全 文 ：第 ww卷 第 z期
u s s {年 z 月
林 业 科 学
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刺五加体细胞胚胎发生过程及解剖学观察 3
王 义t 李 仙u 赵文君v 孙春玉t 张美萍t
kt1 吉林农业大学生命科学学院 长春 tvstt{ ~ u1哈尔滨工业大学k威海l分校 威海 uywus| ~
v1 吉林省白山市经济开发区管理委员会 白山 tvwvssl
摘 要 } 探讨不同外植体 !植物生长调节物质种类及配比对刺五加培养物的影响 o建立刺五加体胚发生及再生植
株体系 ∀结果表明 }叶片最易形成愈伤组织 o茎次之 o根最差 o外植体最佳取材时期为 w ) x月 ∀刺五加愈伤组织最
适诱导基质为 ≥ n t1s °ª#pt u ow2⁄ n s1x °ª#pty2…„ ~体细胞胚的诱导 !发育和分化的最佳培养基为不添加任
何生长调节物质的 ≥培养基 ∀解剖学观察表明刺五加离体胚胎发生过程与合子胚发育过程相同 ∀
关键词 } 刺五加 ~体细胞胚 ~再生植株
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1t 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lsz p sstz p sy
收稿日期 }uss{ p sw p sz ∀
基金项目 }吉林省科技发展计划项目kussxtttvl ∀
3 张美萍为通讯作者 ∀
Ανατοµιχ Οβσερϖατιον ιν τηε Προχεσσ οφ Σοµατιχ Ε µ βρψογενεσισ οφ Αχαντηοπαναξ σεντιχοσυσ
• ¤±ª≠¬t ¬÷¬¤±u «¤² • ±¨­∏±v ≥∏± ≤«∏±¼∏t «¤±ª  ¬¨³¬±ªt
kt1 Χολλεγε οφ Λιφε Σχιενχεσoϑιλιν Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Χηανγχηυν tvstt{ ~ u1 Ηαρβιν Ινστιτυτε οφ Τεχηνολογψ ατ Ωειηαι Ωειηαι uywus| ~
v1 Μαναγεµεντ Χοµ µιττεε οφ Βαισηαν Εχονοµψ ∆εϖελοπµεντ Ζονε Βαισηαν tvwvssl
Αβστραχτ } ׫¬¶¶·∏§¼ ¬±·¨±§¨§·² ¶¨·¤¥¯¬¶« ¤ ¦∏¯·∏µ¨ ¶¼¶·¨° ·«¤·º²∏¯§¬±§∏¦¨ ¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶²© Αχαντηοπαναξ
σεντιχοσυσq∂¤µ¬²∏¶³¯¤±·ªµ²º·«µ¨ª∏¯¤·²µ¶¤±§·«¨¬µµ¤·¬² º¨ µ¨ ¬±√¨ ¶·¬ª¤·¨§º¬·«§¬©©¨µ¨±·¨ ¬³¯¤±·¶²© Αq σεντιχοσυσq׫¨ µ¨¶∏¯·¶
¶«²º¨ §·«¤··«¨ ¯¨ ¤©º¤¶·«¨ ¥¨¶·²µª¤±·²¬±§∏¦¨ ¦¤¯ ∏¯¶o©²¯ ²¯º¨ §¥¼·«¨ ¶·¨°o¤±§·«¨ µ²²·q„³µ¬¯¤±§¤¼ º¨ µ¨ ·«¨ ¥¨¶·³¨µ¬²§
·²¦²¯¯¨ ¦·¨¬³¯¤±·¶©²µ·«¨ ¬±§∏¦·¬²±q׫¨ ¥¨¶·¬±§∏¦·¬²± °¨ §¬∏° º¤¶≥¶∏³³¯ °¨¨ ±·¨§º¬·«t qs °ª#pt u ow2⁄¤±§s1x °ª#pt
y2…„ ©²µ¦¤¯ ∏¯¶²© Αqσεντιχοσυσq ≥ ¤¯²±¨ º¤¶·«¨ ¥¨¶·°¨ §¬∏°©²µªµ²º·«¤±§§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±q׫¨ ²¥¶¨µ√¨ §¤±¤·²°¼ §¬¶³¯¤¼¨ §
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Κεψ ωορδσ} Αχαντηοπαναξ σεντιχοσυσ~¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²~³¯¤±·µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²±
刺五加kΑχαντηοπαναξ σεντιχοσυσl是五加科k„µ¤¯¬¤¦¨¤¨ l五加属k Αχαντηοπαναξl的一种落叶灌木 o其嫩茎 !嫩
叶为优质山野菜 o根 !茎 !叶 !皮 !果实均可入药k吉林省中医中药研究所 ot|{ul ∀单纯依靠野生资源很难保证
可持续开发利用 ∀刺五加的种子在自然条件下出苗率很低 o实生野生苗极少见 o而且如连续采摘刺五加鲜叶
u ∗ v年 o植株就衰亡 o如果秋季挖根 t次 o需要 ts ∗ tx年左右的自然恢复期才能第 u次采挖 ~同时刺五加的
引种驯化 !人工栽培技术尚不成熟 ∀早在 t||u年出版的5中国植物红皮书 ) ) ) 稀有濒危植物6第一册k傅立
国 ot||ul中 o刺五加被列为濒危植物 ∀
目前 o国内外对刺五加的研究主要集中在中药化学 !药理学 !生态学等方面k吉林省中医中药研究所 o
t|{u ~祝宁等 ot||{ ~傅克治 ot|{z ~中国医学科学院药用植物资源开发研究所 ot||t ~王志睿等 oussv ~祖元
刚等 oussxl o而对离体形态发生的研究报道较少且不系统k宋永贤等 oussx ~梁建萍 oussx ~张喜春等 ot||y ~
张健夫 oussw ~邢朝斌等 oussx ~ussyl ∀
刺五加组织培养周期短 o人为可控 o可加速良种繁育 ∀本试验以刺五加不同部位为供试材料 o筛选最优
外植体和培养基质 !最佳培养条件 o建立了刺五加高效再生体系 o同时进行了刺五加形态建成研究 o以期为遗
传转化受体系统的建立 !种苗和医药工业原料的工厂化生产奠定理论和技术基础 ∀
t 材料与方法
111 愈伤组织诱导和分化
外植体材料为 ussw年 z月采集于吉林省临江的 t ∗ u年生刺五加实生苗 ∀取刺五加的须根 !茎 !叶 o用
流水冲洗干净 o用 s1t h氯化汞消毒 { ∗ ts °¬±o无菌水漂洗 v ∗ x遍 o叶片切成大小为 s1x ¦° ≅ s1x ¦°的方
块 o茎 !须根切成 t ¦°左右的小段 o备用 ∀
112 基本培养基的选择
基本培养基为 ≥和 …x o蔗糖浓度为 vs ª#pt o琼脂 y1x ª#pt o灭菌前 ³‹ 值调至 x1{ o高温高压灭菌
tx ∗ us °¬±∀常规培养条件为温度kuv ? ul ε o每天 ty «光照 ∀培养材料每月继代 t次 ∀
113 诱导培养基的选择
筛选出的基本培养基 o附加不同浓度 !不同种类的植物生长调节物质 o蔗糖浓度为 vs ª#pt o琼脂 y1x
ª#pt o灭菌前 ³‹值调至 x1{ o高温高压灭菌 tx ∗ us °¬±∀常规培养条件为温度kuv ? ul ε o每天 ty «光照 ∀
培养材料每月继代 t次 ∀
114 石蜡切片的制作
用 ƒ„„固定液固定 uw «o放置于 zs h酒精中保存 o然后将组织块进行脱水 !透明 !浸蜡 !包埋 o常规切片 o
切片厚度为 s¯ Λ° oys ε 烘干 o铁钒 p苏木精染色 o加拿大树胶封片 o×≥tss型倒置显微镜下观察并照相 ∀
u 结果与分析
211 愈伤组织诱导的影响因素
u1t1t 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响 以刺五加实生苗的茎和叶为外植体 o以 ≥和 …x 为基本培
养基进行离体诱导 o观察 vs §后愈伤组织诱导率k表 tl ∀由表 t看出 o接种到不同培养基上的刺五加茎和叶
的愈伤组织诱导率有差异 o≥培养基上茎和叶的愈伤组织诱导率均高于 …x 培养基 ∀尤其是叶片在 ≥培
养基中的愈伤组织诱导率达到 {{1| h o是叶片外植体在 …x 培养基中愈伤组织诱导率的 w倍左右 o其诱导能
力显著高于 …x 培养基 ∀茎在 ≥培养基和 …x 培养基中的诱导率差别不显著 o但是 ≥培养基的诱导率也比
…x 培养基高 ∀由此可见 o≥培养基更适合刺五加离体培养 o因此选择 ≥培养基为以下试验的基本培养基 ∀
表 1 不同基本培养基对外植体茎 !叶诱导的影响
Ταβ .1 Εφφεχτσ οφ διφφερεντ βασαλ µεδια ον ινδυχτιον οφ εξπλαντσ (στεµσ ανδ λεαϖεσ)
外植体
∞¬³¯¤±·¶
基本培养基
…¤¶¤¯ °¨ §¬∏°
接种外植体数
‘∏°¥¨µ²© ¬¨³¯¤±·¶
形成愈伤组织数
‘∏°¥¨µ²©¦¤¯ ¬¯
愈伤组织诱导率
Œ±§∏¦·¬²±µ¤·¨ ²©¦¤¯ ∏¯¶Πh
茎 ≥·¨° ≥…x
tus
|{
{s
xy
yy1z
xz1t
叶 ¨¤© ≥…x
|s
|u
{s
us
{{1|
ut1z
表 2 不同外植体愈伤组织诱导率的差异 ≠
Ταβ .2 Τηε διφφερενχεσ οφινδυχτιον ρατε οφ χαλλυσιν διφφερεντ εξπλαντσ
外植体
∞¬³¯¤±·¶
接种外植体数
‘∏°¥¨µ²© ¬¨³¯¤±·¶
形成愈伤组织数
‘∏°¥¨µ²©¦¤¯ ¬¯
愈伤组织诱导率
Œ±§∏¦·¬²±µ¤·¨ ²©¦¤¯ ∏¯¶Πh
叶 ¨¤© uts t|x |u1{
茎 ≥·¨° uts tzx {v1v
根 •²²· tsx vx vv1v
≠培养基为 ≥ ∀下同 ∀ ׫¨ °¨ §¬∏°¬¶≥ q׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
u1t1u 不同外植体对愈伤组织诱导
的影响 刺五加外植体在接种 w §
后 o部分叶片边缘起褶并向上卷起 o部
分叶片内部隆起 ~茎和根没有变化 ∀
接种 x ∗ z §o叶片变化更加明显 o部
分茎段两端开始膨大 o部分茎段整体
均匀膨大 ∀到第 vs天 ov种外植体均
形成愈伤组织k表 ul ∀由表 u可以看
出 ov种外植体均能脱分化形成愈伤
组织 o但各外植体形成愈伤组织的能
力有明显差异 o叶片愈伤组织诱导率
最高 o达 |u1{ h o茎为 {v1v h o根为
vv1v h o诱导率最低 ∀从观察中可看
出 o叶片从接种第 w天开始脱分化 o到
第 vs天时形成愈伤组织 o诱导率能达
到 |u1{ h o脱分化能力极高 ~与此相
反 o根脱分化形成愈伤组织后 o其诱导率始终为 vv1v h o诱导效果明显次于叶片和茎段 ∀这可能与其植株本
身的特性和生理状态有一定关系 ∀本试验认为 o刺五加的叶片和茎适合离体培养 o而根离体培养效果一般 ∀
u1t1v 不同取材季节对愈伤组织诱导的影响 不同发育时期的外植体生理状态各不相同 ∀因此 o外植体脱
分化及分化能力也与植物生长发育的时期有着密切的关系 ∀本试验对不同月份采集的刺五加叶片进行离体
诱导 o观察外植体愈伤组织诱导情况k表 vl ∀由表 v可以看出 o不同发育时期外植体的诱导情况有显著差
异 ∀w月取材外植体诱导率高 o褐化程度较低 o且消毒容易 o污染率也低 o但此时取材可接种的外植体数量不
多 ∀x月取材 o诱导率也较高 o为 {s1| h o污染率较低 o褐化率仅为 z1t h o试验结果表明此时的外植体处于组
{t 林 业 科 学 ww卷
培最佳取材的生理发育期 o容易脱分化或直接分化 ∀而 y !z月和 |月的外植体脱分化较难 o外植体易染菌 o
并伴随着褐化现象 ∀尤其是 |月的外植体材料 o不仅诱导率低 o染菌率也高 o即使诱导出愈伤组织也会发生
褐变 ∀这不仅与外植体本身所产生的酚类物质有关 o还与外植体材料所处的生长发育时期有关 ∀所以 o在本
试验体系下刺五加离体培养最适取材季节为 w ) x月 ∀
表 3 不同取材季节对愈伤组织诱导率的影响
Ταβ .3 Τηεινδυχτιον ρατε οφ χαλλυσ οφ εξπλαντσ χολλεχτεδ ιν διφφερεντ σεασονσ
月份
²±·«
接种外植体数
‘∏°¥¨µ²© ¬¨³¯¤±·¶
污染率
•¤·¨ ²©³²¯ ∏¯·¬²±Πh
褐化率
•¤·¨ ²©¥µ²º±¬±ªΠh
愈伤组织诱导率
Œ±§∏¦·¬²±µ¤·¨ ²©¦¤¯ ∏¯¶Πh
w
x
y
z
|
{w
{w
|y
|s
{w
z1t
tt1|
ty1z
vv1v
wz1y
tw1u
z1t
uz1t
vx1y
wz1y
|u1{
{s1|
xy1v
vt1v
w1{
u1t1w 植物生长调节物质对外植
体脱分化的影响 tl 单独使用植
物生长调节物质的诱导效应 外植
体在添加不同植物生长调节物质的
培养基中诱导形成的愈伤组织的颜
色和质地有一定差异k表 w及图版
´ p t ∗ xl ∀由表 w可以看出 ow种
植物生长调节物质中 u ow2⁄对愈伤
组织诱导及生长速度的影响最大 o
单独使用浓度为 t1s °ª#pt时 o诱导率和生长量最高 ∀虽然使用 ‘„„的愈伤组织诱导率也较高 o但是 ‘„„
诱导的愈伤组织在培养一段时间后 o少部分出现褐化现象 ∀y2…„和 Ž×在单独使用时 o也可形成愈伤组织 o
但其诱导能力远不如单独使用 u ow2⁄或 ‘„„ ∀单独使用 u ow2⁄或 ‘„„所形成的绿色 !淡绿色愈伤组织能在
继代过程中不断形成愈伤组织或在改变一定条件时可再分化形成不定芽 o因此 ou ow2⁄和 ‘„„对于诱导外植
体脱分化是有效的 o其中单独使用 u ow2⁄的效果优于单独使用 ‘„„ ∀y2…„ !Ž× u种生长调节物质在单独使用
时诱导率较低 ∀因此 o应探讨各生长调节物质之间的配合使用 ∀
表 4 不同植物生长调节物质对愈伤组织诱导及生长的影响 ≠
Ταβ .4 Τηεινδυχτιον ρατε ανδ γροωτη οφ χαλλυσ ον µεδια ωιτη διφφερεντ πλαντ γροωτη ρεγυλατορσ
植物生长调节物质
°¯ ¤±·ªµ²º·«µ¨ª∏¯¤·²µΠk°ª#ptl
u ow2⁄ y2…„ ‘„„ Ž×
愈伤组织诱导率
Œ±§∏¦·¬²±µ¤·¨
²©¦¤¯ ∏¯¶Πh
愈伤组织生长量
Šµ²º·« ∏´¤±·¬·¼
²©¦¤¯ ∏¯¶
愈伤组织颜色及质地
≤²¯²µ¤±§¦«¤µ¤¦·¨µ²©¦¤¯ ∏¯¶
s1x s s s yt1| n n n 绿色 o疏松 Šµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
t1s s s s {v1v n n n n 绿色 o疏松 Šµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
t1x s s s zt1w n n n 绿色 o疏松 Šµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
u1s s s s xz1t n n n 绿色 o疏松 Šµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
s s1x s s tt1t n 白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
s t1s s s uu1u n 白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
s t1x s s {1v n 白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
s u1s s s tv1| n 白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
s s s1x s yt1t n n 淡绿色 o疏松 ¬ª«·ªµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
s s t1s s xx1y n n 淡绿色 o疏松 ¬ª«·ªµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
s s t1x s xs1s n n 淡绿色 o疏松 ¬ª«·ªµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
s s u1s s v{1| n n 淡绿色 o疏松 ¬ª«·ªµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
s s s s1x {1v n 白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
s s s t1s t|1w n 白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
s s s t1x tt1t n 白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
s s s u1s tt1t n 白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
≠ / n 0表示生长快慢 o/ n 0越多生长越快 ∀ / n 0¬±§¬¦¤·¨¶ªµ²º·«¶³¨ §¨o °²µ¨ / n 0 °¨ ¤±¶ ∏´¬¦®¨µªµ²º·«q下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
ul 植物生长调节物质的配合使用效果 ≠ ‘„„与细胞分裂素的配合使用 由表 x可以看出 o外植体在
添加 ‘„„和 y2…„的组合中 o愈伤组织诱导率高于 ‘„„和 Ž×的组合 ∀前者形成的愈伤组织为黄绿色 !致密
状k图版 ´ p tl o后者形成的愈伤组织为白褐色 !坚实状k图版 ´ p ul ∀其中 ‘„„浓度为 s1x °ª#pt !y2…„浓
度为 u1s °ª#pt时 o愈伤组织诱导率最高可达 {s1s h ~外植体在添加 ‘„„ n Ž×的基质中愈伤组织诱导率较
低 o最高时为 wu1x h ∀虽然 ‘„„和 y2…„的愈伤组织诱导率较高 o但是两者形成的这种质地坚硬的愈伤组织
在继代培养过程中均逐渐转变为褐色愈伤组织 o最后死亡 ∀
|t 第 z期 王 义等 }刺五加体细胞胚胎发生过程及解剖学观察
表 5 ΝΑΑ与细胞分裂素的配合使用对愈伤组织诱导及生长的影响
Ταβ .5 Εφφεχτσ οφ χοµ βινατιον οφ ΝΑΑ ανδ χψτοκινιν ον χαλλυσινδυχτιον ανδ γροωτη
植物生长调节物质
°¯ ¤±·ªµ²º·«µ¨ª∏¯¤·²µΠk°ª#ptl
‘„„ y2…„ Ž×
愈伤组织诱导率
Œ±§∏¦·¬²±µ¤·¨
²©¦¤¯ ∏¯¶Πh
愈伤组织生长量
Šµ²º·« ∏´¤±·¬·¼
²©¦¤¯ ∏¯¶
愈伤组织颜色及质地
≤²¯²µ¤±§¦«¤µ¤¦·¨µ²©¦¤¯ ∏¯¶
s1x s1x s yx1s n n 黄绿色 o致密 ≠¨¯ ²¯º2ªµ¨ ±¨ ¤±§§¨±¶¨
s1x t1s s yu1x n n 黄绿色 o致密 ≠¨¯ ²¯º2ªµ¨ ±¨ ¤±§§¨±¶¨
s1x t1x s zs1s n n 黄绿色 o致密 ≠¨¯ ²¯º2ªµ¨ ±¨ ¤±§§¨±¶¨
s1x u1s s {s1s n n 黄绿色 o致密 ≠¨¯ ²¯º2ªµ¨ ±¨ ¤±§§¨±¶¨
s1x s s1x uu1x n 白褐色 o坚实 • «¬·¨2¥µ²º± ¤±§¶²¯¬§
s1x s t1s wu1x n n 白褐色 o坚实 • «¬·¨2¥µ²º± ¤±§¶²¯¬§
s1x s t1x vs1s n 白褐色 o坚实 • «¬·¨2¥µ²º± ¤±§¶²¯¬§
s1x s u1s vs1s n 白褐色 o坚实 • «¬·¨2¥µ²º± ¤±§¶²¯¬§
 u ow2⁄与细胞分裂素的配合使用 由表 y可以看出 o在 u ow2⁄浓度不变的情况下 o改变 y2…„和 Ž×浓
度 o外植体均能诱导形成愈伤组织 o但是愈伤组织的颜色及松散度明显不同 ∀用 u ow2⁄和 y2…„诱导的愈伤
组织为淡绿色 !疏松状k图版 ´ p v owl ~而用 u ow2⁄和 Ž×诱导的愈伤组织为白色 !致密状k图版 ´ p xl ∀黄
绿色疏松愈伤组织能够在不含 u ow2⁄的培养基中分化形成芽或体细胞胚 o而白色致密的愈伤组织在继代培
养过程中由白色转变为褐色逐渐死亡 ∀由此发现 oy2…„是诱导刺五加离体培养的重要调节物质 ∀
表 6 2 ,42∆ 与细胞分裂素的配合使用对愈伤组织诱导及生长的影响
Ταβ .6 Εφφεχτσ οφ χοµ βινατιον οφ 2 ,42∆ ανδ χψτοκινιν ον χαλλυσινδυχτιον ανδ γροωτη
植物生长调节物质
°¯ ¤±·ªµ²º·«µ¨ª∏¯¤·²µΠk°ª#ptl
u ow2⁄ y2…„ Ž×
愈伤组织诱导率
Œ±§∏¦·¬²±µ¤·¨
²©¦¤¯ ∏¯¶Πh
愈伤组织生长量
Šµ²º·« ∏´¤±·¬·¼
²©¦¤¯ ∏¯¶
愈伤组织颜色及质地
≤²¯²µ¤±§¦«¤µ¤¦·¨µ²©¦¤¯ ∏¯¶
t1s
t1s
t1s
t1s
t1s
t1s
t1s
t1s
s1x
t1s
t1x
u1s
s
s
s
s
s
s
s
s
s1x
t1s
t1x
u1s
|u1x
{z1x
zx1s
xx1s
vu1x
vs1s
uu1x
uu1x
n n n n
n n n
n n n
n n n
n
n
n
n
淡绿色 o疏松 ¬ª«·ªµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
淡绿色 o疏松 ¬ª«·ªµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
淡绿色 o疏松 ¬ª«·ªµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
淡绿色 o疏松 ¬ª«·ªµ¨ ±¨ ¤±§ ²¯²¶¨
白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
白色 o致密 • «¬·¨ ¤±§§¨±¶¨
综上所述 ou ow2⁄和 y2…„是刺五加愈伤组织诱导必不可少的生长调节物质 ∀外植体在添加 t1s °ª#pt
u ow2⁄和 s1x °ª#pt y2…„的培养基中愈伤组织诱导率最高为 |u1x h ∀此培养基为刺五加愈伤组织诱导的
最适组合 ∀
212 刺五加体细胞胚胎发生途径再生植株
u1u1t 体细胞胚的诱导 将继代 v次的愈伤组织接种到以下 x种培养基中培养 t个月后 o愈伤组织表面出
现一些松散的淡黄色颗粒状物 ) ) ) 体细胞胚k图版 ´ p y ozl ∀第 x个处理 o即不含任何激素的培养基形成体
细胞胚的能力最高k表 zl ∀因此 o确定刺五加体细胞胚诱导培养基为无植物生长调节物质的 ≥培养基 ∀
表 7 ΝΑΑ !62ΒΑ对体细胞胚的诱导效果
Ταβ .7 Εφφεχτσ οφ ΝΑΑ ανδ 62ΒΑ ον εµ βρψοιδ ινδυχτιον
植物生长调节物质
°¯ ¤±·ªµ²º·«µ¨ª∏¯¤·²µΠk°ª#ptl
‘„„ y2…„
接种愈伤组织数
‘∏°¥¨µ²©¦¤¯ ¬¯
形成体细胞胚的组织块数
‘∏°¥¨µ²© °¨¥µ¼²¬§
体细胞胚诱导率
•¤·¨ ²© °¨¥µ¼²¬§Πh
体细胞胚分化量
±∏¤±·¬·¼ ²© °¨¥µ¼²¬§
s1x s ux | vy n n n
t1s s ux z u{ n n
s s1x ux tt ww n n n
s t1s ux tu w{ n n n
s s ux tw xy n n n n
u1u1u 体细胞胚的发育 将上述 x种处理所获得的体细胞胚接种到不含任何激素的培养基中进行培养 ∀
t个月后 o体细胞胚能够在不含任何激素的培养基中从光滑的小颗粒逐渐发育成小子叶胚k图版 ´ p ttl ∀
继续在无激素培养基质中培养 o胚状体进一步成熟发育成子叶胚k图版 ´ p {l o进而发育成熟形成再生植株
su 林 业 科 学 ww卷
k图版 ´ p | otsl ∀因此 o无激素的 ≥培养基亦是刺五加体细胞胚发育 !成熟的最适培养基 ∀
u1u1v 细胞学观察结果分析 首次对刺五加培养物进行细胞学观察 o证实刺五加组织培养中存在着 u类愈
伤组织 }非胚性愈伤组织呈松软状 o细胞大而不规则 o看不到明显的细胞核 o细胞液泡化程度高 o细胞染色浅 o
非胚性细胞大多是横向分裂 o形成由多个细胞构成的纤维状细胞 o而且这些细胞相互交替出现而形成了非胚
性愈伤组织的多种形态结构 k图版 ´ p tvl ~胚性愈伤组织为结构比较致密的颗粒状 o其中大部分细胞体积
小 !核大 !质浓 !染色深 !细胞间排列紧密 o且以细胞团形式存在 ∀胚性细胞除进行横向分裂外 o可能还进行纵
向分裂 o因而形成了细胞之间结合紧密的多细胞团 o这些细胞团表现为不易分离的颗粒体 o这一点可以说明
为什么刺五加组织培养中存在着各式各样质地各异的愈伤组织 ∀能产生体细胞胚的胚性细胞在显微镜下能
够很容易地跟周围细胞区分开来 o这些细胞跟周围的细胞有一个很明显的界限k图版 ´ p tul ∀无论是石蜡
切片还是水装片观察 o都不难看出 o体细胞胚的发生与合子胚的发育相同 o也是经过球形胚 !心形胚k图版
´ p twl !鱼雷形胚k图版 ´ p txl以及子叶胚 o最终发育成完整植株 ∀≥·¨º¤µ§等kt|x{l指出 o细胞与其周围组
织之间生理上的隔离是其进行胚状体发生的先决条件 ∀ ¨¨ 等kt|{sl在芹菜k Απιυµ γραϖεολενσl中观察到 o在
多细胞原胚阶段胚体周围有一层细胞构成/边缘细胞层0 o后来此层细胞退化解体 o在胚状体与周围组织间形
成缝隙 ∀本研究也观察到在刺五加体细胞胚处于多细胞原胚阶段跟周围的细胞形成较为清晰的细胞界线
k图版 ´ p tyl ∀
v 结论与讨论
311 影响愈伤组织诱导的因素
外植体是影响愈伤组织诱导的因素之一 ∀前人对刺五加诱导的研究主要集中在种胚 !叶片和茎尖的诱
导和培养k宋永贤等 oussx ~梁建萍 oussx ~张喜春等 ot||y ~张健夫 oussw ~邢朝斌等 oussyl o而本研究以刺五
加根 !茎 !叶为外植体进行诱导 o发现刺五加的根 !茎和叶在诱导培养基上均能脱分化形成愈伤组织 o但这 v
种外植体的诱导能力有明显差异 o这与外植体的分化程度 !生理状态密切相关 o其中叶片最快 !最易形成愈伤
组织 o茎次之 o根最差 ∀
外植体的生理状态与发育程度都直接影响其脱分化能力 ∀在不同生长时期外植体的生理状态各不相
同 o一般生理代谢旺盛而分化程度较低的组织有利于脱分化形成愈伤组织 ∀本研究发现 ow ) x月的外植体
材料处于生理发育期 o容易脱分化形成愈伤组织 o并且此时取材污染率及褐化死亡率最低 ~其他月份取材则
都不同程度地受到褐化和污染的影响 o尤其是 |月取材 o污染率高 o诱导率低 ∀造成这种差异可能与植物体
内酚类含量和多酚氧化酶活性的季节性变化以及环境中微生物的数量有一定关系 ∀
本研究中无论是单独还是配合使用 ou ow2⁄都表现出较强诱导作用 o并且在 t ∗ u °ª#pt的浓度范围内
达高诱导率 ∀其他 v种物质对刺五加愈伤组织的诱导作用都明显不如 u ow2⁄∀单独使用 u ow2⁄时 o诱导率最
高可达 {v1v h ∀这说明 u ow2⁄也是刺五加脱分化最有效的植物生长调节物质 ∀在配合使用生长素和细胞分
裂素类物质时 o诱导率总体水平上升 o说明刺五加愈伤组织发生是生长素和细胞分裂素共同作用的结果 ∀
312 刺五加离体培养形态发生过程中 2 ,42∆的作用
植物生长调节物质是刺五加培养物形态发生中重要的调控因子 ∀通常情况下 o植物组织培养中诱导细
胞的脱分化 !分化及植株再生均离不开植物生长调节物质的连续供给 o而改变培养基成分 o特别是植物生长
调节物质的比例与组成 o是组织培养成功的关键 ∀试验表明 o在诱导胚状体发生的培养基中必须含有生长素
类物质 o特别是 u ow2⁄o才能诱导细胞处于胚胎发生状态 o但只有将这种处于胚胎发生状态的培养物再转移
到不含有生长素k或生长素浓度很小l的培养基上才能产生大量的胚状体k崔凯荣等 ousss ~周俊彦等 ot|{ul ∀
本研究认为 u ow2⁄对于诱导外植体脱分化是有效的 ∀刺五加离体培养中 u ow2⁄的浓度对愈伤组织的诱
导起很大的作用 ∀虽然 u ow2⁄是诱导愈伤组织不可缺少的生长调节物质 o但是 u ow2⁄的存在会抑制刺五加
形态发生 ∀若培养物一直在含有 u ow2⁄的基质中培养 o培养物只会不断形成愈伤组织 o而不会形成不定芽或
体细胞胚 ∀将愈伤组织接种在不含 u ow2⁄的培养基中培养 ot个月后愈伤组织表面形成一些松散的淡黄色
颗粒状物 o这种淡黄色颗粒状物在无激素培养基中形成进而发育 !成熟形成再生植株 ∀这与日本落叶松
kΛαριξ καεµπφεριl !胡萝卜k ∆αυχυσ χαρροταl !金鱼草k Αντιρρηινυµ µαϕυσl !茄子k Σολανυµ µελονγεναl !芹菜 !人参
kΠαναξ γινσενγlk吕守芳等 oussx ~张琪等 ot||t ~桂耀林等 ot|{z ~崔凯荣等 ousss ~张立功等 ot|{tl等植物的
tu 第 z期 王 义等 }刺五加体细胞胚胎发生过程及解剖学观察
体细胞胚胎发生的结论是一致的 o即 u ow2⁄在诱导的前期是有利的 o但抑制体胚后期发育 ∀因此 o认为 u ow2⁄
是愈伤组织诱导的重要因素 o但如果不及时降低其浓度 o将抑制体细胞胚的形成 o不能通过体胚发生途径获
得再生植株 ∀这与邢朝斌等kussyl !宋永贤等kussxl关于刺五加的报道不同 ∀
参 考 文 献
崔凯荣 o邢更生 qusss q植物激素对体细胞胚胎发生的诱导和调节 q遗传 ouukxl }vw| p vxw q
傅克治 qt|{z q中国刺五加 q哈尔滨 }黑龙江人民出版社 oyx p yx1
傅立国 qt||u q中国植物红皮书 ) ) ) 稀有濒危植物 q北京 }科学出版社 q
桂耀林 o郭仲琛 o徐廷玉 o等 qt|{z q西洋参组织培养研究 q植物学报 ou|kul }uuv p uuw q
吉林省中医中药研究所 qt|{u q长白山植物药志 q长春 }吉林人民出版社 oy{y p y{{ q
梁建萍 qussx o刺五加叶片组织培养研究 q山西农业大学学报 }自然科学版 ouxkwl }vws p vwt q
吕守芳 o张守攻 o齐力旺 o等 qussx q日本落叶松体细胞胚胎发生的研究 q林业科学 owtkul }w{ p xu1
宋永贤 o孙 利 o孙金元 qussx q刺五加离体培养中胚状体的诱导 q时珍国医国药 otykxl }wws p wwu q
王志睿 o林敬明 o张忠义 qussv q刺五加化学成分与药理研究进展 q中药材 ouyk{l }ysv p ysy q
邢朝斌 o沈海龙 o赵丽娜 o等 qussy q刺五加的体细胞胚胎发生研究 q中草药 ovzkxl }yy| p zzu q
邢朝斌 o陈正恒 o曹 蕾 qussx q刺五加组织培养与细胞工程进展 q中草药 ovyktul }t{|y p t{|| q
张 琪 o高微微 qt||t q影响人参种胚体细胞胚胎发生的几个因素 q植物学通报 o{k增刊l }wv p wz1
张立功 o张永华 o王凤勤 o等 qt|{t q杨树体细胞胚状体的诱导发生 q林业科学 ouzkwl }wuy p wu{ q
张喜春 o张中弘 qt||y q影响刺五加茎尖培养的因素 q东北林业大学学报 ouwkyl }tsz p tts q
张健夫 qussw q刺五加的组织培养及快速繁殖的研究 q长春大学学报 otwkwl }zv p zx q
中国医学科学院药用植物资源开发研究所 qt||t q中国药用植物栽培学 q北京 }农业出版社 otz{ p tz{1
周俊彦 qt|{u q植物体细胞在组织培养中产生的体细胞胚 µ }影响植物体细胞胚胎发生和发育的因素 q植物生理学报 o{ktl }|t p || q
祝 宁 o卓丽环 o臧润国 qt||{ q刺五加会成为濒危种吗 q生物多样性 oykwl }uxv p ux|1
祖元刚 o曹建国 qussx q刺五加生活史特征及其形成机制 q北京 }科学出版社 q
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k责任编辑 徐 红l
uu 林 业 科 学 ww卷