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The Anti-Fertility Effect of Extract Chloroform from Neem Oil on Male Mice

印楝油氯仿提取物对雄性小鼠的抗生育作用


给昆明种雄性小鼠口服印楝油氯仿提取物2g·kg-1d-1,连续1周,停药后第3周取材,研究了其抗生育作用。结果表明小鼠口服印楝油氯仿提取物后抗生育作用肯定;半数致死量为33g·kg-1;血清中转氨酶的活性在停药后的1~3个月升高,停药后的4~6个月基本恢复至正常,血清中睾丸酮含量在服药前后,无明显改变;流式细胞术研究结果表明:印楝油氯仿提取物引起睾丸组织生精细胞减少,细胞凋亡率升高;对变态期精子细胞核蛋白转换的影响表现为总碱性核蛋白含量减少47.11%,总组蛋白精核蛋白比值升高82.25%。研究表明,印楝油氯仿提取物有较好的抗生育作用,其作用机制主要是干扰精子核蛋白的转换,另外还可能与细胞免疫介导有关,对于控制鼠害有一定的意义。

The study was undertaken to evaluate the anti-fertility effect of the extract chloroform isolated from neem oil. Adult male Kunming mice received 2 g\5kg-1 the extract chloroform orally for one week. The data from fertility tests showed that the extracts chloroform from neem oil has positive antifertility effect,the LD50 is 33 g·kg-1, the level of aminotransferase increase in first to third months after treated with extracts chloroform, but turn back gradually in 4-6th months, serum testosterone level has no obviously alteration. The flow cytometry data revealed that extract chloroform could cause a decrease in seminiferous cells number,and an increase in the apoptosis rate. The concentration of total alkaline nuclear protein (TNBP ) was decreased by 47.11% and the ratio of total tissue protein (TH)/ spermic nuclear protein (RP) was increased by 80.25%. The action of anti_fertility may be relevant with interferring the mediated immunity in the metamorphous stage. It is showed that a new way method of controling mouse calamity can be developed.


全 文 :第 wt卷 第 w期
u s s x年 z 月
林 业 科 学
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∂²¯1wt o‘²1w
∏¯ qou s s x
印楝油氯仿提取物对雄性小鼠的抗生育作用
殷中琼t ou 贾仁勇t 陈章宝t 田茂春t 张新申u
kt q西南农业大学动物科技学院 重庆 wsuwys ~ u q四川大学 成都 ytssywl
摘 要 } 给昆明种雄性小鼠口服印楝油氯仿提取物 u ª#®ªpt§pt o连续 t周 o停药后第 v周取材 o研究了其抗生育
作用 ∀结果表明小鼠口服印楝油氯仿提取物后抗生育作用肯定 ~半数致死量为 vv ª#®ªpt ~血清中转氨酶的活性在
停药后的 t ∗ v个月升高 o停药后的 w ∗ y个月基本恢复至正常 o血清中睾丸酮含量在服药前后 o无明显改变 ~流式细
胞术研究结果表明 }印楝油氯仿提取物引起睾丸组织生精细胞减少 o细胞凋亡率升高 ~对变态期精子细胞核蛋白转
换的影响表现为总碱性核蛋白含量减少 wz1tt h o总组蛋白Π精核蛋白比值升高 {u1ux h ∀研究表明 o印楝油氯仿提
取物有较好的抗生育作用 o其作用机制主要是干扰精子核蛋白的转换 o另外还可能与细胞免疫介导有关 o对于控制
鼠害有一定的意义 ∀
关键词 } 印楝油 ~氯仿提取物 ~抗生育作用 ~鼠害
中图分类号 }≥zyw1x 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsw p stuv p sw
收稿日期 }ussv p tt p u{ ∀
基金项目 }重庆市教委中青年骨干教师资助项目kussvlsz号 ∀
Τηε ΑντιpΦερτιλιτψ Εφφεχτ οφ Εξτραχτ Χηλοροφορµ φροµ Νεεµ Οιλ ον Μαλε Μιχε
≠¬± «²±ª´¬²±ªtou ¬¤ • ±¨¼²±ªt ≤«¨ ± «¤±ª¥¤²t ׬¤± ¤²¦«∏±t «¤±ª÷¬±¶«¨ ±u
kt q Χολλεαγε οφ Αµιµ µαλΣχιενχε ανδ Τεχηνολογψo ΣουτηpΩεστ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Χηονγθινγwsuwys ~ u q Σιχηυαν Υνιϖερσιτψ Χηενγδυ ytssywl
Αβστραχτ } ׫¨ ¶·∏§¼ º¤¶∏±§¨µ·¤®¨ ±·² √¨¤¯∏¤·¨·«¨ ¤±·¬p©¨µ·¬¯¬·¼ ©¨©¨¦·²©·«¨ ¬¨·µ¤¦·¦«¯²µ²©²µ°¬¶²¯¤·¨§©µ²° ±¨ °¨ ²¬¯q„§∏¯·
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²©¦²±·µ²¯¬±ª °²∏¶¨ ¦¤¯¤°¬·¼ ¦¤± ¥¨ §¨ √¨ ²¯³¨ §q
Κεψ ωορδσ} ±¨ °¨ ²¬¯~ ¬¨·µ¤¦·¦«¯²µ²©²µ°~¤±·¬p©¨µ¯¬·¬¯¼~¦¤¯¤°¬·¼ ²© °¬¦¨
鼠害作为一种自然生物灾害 o其所造成的经济损失和巨大影响波及自然生态系统和社会经济系统两个
方面k王祖望等 ot||y ~邓址 ot|{|l ∀因此 o人们迫切希望控制和消灭鼠害 ∀总结人类的灭鼠史 o人们对老鼠
采取的抵御手段主要有驱避法 !械捕法和毒杀法 ∀驱避法和械捕法由于受种种客观条件的限制 o不宜于大面
积和持久性使用 o而采用毒杀法更是弊大于利 ∀鉴于此 o从整个大环境来看 o使老鼠不育似乎更能达到控制
群体数量的目的 ∀ Ž±¬³¯¬±ª等kt|zul用鼠类模型对传统的灭鼠法和不育法进行了比较研究 o结果表明使用有
效的不育剂比使用传统的毒杀方法更有可能达到目的 ∀
由于目前所使用的化学不育剂 !免疫不育剂和雌性激素类药物存在着选择性不强 !对环境和非靶生物有
危险等弊端 o因而这方面的研究虽多 o但具体的应用很少 ∀若能将价格低廉 !使用方便 !用量少 !对环境无污
染的植物作为一种不育剂用于灭鼠 o将有良好的生态效应和社会效益 ∀因此 o国家科委将/应用植物不育剂
防治多种害鼠技术0的研究列为林业星火计划项目的一部分 ∀目前国内使用不育剂控制鼠类还处于起步阶
段 ∀本研究选择印度的传统植物药印楝k Αζαδιραχητα ινδιχαl种子提取物 ) ) ) 印楝油k±¨ °¨ ²¬¯l作为节育剂
k∏®«¨µ­¨¨ ετ αλqot||y¤~t||y¥~∏±¨ ­¤ ετ αλqot||y ~ פ¯º¤µ ετ αλqot||z ~ •¤ª«∏√¤±¶«¬ ετ αλqousst ~ „º¤¶·«¼o
usstl o依据印楝油抗生育活性成分主要存在于低极性和中间极性组分中kŠ¤µª ετ αλqot||w ~t||{l o研究了其
氯仿提取物的抗生育作用 o旨在探索出一条控制鼠害的新途径 ∀
t 材料与方法
111 材料
印楝油由成都绿金公司惠赠 o将印楝油经过低极性溶剂k石油醚l回流提取后的残渣再用中间极性的溶
剂k氯仿l回流提取 o浓缩后 o得到印楝油氯仿提取物 ∀试验动物选用性成熟昆明种小鼠kŽ °∏¶°∏¶¦∏¯∏¶l o
雄性 |s只 o雌性 y{s只 o体重为 us ∗ uw ªoux ∗ vs日龄 o常规方式饲养 o自由采食 ∀
112 方法
t1u1t 毒理试验k詹金彪等 ot||vl 取健康小白鼠 tss只 o雌k末孕l雄各半 o体重 us ∗ uw ªo随机编号 ∀用灭
菌生理盐水配制一系列不同浓度的样品溶液 o各小鼠腹腔内分别注射不同浓度的样品溶液 o并逐一记录注射
时间 ∀在正常饲养条件下 o记录各鼠死亡时间 o精确至 x °¬±o以死亡时间与注射时间两项 o求出各鼠的存活
时间 o列出各种剂量k⁄l下小鼠的存活时间k×l o并求出相应的比值剂量r存活时间 ∀根据 ²¯¬±¨ ±ª²的改进法
k²¯¬±¨ ±ª²ot|z|l o剂量与剂量r存活时间之间存在线性关系 ∀把剂量与相应的剂量r存活时间各点进行直线
回归和统计处理 o即可求得 ⁄xs值 ∀
t1u1u 临床试验和睾丸组织的流式细胞学研究 选择性成熟雄性昆明种小鼠 o随机分成 u组 o每组 us只 o
试验组口服 u ª#®ªpt的印楝油氯仿提取物 o用 t h羧甲基纤维素k¶²§¬∏° ¦¤µ¥²¬¼°¨ ·«¼¯¦¨¯¯∏¯²¶¨ o≤ ≤l作为混悬
剂 o空白对照组给予等量的 t h羧甲基纤维素k≤≤l o每日 t次 o连续给药 t周 o造成生精障碍模型 o停药后 v
周k为精子发生的一个周期l o将试验组和对照组雄鼠分别与性成熟的雌鼠按 tΒu合笼进行交配试验 o计算生
育率 ∀雄鼠在交配后 o各组处死 x只 o分别取一侧睾丸称重 o另一侧睾丸组织制备睾丸悬液 o采用机械方法制
备睾丸细胞悬液混合液ktsy个#°ptl o鸡红细胞作为开机后调整流式细胞仪的标准样品 o°Œ染色 o测定各种
细胞数量和 ⁄‘„倍体k贾瑞鹏等 ot||yl ∀流式细胞仪分析 }用 ≤²∏¯·¨µ公司生产的 ∞°Œ≤≥ ∂ 型流式细胞仪进
行分析 o仪器的工作条件为激光波长 w{{ ±° o接收讯号有 ƒ≥和 Œ• ƒo讯号以 ¬¶·°²§¨ 方式贮存 o每个样品
分析 ts sss个细胞 o用仪器内装的 ⁄„⁄≥计算机作结果分析 ∀其余小鼠继续饲养观察 o一部分在停药后
t ∗ y个月采试验鼠外周血 o分离血清 o检测以下指标 }转氨酶k¤°¬±²·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ o„×l !碱性磷酸酶k¤¯®¤¯¬±¨
³«²¶³«¤·¤¶¨ o„°l和 Χp谷氨酰转肽酶kΧp ª¯∏·¤°¼¯ ·µ¤±¶³¨ ³·¬§¤¶¨ oŠŠ×l o同时用放射免疫法k•Œ„l测定血清中
睾酮的含量 ∀另一部分每个发情周期后更换雌鼠 o持续观察 tu个月 o以此研究药物的远期效应 ∀
t1u1v 对变态期精子细胞核蛋白转换的影响 精子细胞核制备 停药后第 v周 o取附睾 o剪碎后加入适量
生理盐水 o于室温搅拌 us °¬±o用 tss目尼龙网过滤 o滤液离心收集 o沉淀为附睾精子 ∀将精子悬于适量水
中 o超声处理 vs ¶o然后加到盛有 t1x °²¯#pt蔗糖溶液的离心管中 o精子悬液在上层 o梯度离心 ot sss ª≅ vs
°¬±o沉淀为精子核 ∀总碱性核蛋白的k·²·¤¯ ¤¯®¤¯¬±¨ ±∏¦¯¨ ¤µ³µ²·¨¬±oב…°l提取和扫描 按文献进行k费仁仁
等 ot||w ~戴文平等 ot||w ~ƒ ¬¨ετ αλqot|{{l ∀
t1u1w 统计学分析 数据用 cξ ? ≥ q⁄q表示 o组间比较用 τ检验 ∀
u 结果
211 毒理试验
按照詹金彪等提供的 ⁄xs值的简易测定方法 o测出印楝油氯仿提取物的 ⁄xs为 vv ª#®ªpt o而抗生育剂
量为 u ª#®ªpt ∀
212 临床试验和睾丸组织流式细胞术研究结果
采用 τ检验统计数据 ∀结果显示小鼠口服印楝油氯仿提取物后 o对睾丸重量无影响 o连续观察 t年 o试
验鼠可在 t ∗ y个月不孕 oz ∗ tu个月怀孕率逐渐回升 o结果见表 t ∀小鼠口服印楝油氯仿提取物后血清中转
氨酶k„× !„≥×l与对照组相比 o在停药后 v个月显著升高 o停药后 y个月显著降低k Π s1stl ~碱性磷酸酶
k„°l在停药后 v个月 o与对照组相比 o无显著差异 o而在停药后 y个月 o显著降低k Π s1stl ~Χp谷氨酰转
肽酶kŠŠ×l酶在停药后 v个月和 y个月与对照组相比 o无显著差异 ∀血清中睾丸酮的含量在停药后 v个月和
y个月与对照组相比无显著差异 ∀结果见表 u和表 v ∀小鼠口服印楝油氯仿提取物后 ot≤细胞减少 ou≤细胞
wut 林 业 科 学 wt卷
相对增多 o对照组 Št期细胞百分比为 z{ h oŠu期细胞百分比为 z1u h o试验组 Št期细胞百分比为 yz1t h o
Šu期细胞百分比为 us1x h ∀另外 o从 ⁄‘„倍体变化的直方图上可以看出 o试验组出现明显的亚二倍体峰
k„³l o凋亡率对照组为 us1| h o试验组为 yu1w h k见图 tl ∀
表 1 印楝油氯仿提取物对雄性小鼠的抗生育作用
Ταβ . 1 Τηε αντιφερτιλιτψ εφφεχτ οφ εξτραχτ χηλοροφορµ ον µ αλε µιχε
药物 ⁄µ∏ª 剂 量 ⁄²¶¨Πkª#®ªptl
睾丸重量
• ¬¨ª«·²©·¨¶·¬¦¯ Π¨ª
妊娠率kt ∗ y个月l
°µ¨ª±¤±¦¼kt¶·∗ y·« °²±·«lΠh
妊娠率kz ∗ tu个月l
°µ¨ª±¤±¦¼kz·«∗ tu·« °²±·«lΠh
t h羧甲基纤维素Πh ≤ ≤ u t1sv| w ? s1st tss tss
印楝油氯仿提取物 ∞¬·µ¤¦·¦«¯²µ²©²µ° ²©±¨ °¨ ²¬¯ u t1svw x ? s1st s vs ∗ {s
Ё s1sx o与对照组比较 ≤²°³¤µ¬±ª·² ≤Žq数值为 ° ¤¨± ? ≥ q⁄q下同 ׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
表 2 小鼠口服印楝油氯仿提取物后血清酶的变化
Ταβ . 2 Σερυµ ενζψµελεϖελσ οφ µαλε ρατσ αφτερ τρεατεδ ωιτη εξτραχτ χηλοροφορµ
指标 Œ±§¨¬ 对照组 ≤Ž 试验组 ∞¬³¨µ¬°¨ ±·ªµ²∏³ΠkŒ˜#
ptl
停药后 v个月 ׫µ¨¨ °²±·«¶¤©·¨µ¤§¬°¬±¬¶·¨§§µ∏ª 停药后 y个月 ≥¬¬ °²±·«¶¤©·¨µ¤§¬°¬±¬¶·¨§§µ∏ª
„× |x ? t1xv t|u ? t1xv33 zw ? t1tx33
„≥× w{{ ? v1wy x|t ? t1z{33 wv{ ? x1u|33
„≥×Π„× x1tw v1s{ x1|u
„° tvw ? u1vt tws ? u1vt |z ? t1xv33
ŠŠ× u ? s1ws v ? s1uw t ? s1tx
3 3 }Π s1st o3 }Π s1sx o与对照组比较 ≤²°³¤µ¬±ª·² ≤Žq
表 3 小鼠口服印楝油氯仿提取物后血清睾酮的变化
Ταβ . 3 Σερυµ τεστοστερονελεϖελσ οφ µαλε ρατσ αφτερ τρεατεδ ωιτη εξτραχτσ χηλοροφορµ
指标 Œ±§¨¬ 对照组 ≤Ž 试验组 ∞¬³¨µ¬° ±¨·¤¯ ªµ²∏³停药后 v个月 ׫µ¨¨ °²±·«¶¤©·¨µ¤§¬°¬±¬¶·¨§§µ∏ª 停药后 y个月 ≥¬¬ °²±·«¶¤©·¨µ¤§¬°¬±¬¶·¨§§µ∏ª
睾酮含量 ≤²±·¨±·²©
·¨¶·²¶·¨µ²±¨ Πk±°²¯#ptl tw1|vv ? u1uuw tw1y|t zy ? s1xz tu1uw{ ? t1vxv
Ё s1sx o与对照组比较 ≤²°³¤µ¬±ª·² ≤Žq
对照组凋亡率 us1| h o≤²±·µ²¯ ªµ²∏³o·«¨ µ¤·¨¶²©¤³²³·²¶¬¶¬¶us1| h 试验组出现明显的亚二倍体峰 o凋亡率 yu1w h ∀
∞¬³¨µ¬° ±¨ ªµ²∏³o·«¨ µ¤·¨¶²©¤³²³·²¶¬¶¬¶yu1w h
图 t 凋亡细胞周期直方图
ƒ¬ªqt ‹¬¶·²ªµ¤° º«¬¦«¶«²º¶·«¨ ⁄‘„ ³¯²¬§¼ ¦«¤±ª¨¶
213 对变态期精子细胞核蛋白转换的影响
从核中提取总碱性核蛋白 o电泳发现 o总碱性核蛋白经过药物处理后明显降低 o对照组总碱性核蛋白含
量占总总碱性核蛋白的 wu1xy h o试验组占 uu1xt h o减少的百分率为 wz1tt h ∀总组蛋白Π精核蛋白的比值
明显升高 o对照组为 s1wyx o而试验组为 u1u{ o升高的百分率为 {s1ux h ∀
v 讨论
本研究表明 o印楝油氯仿提取物具有明显的节育作用 o节育效果可达 y个月 ∀其半数致死量是抗生育剂
量的 ts多倍 o对环境和非靶生物无危险 o显示出该药做为节育剂控制鼠害的可行性 ∀
xut 第 w期 殷中琼等 }印楝油氯仿提取物对雄性小鼠的抗生育作用
血清中碱性磷酸酶的变化 o表明印楝氯仿提取物对小鼠肝细胞有一定的损伤 o从而导致细胞内酶的逸
出 ∀血清中睾酮含量的变化表明印楝油氯仿提取物尽管具有抗生育作用 o但并不影响睾酮转运到曲细精管
和血液的能力 o即不影响小鼠的交配和性行为 o这与其它植物性抗生育剂的作用结果一致k贾瑞鹏等 ot||yl ∀
性成熟的小鼠在生精过程中伴随着染色体的分裂 o⁄‘„含量也减半 o因此流式细胞术直方图上表现为
t≤ !u≤ !w≤ v个峰 o小鼠口服印楝油氯仿提取物后 ot≤细胞减少 ou≤细胞k主要为非生精细胞l相对增加 o说明
印楝油氯仿提取物对生精细胞具有明显的抑制作用 o同时可刺激非生精细胞 o使其合成代谢增加 o⁄‘„含量
增高 o但通过何种方式引起上述改变尚不清楚 ∀ ˜³¤§«¼¤¼等kt||vl认为 o印楝油可增加巨噬细胞的吞噬活性
及  ‹≤ p µ型抗原在巨噬细胞上的表达 o同时可产生细胞因子k≤¼·²®¬±¨ ¶l来干扰附睾 !睾丸中正常生精过程
所需的免疫产物 o从而导致免疫性不育 ∀我们的研究结果表明 o睾丸组织 u≤细胞含量显著增高 o也就是说睾
丸中巨噬细胞 !间质细胞 !支持细胞 ⁄‘„合成活跃 o功能增强 o特别是巨噬细胞功能增强 o可以激活局部免疫
反应 o这与 ˜³¤§«¼¤¼等kt||vl的研究结果相吻合 o可见 o其抗生育作用与细胞免疫介导有关 o然而 o这还需要
更多的证据来证实这个观点 ∀
精子发生由精原细胞 o经精母细胞减数分裂后 o进入精子细胞变态阶段 o这阶段精子细胞形态由圆形变
为长形 o核高度浓缩 o伴随这些形态学的改变 o核内组蛋白逐渐被精核蛋白取代 o形成精子特异染色质 ∀小鼠
口服印楝油氯仿提取物后 o睾丸内精子细胞核蛋白取代过程受阻 o进而导致附睾精子核蛋白组型异常使精子
不能充分分化成熟 o这可能是印楝油氯仿提取物导致不育的重要原因 ∀精核蛋白与生育力有着密切的关系 o
是精子发生过程中敏感而薄弱的环节 o对这方面的深入研究 o将使我们对节育剂的认识提高到新的高度 ∀
参 考 文 献
戴文平 o刘 平 o韩玉华 o等 qt||w q雷公藤单体 ×w !×z !×tx及雷公藤内脂醇对大鼠精子核蛋白组型的影响 q中国医学科学院学报 otyktl }us
邓 址 qt|{| q啮齿动物的生态与防治 q北京 }北京师范大学出版社 otv p t{
费仁仁 o戴文平 qt||w q大鼠精核蛋白的纯化 q生物化学杂志 otskxl }xxz
贾瑞鹏 o周性明 o陈甸英 qt||y q川楝子油对雄性大鼠的抗生育作用 q南京铁道医学院学报 otxktl }t p v
王祖望 o张知彬 qt||y q鼠害治理的理论与实践 q北京 }科学出版社 ovw p wvyy
詹金彪 o周 佩 qt||v q蓖麻毒素和凝集素 ⁄xs值的简易测定法 q生物化学与生物物理进展 ot{kvl }ut| p uut
„º¤¶·«¼ Ž≥ qusst q Š¨ ±²·²¬¬¦¬·¼ ²©¤¦µ∏§¨ ¯¨ ¤© ¬¨·µ¤¦·²© νεεµ ¬± °¤¯¨ª¨µ° ¦¨¯¯¶²© °¬¦¨ q≤¼·²¥¬²¶otsy k¶∏³³¯ ul }txt
ƒ ¬¨• • o⁄¤¬ • ° o¬∏° qt|{{ q׫¨ ©¨©¨¦·¶²©ª²¶¶¼³²¯ ²± ±∏¦¯ ¤¨µ³µ²·¨¬±¬±µ¤··¨¶·¨¶q´ q• §¨∏¦·¬²±¬±·«¨ ¦²±·¨±·²©¥¤¶¬¦³µ²·¨¬±¶¬±·«¨ ¶³¨µ°¬²ª¨ ±¬¦¦¨¯¯¶q
≤²±·µ¤¦¨³·¬²±ovzkvl }uz|
Š¤µª≥ o פ¯º¤µ Š ° o˜³¤§«¼¤¼ ≥ ‘q t||w q ≤²°³¤µ¬¶²± ²© ¬¨·µ¤¦·¬²± ³µ²¦¨§∏µ¨¶²± ·«¨ ¬°°∏±²¦²±·µ¤¦¨³·¬√¨ ¤¦·¬√¬·¼ ²© νεεµ ¶¨ §¨ ¬¨·µ¤¦·¶q ²∏µ±¤¯ ²©
∞·«±²³«¤µ°¤¦²¯²ª¼ouu }{z
Š¤µª≥ oפ¯º¤µŠ ° o˜³¤§«¼¤¼ ≥ ‘qt||{ qŒ°°∏±²¦²±·µ¤¦¨³·¬√¨ ¤¦·¬√¬·¼ ª∏¬§¨§©µ¤¦·¬²±¤·¬²± ¤±§¦«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²± ²©¤¦·¬√¨¦²±¶·¬·∏¨±·¶²© νεεµ k Αζαδιραχητα
ινδιχαl ¶¨ §¨ ¬¨·µ¤¦·¶q∞·«±²³«¤µ°¤¦²¯ oyskvl }uvx
∏±¨ ­¤≥ ≤ o • ¬¯¯¬¤°¶• ≥ oƒ¤µ²²´ „ o ετ αλqt||y q≤²±·µ¤¦¨³·¬²± ³²·¨±·¬¤¯ ²© νεεµ ²¬¯} ©¨©¨¦·²± ³µ¨ª±¤±¦¼¶∏¦¦¨¶¶¬±·«¨ °²∏¶¨ qŒ±§¬¤±„¶¶¬¶·• ³¨²µ·Š¨ ±¨ ·o
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Ž±¬³¯¬±ªo∞ ƒ o¦Š∏¬µ¨  ˜ qt|zu q°²·¨±·¬¤¯ µ²¯¨²©≥·¨µ¬¯¬¶·¤·¬²±©²µ¶∏³³µ¨¶¶¬±ªµ¤·³²³∏¯¤·¬²±¶q„ ·«¨²µ¨·¬¦¤¯ ¤³³µ¤¬¶¤¯ q× ¦¨« …∏¯¯ „ªµ¬¦• ¶¨≥¨ µ√¬¦¨ o ˜ q≥ q
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²¯¬±¨ ±ª²qt|z| q׫¨ ¦∏µ√¨ ¦¯²¶¨¶∂≥ o≥∏µ√¬√¤¯ ·¬°¨¬±·«¨ √¨¤¯²¤±¬²± ²©¤¦∏·¨·²¬¬¦¬·¼q°«²µ° ovtkxl }vwv p vww
∏®«¨µ­¨¨≥ o²«¬¼¤‘Žo°¤¯ • o ετ αλqt||y¤q°∏µ¬©¬¨§±¨ °¨ k Αζαδιραχηταινδιχαl ¶¨ §¨ ¬¨·µ¤¦·¶k°µ¤±¨ °¨l ¤¥µ²ª¤·¨ ³µ¨ª±¤±¦¼¬± ³µ¬°¤·¨¶q≤²±·µ¤¦¨³·¬²±oxv
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∏®«¨µ­¨¨≥ oפ¯º¤µŠ ° qt||y¥q× µ¨°¬±¤·¬²± ²©³µ¨ª±¤±¦¼¬±µ²§¨±·¶¥¼ ²µ¤¯ ¤§°¬±¬¶·µ¤·¬²± ²©³µ¤±¨ °¨ o¤³∏µ¬©¬¨§±¨ °¨ ¶¨ §¨ ¬¨·µ¤¦·q„° • ³¨µ²§Œ°°∏±²¯ o
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