全 文 ：第 v|卷 第 u期
u s s v年 v 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1v| o‘²1u
¤µqou s s v
胡杨盐诱导基因与盐抑制基因的差减杂交显示研究
白根本
k北京中医药大学 北京 tsssu|l
沈 昕 王沙生
k北京林业大学 北京 tsss{vl
关键词 } 胡杨 o差减杂交 o基因筛选
收稿日期 }usss p sx p sw ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目kv|{yssyzl ∀
∆ΙΦΦΕΡΕΝΤΙΑΛ ΕΞΠΡΕΣΣΙΟΝ ΟΦ ΣΑΛΤ2ΙΝ∆ΥΧΕ∆ΠΡΕΠΡΕΣΣΕ∆ ΓΕΝΕΣ ΙΝ ΠΟΠΥΛΥΣ
ΕΥΠΗΡΑΤΙΧΑ ΥΣΙΝΓ ΣΥΒΤΡΑΧΤΙς Ε ΗΨΒΡΙ∆ΙΖΑΤΙΟΝ ΤΕΧΗΝΙΘΥΕ
…¤¬Š¨ ±¥¨ ±
k Βειϕινγ Υνιϖερσιτψοφ Χηινεσε Μεδιχινε Βειϕινγtsssu|l
≥«¨ ± ÷¬± • ¤±ª≥«¤¶«¨ ±
k Βειϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγtsss{vl
Αβστραχτ } ≥¤¯·2¬±§∏¦¨§Πµ¨³µ¨¶¶¨§ª¨ ±¨ ¶º¨ µ¨ ¬¶²¯¤·¨§¤··«¨ ·µ¤±¶¦¬³·¬²±¯¨ √¨ ¯¬± Πqευπηρατιχα ∏¶¬±ª¶∏¥·µ¤¦·¬√¨ «¼¥µ¬§2
¬½¤·¬²±·¨¦«±¬´∏¨ q„¥²∏·ws ¦⁄‘„©µ¤ª°¨ ±·¶º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ §º¬·«³²¯¼¤¦µ¼¯¤°¬§¨ ª¨¯¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶©µ²° n yΠp y·² n {Πp
{ ¦⁄‘„ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±¦¼¦¯¨ ¶oº«¬¦«º¬¯¯ ¥¨ ∏¶¨§©²µ¶¦µ¨ ±¨ ¤±§¦¯²±¬±ª¶¤¯·2·²¯ µ¨¤±·ª¨ ±¨ ¶²© Πqευπηαρατιχα ¤±§¶·∏§¼¬±ª
·«¨ °¨ ¦«¤±¬¶° ²©¶¤¯·2·²¯ µ¨¤±·q
Κεψ ωορδσ} Πqευπηρατιχαo≥∏¥·µ¤¦·¬√¨ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±o Š¨ ±¨ ¶¦µ¨ ±¨¬±ª
基因筛选是基因克隆与遗传转化的基础工作 o其目的是估测在环境刺激或诱导条件下基因表达水
平上的变化 ∀即估测直接或间接表达基因的数目 o并进一步作为分子标记进行基因分离与克隆 ∀
胡杨在盐诱导条件下蛋白质电泳结果显示 o与对照ks h l相比 o既有增加的条带 o也有减少的条带 o
客观上证明了盐胁迫关闭了一些基因k抑制基因l的转录 o也开启了一些基因k诱导基因l的转录 ∀本研
究旨在将这些盐诱导及盐抑制基因筛选出来 o以便进一步进行抗盐基因的筛选与克隆 ∀
1 材料与方法
胡杨 u ¤生盆栽实生苗 o分别用 s h os1x h ot h和 u h的 ‘¤≤¯ 溶液处理 ∀按 uw«ow{«和 zu«采取嫩
根备用 ∀
t1t 制备 • ‘„和 ¦⁄‘„ 混合取不同盐浓度及不同时间处理的嫩根 x ª作为试验对象k× ¶¨·¨µΠn l o不同
时间清水处理的 xª嫩根作为试验探针k⁄µ¬√¨ µΠp l o液氮研磨 o加 xs ˏ提取缓冲液kw °²¯ 异硫氰酸胍 ~ux
°°²¯ 柠檬酸钠 ~³‹z qs ~s qx h ≥⁄≥ ~s1t °²¯ Β2巯基乙醇l振荡 vs¶o加 tΠts体积预冷的 u °²¯ ‘¤„¦k³‹w qsl
振荡 vs¶o加等体积水饱和酚振荡 vs¶o加 tΠx体积的氯仿Π异戊醇抽提kuwΒtl o振荡 vs¶o冰浴 tx °¬±ow ε
x sss ª离心 ts °¬±o水相用等体积异丙醇沉淀 ozx h预冷乙醇漂洗 o干澡 o将 • ‘„沉淀溶于 xss ˏ⁄∞°≤
处理的去离子无菌水中 ∀用 ²¯¬ª²k§×l纤维素分离 °• ‘„ ∀¦⁄‘„合成用 °µ²°¨ ª¤公司生产的 ¦⁄‘„合成
试剂盒 ∀
t1u 限制性内切酶酶切 o加连接子及 °≤• 扩增k • ¤±ª ετ αλqot||t ~• ¬¨ ¤¯±§ ετ αλqot||sl 用限制性内切
酶 „¯ ∏Œ将双链 ¦⁄‘„酶切 o使其长度适合 °≤• 扩增 ∀在酶切的双链 ¦⁄‘„片段上加磷酸化的寡核苷酸
连接子 o连接子设计为一端是平末端 o另一端为 w 碱基 vχ突出末端k≤×≤×׊≤×׊„„××≤ŠŠ„≤ׄ 和
ׄŠ×≤≤Š„„××≤„„ Š≤„„Š„Š≤„≤„l o并含有一个 ∞¦²• Œ酶切位点 ∀uss ³°²¯ 磷酸化的连接子 tv ˏ与
ts ˏ¦⁄‘„在 ×w 连接酶作用下连接 o用 ⁄∞„∞法从 t1w h的琼脂糖电泳凝胶上收集带有连接子的 v{v¥³
以上的 ¦⁄‘„片段 o经洗脱kt °²¯ ‘¤≤¯ ~ts °°²¯ ×µ¬¶#≤¯ o³‹{ qs ~ts °°²¯ ∞⁄ׄl o酚 o氯仿Π异戊醇kuwΒtl抽
提 o异丙醇沉淀 o溶解到 ws ˏ无菌水 ∀用收集的加连接子的 ¦⁄‘„ 片段作模板 o以连接子中的 ut ¥³
⁄‘„序列为引物进行 °≤• 扩增 o扩增体积 tss ˏonΠp ¦⁄‘„各 ts管 o扩增产物约 tys Λª∀用氯仿Π异戊
醇kuwΒtl抽提 t ∗ u次 o异丙醇沉淀 o用无菌水稀释为 t Λª1ˏpt备用 ∀
n °• ‘„
|
n ¦⁄‘„k双链 ⁄²∏¥¯¨¶·µ¤±§¶l
| k限制性内切酶消化 !加连接子 !°≤• 扩增l
k⁄¬ª¨¶·¬±ªº¬·« „¯ ∏Œo
n ¦⁄‘„
‹ | ζ p ¦⁄‘„k…⁄l
n t¦⁄‘„
„§§¬±ª ¬¯±®¨ µ¶o°≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±l
≥‹ !°≤• |
n u¦⁄‘„
‹ | ζ p u¦⁄‘„k…⁄l
n v¦⁄‘„
≥‹ !°≤• | ζ p t¦⁄…„k…⁄l
n w¦⁄‘„
‹ | ζ p w¦⁄‘„k…⁄l
n x¦⁄‘„
≥‹ !°≤• | ζ p t¦⁄‘„k…⁄l
n y¦⁄‘„
≥‹ | ζ p ¦⁄‘„ o克隆的 ¦⁄‘„片段k…⁄l
k¦¯²±¨ §¦⁄‘„ ©µ¤ª° ±¨·l
n z¦⁄‘„
≥‹ !°≤ • |
n {¦⁄‘„
图 t 差减杂交流程图
ƒ¬ªqt ׫¨ ©¯²º ¦«¤µ·²©¶∏¥·µ¤¦·¬√¨ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±©²µ¬±§∏¦¬±ªª¨ ±¨
‹ o长杂交 ~≥‹ o短杂交 ~…⁄o生物素标记探针 ∀
‹ }¯²±ª«¼¥µ¬§¬½¤·¬²±o≥‹ }¶«²µ·«¼¥µ¬§¬½¤·¬²±o…⁄}³µ²¥¨ ¥¬²·¬±¯¤¥¨¯q
t1v 差减杂交k„µ¬¤½¬ ετ αλqot||y ~• ¬¨ ¤¯±§ ετ
αλqot||s ~⁄∏ª∏¬§ ετ αλqot|{|l 分别取 xs Λª
°≤• 扩增的 nΠp ¦⁄‘„ o用 uss ˜的 ∞¦²• Œ内切
酶 vz ε 酶切 u «o酚 o氯仿 o异戊醇抽提 u ∗ v次 o
异丙醇沉淀 o用 xs ˏ无菌水分别溶解 nΠp ¦⁄2
‘„沉淀 ∀ktl光敏生物素标记 }在 xs ˏnΠp
¦⁄‘„分别加入 t1x倍体积的光敏生物素k中国
军事医学科学院放射研究所生产l用 ≠±tu2
tss溴钨灯光照 vs °¬±o标记产物呈暗红色反应
液 o用等体积仲丁醇萃取 u次 ov sssµ#°¬±pt离
心 t °¬±o弃上清醇相 o保留水相 ∀kul长杂交 o
短杂交和 °≤• 扩增 }取非生物素标记的 nΠp
¦⁄‘„各 u1x Λª分别加入生物素标记的 xs Λª
pΠn ¦⁄‘„溶液 o加 v °²¯ ‘¤„¦摇匀 ou1x倍体
积的冷无水乙醇共沉淀 us °¬±otu sss µ#°¬±pt
离心 tx °¬±o弃上清 o将沉淀溶解到 ts ˏ×∞缓
冲液kts °°²¯ ×µ¬¶ot °°²¯ ∞⁄ׄ o³‹{ qsltss ε
水煮 v °¬±变性 o低速离心收集液体 o与 u ≅ ts
ˏ杂交缓冲液kt1x °²¯ ‘¤≤Œoxs °°²¯ ‹ ³¨¨¶ots
°°²¯ ∞⁄ׄ ou h ≥⁄≥ o³‹z qxl混合 o液体石蜡覆
盖杂交液面 o沸水煮 v °¬±oy{ ε 水浴 us «k长杂
交l ∀
图 u °≤• 扩增显示差减
杂交特异基因片段
ƒ¬ªqu °≤• ³µ²§∏¦·§¬¶³¯¤¼ §∏µ¬±ª
¶∏¥·µ¤¦·¬√¨ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²± ³µ²¦¨¶¶
长杂交结束后 o在杂交反应管中加入 xx ε
预热的 ‹∞缓冲液kts °°²¯ ‹ ³¨¨¶ot °°²¯ ∞⁄2
ׄ o³‹ z qyl o使 ‘¤≤¯ 浓度由 s1zx °²¯ 降到 s1t °²¯ oxx ε 水浴 x °¬±o取水相 o加入 ts ˏ链亲合素k链亲素
tx °²¯ ‘¤≤¯ ots °°²¯ ‹ ³¨¨¶ot °°²¯ ∞⁄ׄ o³‹z qy缓冲液 ou ΛªΠˏl o室温放置 us °¬±o酚 !氯仿Π异戊醇抽提 o
乙醇沉淀 o稀释到 ux ˏ无菌水中 o将第一次长杂交的试验对象k n t¦⁄‘„l和试验探针k p t¦⁄‘„l分别
与 ux Λª生物素标记的 pΠn ¦⁄‘„混合进行 u «短杂交k杂交方法同长杂交l o短杂交后的 ¦⁄‘„片段k n
uΠp u¦⁄‘„l用酚 !氯仿Π异戊醇抽提 u1x倍体积无水乙醇沉淀 o用无菌水稀
释到 xs ˏ∀取 u ˏn uΠp u¦⁄‘„作模板 o用连接子中 ut ¥³单链 ⁄‘„序列
作引物 o进行 °≤• 扩增k反应体积 tss ˏo|w ε t °¬±oxs ε t °¬±ozu ε u °¬±o
wx次循环 ∀l o获得 xs Λª以上扩增产物 o以备下一轮差减杂交k图 tl ∀取 x
ˏ扩增产物在 x h聚丙烯酰胺测序凝胶上电泳 o银染色法观察显带结果
k图 ul o并根据显带结果决定是否做下轮长杂交 o短杂交和 °≤• 扩增循环 ∀
2 结果与分析
u1t ¦⁄‘„片段收集 图 u结果显示 o经若干轮杂交后 o差异 ⁄‘„片段逐
渐富集 ∀当差减杂交进行到 n wΠp w时 o已有明显的条带显示 o到 n yΠp y
以后的杂交 o一些稀有的差异条带逐步显示出来 ∀我们已从 n yΠp y至 n {Π
p{中收集到大约 ws 个条带 o并将作为分子探针分别盐处理和对照做
‘²µ·«¨µ±杂交 o进一步检测 ¦⁄‘„片段的特异性和进行基因克隆 ∀
|yt 第 u期 白根本等 }胡杨盐诱导基因与盐抑制基因的差减杂交显示研究
u1u °• ‘„的差异表达 胡杨在盐诱导下 o开启了一些与抗盐有关的基因表达 o同时也关闭了一些盐
敏感基因的表达k图 ul ∀这与胡杨盐胁迫条件下的蛋白质分析结果相吻合 o为抗盐机理的研究提供了
直接证据 ∀
3 讨论
差减杂交显示法k¶∏¥·µ¤¦·¬√¨ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±l筛选胡杨盐诱导基因和盐抑制基因 o可以用总 °• ‘„的逆
转录产物 ¦⁄‘„直接杂交显示 o不必分组可以减少工作量 o并可直接区分盐诱导基因与抑制基因片段 o
与差式显示k§¬©©¨µ¨±·¬¤¯ §¬¶³¯¤¼2°≤• l或差式分析kµ¨³µ¨¶¨±·¤·¬²±¤¯ §¬©©¨µ¨±¦¨ ¤±¤¯¼¶¬¶l相比 o能有效地显示一
些低丰度的差异基因 o出现的假带少 ∀
杂交 !扩增是试验成败的关键 o杂交探针应尽量多 o一般达到 us ∗ xs倍 o以便进行竞争性杂交 o防止
模板自身复性 o长杂交对较低丰度基因片段的杂交比较有效 o而对高丰度基因片段的扣除短杂交更有
效 o扩增是差异显示的必要手段 o对双向 °≤• 扩增来讲 o扩增效率为 u± o使一些本底表达很微弱的基因
通过扩增显示出来 o因此 o杂交前连接子的酶切处理必需充分 o适当过量的内切酶处理是必要的 o即使微
弱的残留也会影响试验结果 o电泳采用灵敏度高的聚丙烯酰胺测序凝胶 !银染色法效果较好 ∀
从胡杨盐诱导基因的条带数来看 o与盐诱导相关的表达基因相对癌诱导表达基因的数目k约 v sss
个条带l要少 o但这并不说明胡杨的抗盐基因表达及调控机理简单 ∀
参 考 文 献
„µ¬¤½¬∞ „ o¬¦«¤¨¯ ‘qŠ²∏¯§qŒ§¨ ±·¬©¼¬±ª§¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¬± °²±²·¨µ³¨ ±¨ ·µ¨¤·¨§°¤°°¤µ¼¦¤µ¦¬±²°¤µ¤¶∏¶¬±ª¶∏¥·µ¤¦·¬√¨§¬¶³¯¤¼ q²∏µ±¤¯ ²©…¬²2
²¯ª¬¦¤¯ ≤«¨ °¬¶·µ¼ot||y ouztkwyl }u| u{y ∗ u| u|w
⁄∏ª∏¬§²«± • o¤µ¼ ≤ q⁄¬±¤∏¨µq¬¥µ¤µ¼¶∏¥·µ¤¦·¬²±²©¬± ∂¬·µ²¦⁄‘„ ¬¯¥µ¤µ¼·²¬§¨±·¬©¼ §¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ¼¯ ¬¨³µ¨¶¶¨§ª¨ ±¨ ¬±¶¦µ¤³¬¨ ¬±©¨¦·¬²±q‘∏¦¯ ¬¨¦„¦¬§¶• 2¨
¶¨¤µ¦«ot|{| ot{k|l }u z{| ∗ u z|u
• ¤±ª o⁄²±¤¯§⁄o…µ²º±q„ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¶¦µ¨ ±¨ q°µ²¦‘¤·¯ „¦¤§≥¦¬˜≥„ ot||t o{{ }tt xsx ∗ tt xs|
• ¬¨ ¤¯±§ŒoŠµ¤¨ °¨ …oŠ¬Š¬„ ετ αλq ·¨«²§©²µ§¬©©¨µ¨±¦¨ ¦¯²±¬±ª}ª¨ ±¨ ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±©²¯ ²¯º¬±ª¶∏·µ¤¦·¬√¨ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±q°µ²¦‘¤·¯„¦¤§≥¦¬˜≥„ ot||s o{z }
u zus ∗ u zuw
szt 林 业 科 学 v|卷