全 文 ：第 ww卷 第 y期
u s s {年 y 月
林 业 科 学
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∏±qou s s {
桑树组织培养诱导多倍体植株 3
王茜龄t 周金星u 余茂德t 徐 立t 李镇刚t
kt1 西南大学生物技术学院 北碚 wsszty ~ u1 中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室 北京 tsss|tl
关键词 } 桑树 ~下胚轴 ~组织培养 ~秋水仙碱 ~多倍体植株
中图分类号 }≥{{{1vn t ~≥zuu1vn x 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lsy p styw p sw
收稿日期 }ussz p sx p ux ∀
基金项目 }国家林业科技支撑计划kussy…„⁄sv„tyl ~财政部/长江流域低山丘陵综合治理专项0kussw p swl ~重庆市/十一五0重点科技攻
关项目/果叶兼用人工多倍体新桑品种选育0kussy„…tssul ∀
3 余茂德为通讯作者 ∀
Ινδυχτιον οφ Πολψπλοιδσ ον Μυλβερρψιν Τισσυε Χυλτυρε
• ¤±ª ÷¬¯¬±ªt «²∏¬±¬¬±ªu ≠∏ ¤²§¨t ÷∏¬t ¬«¨ ±ª¤±ªt
kt1 Χολλεγε οφ ΒιοτεχηνολογψoΣουτηωεστ Υνιϖερσιτψ Βειβει wsszty ~ u1 ΚεψΛαβορατορψοφ Τρεε Βρεεδινγ ανδ
Χυλτιϖατιον οφ Στατε Φορεστρψ Αδµινιστρατιον Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ ΦορεστρψoΧΑΦ Βειϕινγ tsss|tl
Αβστραχτ } ˜±§¨µ¤¶¨³·¬¦¦²±§¬·¬²±¶o«¼³²¦²·¼¯¶²©°∏¯¥¨µµ¼ º¨ µ¨ ¤√¨ µ¤ª¨ ¼¯¦∏·¬±·²v ¶¨ª°¨ ±·¶º«¬¦«º¨ µ¨·«¨ ±¦∏¯·∏µ¨§²± ≥
¶²¯¬§°¨ §¬∏°¶∏³³¯ °¨¨ ±·¨§º¬·«v1s °ª#pty2…„ os1v °ª#ptŒ„„ ot1s °ª#pt „ª‘’v·²¶¨¯¨ ¦··«¨ ¥¨¶·µ¨ª¬²±²©«¼³²¦²·¼¯¶
©²µª¨·¬±ª·«¨ °²µ¨ ¦¤¨¶³·²¶¨ ¶«²²·¶qŒ±·«¬¶¶·∏§¼o·«¨ ·¬³³¤µ·²©«¼³²¦²·¼¯¶k±¨ ¤µ·«¨ ª¨µ°l §¨√¨ ²¯³¨ § ∏´¬¦®¯¼ ¤±§¬±§∏¦¨§
¤§√¨ ±·¬·¬²∏¶¥∏§¶ ¤¨¶¬¯¼q ׫¨ ¦¤¨¶³·²¶¨ ¶«²²·¶º¨ µ¨ §¬³³¨§¬±·² t ot1x ou1x ª#pt ¦²¯¦«¬¦¬±¨ ¶¶²¯∏·¬²± ©²µu ²µv §¤¼¶o²µ
§µ²³³¨§º¬·«t1x ou ou1x ª#pt ¦²¯¦«¬¦¬±¨ ¶¶²¯∏·¬²± u·¬°¨ ¶¤§¤¼©²µx §¤¼¶o¤±§·«¨ ±·µ¤±¶©¨µµ¨§·²©µ¨¶« °¨ §¬∏°q…²·«·«¨
§¬³³¨§2 ¤±§§µ²³³¨§2·µ¨¤·°¨ ±·¶¬±§∏¦¨§√¤µ¬¤±·¶«²²·¶q∞¬¤°¬±¤·¬²±²©·«¨ ¦«µ²°²¶²°¨ ¶²©·«¨ ¶«²²··¬³¦¨¯¯¶²©·«¨ µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¨§
³¯¤±·¯¨·¶µ¨√¨ ¤¯ §¨·«¤··«¨¼ º¨ µ¨ ¬¨·«¨µ·¨·µ¤³¯²¬§¶²µ¦«¬±¨ µ¤¶q׫¨ µ¤·¨ ²©·¨·µ¤³¯²¬§¶³µ²§∏¦¨§©µ²°·«¨ §¬³³¨§2 ¤±§§µ²³³¨§2
·µ¨¤·°¨ ±·¶º¤¶tw h ¤±§us h µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ º¬·«·«¨ ¦«µ²°²¶²°¨ ¶±∏°¥¨µ²©xyku ν € wξ € xyl ¤¶¦²°³¤µ¨§·²·«¨ §¬³¯²¬§ku ν €
uξ € u{l q
Κεψ ωορδσ} °∏¯¥¨µµ¼k Μορυσl ~«¼³²¦²·¼¯¶~·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ ~¦²¯¦«¬¦¬±¨ ¶~³²¯¼³¯²¬§¼
桑k Μορυσl为多年生落叶木本植物 o是我国重要的经济树种 o桑叶为家蚕饲料 ∀人工选育的三倍体桑树
品种 o细胞体积较二倍体桑大 t倍以上 o不育 o营养生长旺盛 o产叶量与叶质明显高于目前生产上使用的二倍
体桑树品种 ∀作为叶用植物的桑树 o选育和推广人工三倍体新桑品种已成为国内外桑树育种与栽培新的方
向k南泽吉三郎 ot|{w ~林寿康 ot|{| ~柯益富 ot||zl ∀
在人工三倍体桑树新品种选育中 o桑树二倍体材料多 o容易获得优良的育种材料 o而四倍体亲本材料非
常缺乏 o在自然界野生四倍体桑树极其稀少 o并且经济性状低下 o还不能选作三倍体育种亲本 ∀因此 o目前国
内外桑树四倍体育种材料只能通过人工途径获得 o在国内主要是在大田中采用物理辐射方法即ys ≤²2Χ射线
等辐射 o或者化学诱导方法即秋水仙碱处理二倍体桑的无性繁殖器官获得四倍体k杨今后 ousswl ∀这种传统
育种周期长 o受天气 !季节影响大 o获得的四倍体桑育种材料也局限在已有的一些地方桑树品种中 o基因资源
多样化有限 ∀利用植物组织培养技术和化学诱变相结合的方法获取桑树四倍体育种材料的研究 o在国内尚
未见报道 ∀在国外 o印度 ≤«¤®µ¤¥²µ·¬等kt||{l采用二倍体桑树器官作为外植体 o对其培养并进行化学诱导研
究 ∀为了丰富遗传育种资源 o改良现有的某些栽培品种 o缩短育种进程 o本研究采用桑树多倍体化学诱变技
术与桑树组织培养技术相结合的方法 o在试管内获取桑树四倍体育种材料 ∀
1 材料与方法
t1t 材料 中桑 x{stk Μορυσατροπυρπυρεαl ≅纳溪桑k Μορυσ µυλτιχαυλισl的杂交桑种k该杂交桑种的亲本组合由
西南大学生物技术学院选育 o在西南大学生物技术学院技术指导下 o由重庆市西里蚕种场制种l ∀
t1u 方法 tl 不定芽的诱导 参考王茜龄等kussxl ∀
ul 多倍体诱导 ktl将获得的不定芽转移到已灭过菌的浓度分别为 t !t1x !u1x ª#pt的秋水仙碱溶液中
分别浸渍 u §!v §o对照用无菌水处理 t §∀轻轻摇动使其充分接触 o处理完毕后用无菌水冲洗 w ∗ x次 o再接
入到新鲜的培养基中 o待得到完整植株后进行染色体倍性鉴定 o确定为多倍体的株系予以保留并繁殖 ∀kul
待不定芽有 w片嫩叶时 o以浓度为 t1x !u !u1x ª#pt的秋水仙碱滴液滴定不定芽 x §∀{ }vs ) | }ss滴定 t次 o
tx }ss ) ty }ss滴定 t次 ∀待得到完整植株后鉴定细胞染色体数目 o确定为多倍体的株系予以保留并繁殖 ∀
t1v 多倍体检测 tl 染色体数目鉴定 采用改良去壁低渗法k陈瑞阳等 ot|z|l ∀取桑树茎尖或嫩叶置于
{ p羟基喹啉中预处理 v ∗ w «o于新配的卡诺固定液中过夜 o前低渗 vs °¬±吸干 ov h的果胶酶和纤维素酶混
合液酶解 w ∗ x «o后低渗 ts °¬±o又用卡诺氏固定液再固定 vs °¬±∀采用火焰干燥制片 o玻片经空气干燥后 o
用 x h Š¬¨°¶¤染色 u «o流水冲洗晾干 o镜检观察 ∀
ul 生物学性状鉴定 选取正常株与变异株代表部位 o每株采集充分生长的叶片 y片 o比较其宽度 !厚
度 !质量等生物学性状 ∀采用光合测定仪 ≤…2ttstk北京恩爱迪生态科学仪器有限公司l o选择阴天天气 o空
气中 ≤’u 浓度基本稳定 o温度 uy ∗ vs ε o光照强度 tu sss ∗ tv sss ¬¯的条件下测试 ∀采取测 t个样品 !测 t
个对照的方法 ow个重复 o每个重复测 x片 o取平均值作为这个重复的数据 ∀记录每次测定的 ≤’u 初值和终
值 o采用 ≤…2ttst型光合测定仪自带的软件和计算公式计算出光合速率 ∀
2 结果与分析
u1t 不定芽的诱导 下胚轴上段k靠近胚芽的一段l !中段 !下段 o每段约 s1u ¦°o在诱导培养基中黑暗培养
x §o胚轴膨大 o乳白色 o转入光照条件下培养 o第 z天左右开始在切口处形成愈伤组织 o第 tu天后开始分化
出不定芽 o重复 v次 ∀其愈伤组织诱导率和分化成苗率见表 t ∀
表 1 下胚轴不同区段的离体培养
Ταβ .1 Χυλτυρε οφ διφφερεντ παρτ οφ µ υλβερρψ ηψποχοτψλσιν ϖιτρο
外植体
∞¬³¯¤±·¶
接种片数
Œ±²¦∏¯¤·¬²± ±∏°¥¨µ
死亡率
⁄¨ ¤·«µ¤·¨Πh 愈伤组织诱导率 ≤¤¯ ∏¯¶µ¤·¨Πh
分化成苗率
⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±µ¤·¨Πh
上段 ׬³³¤µ· y{ uy1x zs1t„ zs1y„
中段 ¬§§¯¨³¤µ· yx xs1u v{„… v{ qu…
下段 …¤¶¨ ³¤µ· yy {w1v tx qy… ty…
表 2 秋水仙碱浸渍丛生芽对诱导多倍体的影响 ≠
Ταβ .2 Εφφεχτ οφ διφφερεντ χονχεντρατιονσ ανδ τρεατµεντ δυρατιον
οφ χολχηιχινε ον πολψπλοιδψινδυχτιον ιν ιµ µερσιον
秋水仙碱浓度
≤²¯¦«¬¦¬±¨
¦²±¦¨±·µ¤·¬²±Π
kª#ptl
浸渍时间
׬°¨ Π§
处理芽数
‘∏°¥¨µ²©
·µ¨¤·¨§
¥∏§¶
死亡率
⁄¨ ¤·«
µ¤·¨Πh
变异芽数
‘∏°¥¨µ²©
√¤µ¬¤±·
¥∏§¶
变异率
•¤·¨ ²©
√¤µ¬¤·¬²±Πh
对照 ≤Ž u us s s s
v us s s s
t1s u ts vs z zs
v ts ys w ws
t1x u tu x{1v x wt1z
v ts {s u us
u1s u tx xv1v z wy1z
v tw tss s s
≠变异芽是指形态特征发生变化的芽 ∀ ∂¤µ¬¤±·¥∏§¶¤µ¨ ²© °²µ³«²¯²ª¬¦¤¯ ¦«¤µ¤¦·¨µ°∏·¤·¬²±q
对上述试验结果中下胚轴
各区段的愈伤组织诱导率进行
统计分析 o其愈伤组织诱导率
差异达到极显著水平 ~经多重
比较 o下胚轴上段k靠近胚芽的
一段l愈伤组织诱导率显著高
于下胚轴中段及下段 ∀不定芽
分化率差异达到极显著水平 ~
经多重比较 o下胚轴上段不定
芽分化率极显著高于下胚轴中
段及下段 ∀这与王茜龄等
kussxl以沙二 ≅ 伦 ts|杂交品
种的胚轴为外植体的结果一
致 ∀
u1u 多倍体诱导 经过秋水仙碱浸渍后的不定芽 o生长受到抑制 o叶片发生畸变 o不定芽有严重腐烂现象 o
相同的秋水仙碱浓度分别处理不定芽 u §!v §o其变异率差异明显k表 ul ∀浓度越大 o差异越明显 ~随着浓度
的增加 o死亡率增高 ∀处理后的不定芽的形态特征都发生了变化 o随着秋水仙碱的浓度提高 o叶片畸形越严
重 ∀从死亡率和变异率来看 o以 t1s ª#pt浸渍 u §死亡率最低 o变异率最高 ∀
用秋水仙碱滴液滴定不定芽的试验结果见表 v ∀未经药液处理的丛生芽生长正常 o经药液处理的丛生
xyt 第 y期 王茜龄等 }桑树组织培养诱导多倍体植株
芽生长受到不同程度的影响 ∀随着秋水仙碱浓度的提高 o丛生芽死亡加重 o生长迟缓 o浓度为 u1x ª#pt死亡
率最高 o同时畸形芽增多 ~秋水仙碱 t1x !u1s !u1x ª#pt的处理均有变异植株产生 o但以浓度为 u1s ª#pt的处
理最好 o变异率达 xv h ∀
图 t 变异植株体细胞染色体图组kyss ≅ l
ƒ¬ªqt ·«¨ ¦«µ²°²¶²°¤¯ ±∏°¥¨µ²©¶²°¤·¬¦¦¨¯¯¶¬± §¬³¯²¬§¤±§·¨·µ¤³¯²¬§kyss ≅ l
„ q二倍体 ⁄¬³¯²¬§~…q四倍体 × ·¨µ¤³¯²¬§
表 3 秋水仙碱滴液处理丛生芽的情况
Ταβ .3 Εφφεχτ οφ διφφερεντ χονχεντρατιονσ ανδ τρεατµεντ
δυρατιον οφ χολχηιχινε ον πολψπλοιδψινδυχτιον βψ δροπσ
秋水仙素浓度
≤²¯¦«¬¦¬±¨
¦²±¦¨±·µ¤·¬²±Π
kª#ptl
处理芽数
‘∏°¥¨µ²©
·µ¨¤·¨§
¥∏§¶
死亡率
⁄¨ ¤·«µ¤·¨Πh
变异芽数
‘∏°¥¨µ²©
√¤µ¬¤±·¥∏§¶
变异率
∂¤µ¬¤·¬²±
µ¤·¨Πh
s us s s s
t1x tx tv1v y ws
u tx ws { xv
u1x tx yy1z x vv1z
u1v 细胞学鉴定 试管苗移栽成活后 o
对 ww株变异植株进行细胞染色体检测 o
显微镜下观察并计数染色体数目 ∀每个
植株观察 vs个细胞 ∀仍为二倍体植株的
染色体数目为 u ν € uξ € u{k图 t„l ow株
变异植株变为 u ν € wξ € xyk图 t…l ∀用 u
ª#pt的秋水仙碱浸渍丛生芽获得的 z株
变异植株中有 u株纯合四倍体植株 o诱导
频率为 tw h ~用 u1x ª#pt的秋水仙碱滴
定丛生芽获得 x株变异植株中有 t株纯
合的四倍体植株 o诱导频率为 us h ∀
u1w 生物学鉴定 四倍体植株ku ν €
wξ € xyl叶面凹凸不平 o叶身较为扭曲 o叶
片宽大 o叶色浓绿 o节间密 ∀与二倍体植
株ku ν € uξ € u{l外形特征比较如图 u所
示 ∀经显微测微计算 o四倍体植株叶幅为
ktz1t ? s1tl ¦°o叶厚为 ktxu1x ? w1xl
Λ° ~测定其光合速率为 kv1sx ? t1{l
°ª≤’u#§°pu «pt ~二倍体植株的叶幅为
ktu1{ ? s1zl ¦°o叶厚为k||1| ? v1zl Λ° o
光合速率为kt1tw ? s1wl °ª≤’u #§°pu «pt ∀
经统计分析 o其叶片宽度差异达显著水平
图 u 桑四倍体与二倍体的叶片宽度比较k均为第 y叶位l
ƒ¬ªqu ׫¨ ¦²°³¤µ¬¶²± ²©¥¯¤§¨ º¬§·«¥¨·º¨¨ ± ·¨·µ¤³¯²¬§¤±§§¬³¯²¬§k·«¨ ¶¬¬·«¯¨ ¤©²µ§¨µl
„ q四倍体 × ·¨µ¤³¯²¬§kwξl ~…q二倍体 ⁄¬³¯²¬§kuξl q
kτ € {1y 3 oν € vl ~其厚度达极显著水平
kτ € ty1ux{33 oν € |l ~光合速率达极显著
水平kτ € v1wt 3 oν € wl ∀
3 结论与讨论
在多倍体诱导领域 o理化诱变一直是
首选的诱导方法 ∀本试验将化学诱变剂
与组织培养相结合 o使化学诱变成为人工
诱导多倍体的快捷途径 o它与传统的多倍
体诱变相比 o具有较多优越性 }可以在离
体培养条件下 o反复批量地在培养瓶中进
行处理 o从而大大提高诱导成功率 ~它可
以不受季节 !天气等自然条件的限制 o诱导条件易于控制 o可大大缩短诱导所需时间 ~同时 o诱变后的植株易
于早期筛选 !鉴定 o而且筛选鉴定以后 o短期内可快速繁殖出大量的试管苗 o以供田间鉴定 !生产试验 ∀
在化学诱变剂与组织培养相结合的这一技术中 o建立高频再生体系是基础 ∀桑为木本植物 o在组培过程
中容易褐化 o较难获得高频再生体系 o外植体的选择是关键因素之一 ∀试验以中桑 x{st ≅ 纳溪桑下胚轴为
外植体 o取下胚轴上段k靠近胚芽的一段 o约 s1u ¦°l在诱导培养基 ≥ n y2…„ v1s °ª#pt nŒ„„ s1v °ª#pt n
葡萄糖 vs ª#pt n琼脂 z1s ª#pt n „ª‘’v t1s °ª#pt中诱导效果较好 o诱导率可以达到 zs h o并且容易直接
分化出不定芽 o为诱导多倍体植株提供试管苗 ∀李在留等kussyl在巨龙竹k ∆ενδροχαλαµυσσινιχυσl组织培养的
研究中也表明巨龙竹组织培养与外植体采集部位有关 ∀
yyt 林 业 科 学 ww卷
秋水仙碱处理离体组织的方法主要有浸渍法 !滴液法 !混培法 o不同的处理方法对诱导效果有一定影响 ∀
陈柏君等kusssl在诱导黄芩kΣχυτελλαρια βαιχαλενσισl多倍体时发现浸渍法优于混培法 ~而周嘉裕等kussul在诱
导辣椒k Χαπσιχυµ αννυυµl多倍体时 o认为混培法优于浸渍法 ∀ ≤«¨ ±等kusszl用 u ª#pt的秋水仙碱浸渍黄芪
kΑστραγαλυσ µεµβραναχευσl丛生芽 vy «获得了 vx1v h的四倍体植株 ∀本研究用 u ª#pt的秋水仙碱浸渍丛生
芽 u §获得了纯合四倍体植株 o其诱导率为 tw h ~用 u1x ª#pt的秋水仙碱滴定丛生芽 x §也获得纯合的四
倍体植株 o其诱导率为 us h ∀但是在采用浸渍法和滴液法中发现 o滴液法耗费药液 o浸渍法使用的秋水仙碱
可以反复使用 o省药 o诱导率较高 ∀由于秋水仙碱药品价格昂贵 o因此在桑树多倍体离体诱导中从经济角度
考虑还是选择浸渍法最佳 ∀
本次试验通过组织培养与化学诱变相结合的方法已成功获得了四倍体桑植株 o但其诱导纯合四倍体的
频率还不高 o有待进一步研究 ∀
参 考 文 献
陈柏君 o高山林 qusss1 黄芩组织培养同源四倍体诱导 q植物资源与环境学报 o|ktl }| p tt q
陈瑞阳 o宋文芹 o李秀兰 qt|z|1 植物染色体制备新方法 q植物学报 outkvl }u|z p u|{ q
柯益富 qt||z1桑树栽培及育种学 q北京 }中国农业出版社 ouyz q
李在留 o辉朝茂 qussy1 珍稀竹种巨龙竹组织培养研究 q林业科学 owukul }wv p w| q
林寿康 qt|{|1实用桑树育种学 q成都 }四川科学技术出版社 outs p utv q
南泽吉三郎 qt|{w1 栽桑学 }基础与应用 q东京 }日本鸣风出版社 otzt p t|s q
王茜龄 o余茂德 o徐 立 o等 qussx1 桑子叶与胚轴不同区段离体再生植株的研究 o蚕业科学 ovtkvl }vvw p vvy q
杨今后 qussw1桑树四倍体的诱导及其应用 q蚕业科学 ovsktl }y p | q
周嘉裕 o卿人韦 o兰利琼 o等 qussu1 辣椒离体细胞多倍体的诱导研究 q四川大学学报 }自然科学版 ov|kwl }zsy p zs| q
≤«¤®µ¤¥²µ·¬≥ ° o ∂¬­¤¼¤± Žo •²¼ … ‘o ετ αλqt||{ qŒ± √¬·µ²¬±§∏¦·¬²± ²©·¨·µ¤³¯²¬§¼¬± °∏¯¥¨µµ¼k Μορυσ αλβα ql q°¯ ¤±·≤¨¯¯ • ³¨²µ·¶otzktsl }z|| p {st q
≤«¨ ± ¤±¯¤±oŠ¤² ≥«¤±¯¬±qussz1 Œ± √¬·µ²·¨·µ¤³¯²¬§¬±§∏¦·¬²± ¤±§ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ²©·¨·µ¤³¯²¬§¶©µ²° °¬¬²³¯²¬§¶¬± Αστραγαλυσ µεµβραναχευσq≥¦¬¨±·¬¤ ‹²µ·¬¦∏¯·∏µ¤¨ o
kttul }vv| p vww q
k责任编辑 徐 红l
zyt 第 y期 王茜龄等 }桑树组织培养诱导多倍体植株