨µ·ετ αλqoussvl o其具体的分化历程以及保守氨基酸残基在维持酶
的结构和功能上的作用值得探索和研究 ∀
图 ts ‘¨¬ª«¥²µ2­²¬±¬±ª法构建的 ≥…°¤¶¨¶!ƒ…°¤¶¨¶!ƒ…°Π≥…°¤¶¨ 氨基酸序列系统进化树
ƒ¬ªqts ²¯ ¦¨∏¯¤µ³«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨¨²©·«¨ ¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨¶²©≥…°¤¶¨¶oƒ…°¤¶¨¶¤±§ƒ…°Π≥…°¤¶¨¶¦²±¶·µ∏¦·¨§
¥¼ ±¨ ¬ª«¥²µ2­²¬±¬±ª ° ·¨«²§
括号内为所引蛋白氨基酸序列的 Š¨ ±…¤±®登录号 ∀ ׫¨ Š¨ ±…¤±®¤¦¦¨¶¶¬²± ±∏°¥¨µ¶
©²µ±∏¦¯ ²¨·¬§¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ §¤·¤ º µ¨¨ ¶«²º±¬±·«¨ ¥µ¤¦®¨·¶q
参 考 文 献
刘 洋 o何心尧 o马红波 o等 qussy1 用 ≤ׄ…p °∂°法提取棉花各组织总 • ‘„ 的研究 q中国农业大学学报 ottktl }xv p xy q
马为民 o施定基 o王全喜 qussv1 用基因工程提高光合同化 ≤’u效率的一个关键酶 ) ) ) 果糖 p t oy p二磷酸酶 q生物化学与生物物理进展 ovskvl }
wwy q
{y 林 业 科 学 ww卷
潘一乐 qusss1桑种质资源和桑树育种的研究现状与展望 q蚕业科学 ouyk增刊l }t p x q
唐功利 o杨春松 o鲍建绍 o等 qusst1丙糖磷酸异构酶 !果糖 p t oy p二磷酸醛缩酶及果糖 p t oy p二磷酸酶的共表达 q生物化学与生物物理学报 o
vvktl }tvt p tvy q
„±­¤≥ o¤µ¦² …o• |§¬ª¨µ ‹ q ussu1 ’√¨ µ¨¬³µ¨¶¶¬²± ²©·«¨ ³²·¨±·¬¤¯ «¨µ¥¬¦¬§¨ ·¤µª¨·¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ©µ²° Σπιναχια ολεραχεα ¬± ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦
·²¥¤¦¦²q ²¯ ¦¨∏¯¤µ…µ¨ §¨¬±ªo| }xv p yt q
≤¤§¨·ƒ o ∏¨±¬¨µ≤ oƒ µ¨·¨ ‘qt|{z1 Œ¶²¯¤·¬²± ¤±§³∏µ¬©¬¦¤·¬²± ²©¦«¯²µ²³¯¤¶·¬¦¶³¬±¤¦«k Σπιναχια ολεραχεαl ¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ q…¬²¦«¨ ° ouwt }
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³µ²·¨¬±q°µ²·¨¬± ∞¬³µ¨¶¶¬²± ¤±§°∏µ¬©¬¦¤·¬²±otw }tv| p twx q
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¤¦·¬√¨ ¶¬·¨ ³¨ ³·¬§¨ q…¬²¦«¨ °¬¶·µ¼ouu }ws{u p ws{{ q
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¦¤µ¥²¬¤°¬§¨ µ¬¥²±∏¦¯ ²¨·¬§¨ k…… ŒŒl ¬¶²° µ¨¤¶¨ ©µ²° Αραβιδοπσιστηαλιανα q ²¯ Š¨ ± Š¨ ±·oux| }uty p uuv q
‹¤±±¤¨µ·∂ o≥¤¤√¨ §µ¤ ∞o⁄∏©©¬¨∏¬ ƒ oετ αλqussv1 °¯ ¤±·2¯¬®¨ ·µ¤¬·¶¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·« ° ·¨¤¥²¯¬¶° ²© Τρψπανοσοµα ³¤µ¤¶¬·¨¶q°‘„≥ otss }tsyz p tszt q
‹¤«± ⁄oŽ¤¯·¨±¥¤¦« ≤ oŽ∏¦® ˜ qt||{1 ׫¨ ≤¤¯√¬± ¦¼¦¯¨ ±¨½¼°¨ ¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ¬¶ ±¨¦²§¨§ ¥¼ ¤ ¬¯ª«·2µ¨ª∏¯¤·¨§ ª¨ ±¨ ¬± Χηλαµψδοµονασ
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Ž¤·¤ª¬µ¬ƒ o≤«∏¤ ‘‹ qt||u1 °¯ ¤±··µ¤±¶¦µ¬³·¬²±©¤¦·²µ¶) ³µ¨¶¨±·®±²º¯ §¨ª¨ ¤±§©∏·∏µ¨ ¦«¤¯¯¨ ±ª¨¶q×µ¨±§¶¬± Š¨ ±¨ ·¬¦¶o{ }uu p uz q
¬¼¤ª¤º¤ ≠ oפ°²¬ o≥«¬ª¨²®¤≥ qusst1 ’√¨ µ¨¬³µ¨¶¶¬²± ²©¤¦¼¤±²¥¤¦·¨µ¬¤¯ ©µ∏¦·²¶¨2t oyΠ2 ¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ¬±·²¥¤¦¦² ±¨«¤±¦¨¶³«²·²¶¼±·«¨¶¬¶
¤±§ªµ²º·«q‘¤·∏µ¨ …¬²·¨¦«ot| }|yx p |y| q
‘¬¶«¬½¤º¤ „ ‘o…∏¦«¤±¤± … …qt|{t1 ∞±½¼°¨ µ¨ª∏¯¤·¬²± ¬± ≤w ³«²·²¶¼±·«¨¶¬¶q °∏µ¬©¬¦¤·¬²± ¤±§³µ²³¨µ·¬¨¶²©·«¬²µ¨§²¬¬±2¯¬±®¨ §©µ∏¦·²¶¨ ¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ¤±§
¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨ ¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ©µ²° ¦²µ± ¯¨ ¤√ ¶¨q…¬²¯ ≤«¨ ° ouxy }ytt| p ytuy q
•¤¬±¨ ¶≤ „ o¯²¼§≤ o• ¬¯¯¬±ª«¤° ‘  oετ αλqt||u1 ¦⁄‘„ ¤±§ª¨ ±¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²© º«¨ ¤·¦«¯²µ²³¯¤¶·¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ µ¨√¨ ¤¯ «²°²¯²ª¼ º¬·«
©µ∏¦·²¶¨2t oy2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨¶q∞∏µ…¬²¦«¨ ° ousx }tsxv p tsx| q
•¤¬±¨ ¶≤ „ o‹¤µµ¬¶²± ∞ ° o ; ·¯¨µ ‹ oετ αλq usss1 Œ±√ ¶¨·¬ª¤·¬±ª·«¨ µ²¯¨ ²©·«¨ ·«¬²¯2µ¨ª∏¯¤·¨§ ±¨½¼°¨ ¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ¬± ·«¨ ¦²±·µ²¯ ²©
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•¤¬±¨ ¶≤ „ o¯²¼§≤ o⁄¼¨ µ× qt|||1 ‘¨ º ¬±¶¬ª«·¶¬±·²·«¨ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ¤±§©∏±¦·¬²± ²©¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2 ¥¬¶³«²³«¤·¤¶¨ }¤±¬°³²µ·¤±·¥∏·±¨ ª¯ ¦¨·¨§≤¤¯√¬± ¦¼¦¯¨
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פ°²¬ o‘¤ª¤²®¤  o¬¼¤ª¤º¤ ≠ oετ αλqussy1 ≤²±·µ¬¥∏·¬²± ²©©µ∏¦·²¶¨2t oy2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ¤±§¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ·²·«¨ ³«²·²¶¼±·«¨·¬¦µ¤·¨ ¤±§
¦¤µ¥²± ©¯²º ¬±·«¨ ≤¤¯√¬± ¦¼¦¯¨¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶q°¯¤±·≤¨¯¯ °«¼¶¬²¯ owz }v{s p v|s q
√²± ‹ ¬¨­±¨ Š o≥·¨³³∏«± o‹ µ¨µ°¤±± • Š qt|{|1 ⁄²°¤¬± ¶·µ∏¦·∏µ¨ ²© °¬·²¦«²±§µ¬¤¯ ¤±§¦«¯²µ²³¯¤¶··¤µª¨·¬±ª³¨ ³·¬§¨¶q∞∏µ…¬²¦«¨ ° ot{s }xvx p xwx q
• ¬¯¯¬±ª«¤° ‘  o¯²¼§≤ o•¤¬±¨ ¶≤ „ qt||w1 ²¯ ¦¨∏¯¤µ¦¯²±¬±ª²©·«¨ Αραβιδοπσιστηαλιανα ¶¨§²«¨ ³·∏¯²¶¨2 t oz2¥¬¶³«²¶³«¤·¤¶¨ ª¨ ±¨ ¤±§ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¶·∏§¬¨¶¬±
º«¨¤·¤±§ Αραβιδοπσιστηαλιανα q°¯ ¤±·²¯ …¬²¯ ouy }tt|t p tuss q
k责任编辑 徐 红l
|y 第 v期 冀宪领等 }桑树景天庚酮糖 p t oz p二磷酸酶基因的克隆 !原核表达与植物表达载体的构建