全 文 ： 收稿日期 }t||y p s| p t| ∀
第 vx卷 第 w期t | | |年 z 月
林 业 科 学
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杨树花粉染色体加倍有效处理时期的研究
康向阳 朱之悌 林惠斌
k北京林业大学 北京 tsss{vl
摘 要 } 以毛新杨k Ποπυλυστοµεντοσα ≅ Π. βολλεαναl为材料 o在掌握小孢子母细胞减数分裂过程的基础上 o对
花粉染色体加倍中减数分裂的有效处理时期以及作用持续时间进行了研究 o结果表明 }ktl经秋水仙溶液处理
所获得的花粉中均有一定比例的形态较大的花粉 o最高可达 {{ h ∀这种大花粉经花粉染色体检查为 u± € v{ o
且均能正常萌发 ∀kul一般只要是在水培 ws«左右 o花药由淡绿色转为绿黄色以后且未变红前 o也就是由细线
末期到终变期之前处理 o均能取得较好的加倍效果 ∀ kvl在有效处理时期内 o处理次数与花粉得率也有一定的
相关性 o考虑 u±花粉比率及花粉量得率 o处理次数以 v ∗ x次 o每次间隔 x ∗ z«为宜 ∀
关键词 } 毛新杨 o花粉染色体加倍 o减数分裂 o有效处理时期 o秋水仙素
ΣΤΥ∆Ψ ΟΝ ΤΗΕ ΕΦΦΕΧΤΙς Ε ΤΡΕΑΤΙΝΓ ΠΕΡΙΟ∆ ΦΟΡ ΠΟΛΛΕΝ ΧΗΡ ΟΜΟΣΟΜΕ
∆ΟΥΒΛΙΝΓ ΟΦ ΠΟΠΥΛΥΣ ΤΟΜΕΝΤΟΣΑ ≅ Π. ΒΟΛΛΕΑΝΑ
Ž¤±ª ÷¬¤±ª¼¤±ª «∏«¬·¬ ¬± ‹∏¬¥¬±
( Βειϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγtsss{v)
Αβστραχτ : ׫¨ ©¨©¨ ¦·¬√¨ ° ¬¨²¶¬¶³¨µ¬²§¤±§·µ¨¤·¬±ª §∏µ¤·¬²± ²© ³²¯¯¨ ± ¦«µ²°²¶²°¨ §²∏¥¯¬±ª º µ¨¨ µ¨2
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Κεψ ωορδσ: Ποπυλυστοµεντοσα≅ Π. βολλεαναo°²¯¯¨ ± ¦«µ²°²¶²°¨§²∏¥¯¬±ªo  ¬¨²¶¬¶o∞©©¨¦·¬√¨·µ¨¤·¬±ª
³¨µ¬²§o≤²¯¦«¬¦¬±¨
在杨树三倍体育种中 o多采用先获得四倍体 o然后再与二倍体杂交培育三倍体的方法k¨ º¬¶o
t|{wl o但是 o由于该方法需等四倍体开花 o育种时间长 o而且还存在着因亲本选配不当造成育种失败的
危险 o因此 o利用秋水仙碱溶液等处理雄花芽 o获得染色体加倍的 u±花粉 o再使之与二倍体雌株杂交 o
则成为迅速获取三倍体的较为简捷 !可靠的途径之一 ∀为了取得杨树 u±花粉 o除需要考虑处理的秋水
仙碱溶液浓度k张志毅等 ot||ul等因素外 o药剂的有效处理时期亦较为关键 ∀为研究方便起见 o本文以
取材较近 o且花粉量多 !结实力强的毛新杨k Π. τοµεντοσα ≅ Π. βολλεαναl为材料 o在掌握其花粉母细胞减
数分裂过程的基础上 o对花粉染色体加倍中减数分裂的有效处理时期及作用持续时间等进行了研究 ∀
t 材料与方法
111 材料
试验材料毛新杨雌雄花枝均采自于中国农业大学 ∀每年大约在 t月 ts日 ∗ u月 us日期间 o采集
花芽饱满的健壮花枝 o用塑料布包扎严密 o低温贮藏 o分批于温室内kts ε ∗ ux ε l进行加倍处理 ∀
112 方法
t1u1t 花粉加倍方法 采用秋水仙碱溶液进行 u±花粉诱导 o处理浓度为 s1x h o处理方法为注射法 o
即用微量注射器将 s1x h的秋水仙碱溶液注入已在温室内水培一定时间的雄花芽中 o每天注射 v次 o每
次 vs ∗ ws ˏo两次处理间隔时间为 x ∗ z «∀如次日仍需注射 o则于当晚将处理花枝移入 s ε ∗ w ε 的
室内 o以减缓其减数分裂进程 o保持处理效用的连续性 ∀
t1u1u 减数分裂过程观察 定期取水培花芽 o卡诺液固定 u ∗ uw «o若暂不观察 o可移置于 zs h酒精中
冰箱保存 o醋酸洋红涂片观察 ∀
t1u1v u±花粉的统计 白杨的 u±花粉粒直径远远大于正常的单倍体花粉粒 o约在 vz Λ° 以上
k ¤¶«®¬±¤ ετ αλ. , t|{| ~张志毅等 ot||ul ∀由于加倍所获得的大花粉与对照之间对比明显 o易于判别 o
因此我们将每个处理所取得的花粉混合均匀 o制成 v ∗ x个临时涂片 o每片观察 x个视野 o统计花粉中
的大花粉百分率 ∀
t1u1w 花粉染色体检查 当水培的毛新杨雌花柱头分泌粘液发亮时 o取加倍的大花粉及正常花粉授
粉 o约 x ∗ { «后花粉生殖核进入有丝分裂中期 o此时 o将雌花序取下用卡诺液固定 u ∗ uw «o然后取少量
柱头用碱性品红染色压片观察 ∀
t1u1x 花粉生活力鉴定 ktl采用常规培养基法 otu «后镜检观察 ~kul采用活体直接授粉法 o{ ∗ tu «
后卡诺液固定 o取少量柱头 t °²¯r‹≤¯中 ys ε 恒温下处理 ts ∗ us °¬±o水洗后碱性品红染色 o加盖玻
片轻压观察 ∀
u 结果与分析
211 毛新杨减数分裂过程观察
在北京林业大学温室 ts ε ∗ ux ε 的培养下 o毛新杨完成从孢子母细胞到四分体的发育大约需 v §
k见表 t o图版 ´2t ∗ wl ∀从制片观察结果看 o水培状态下毛新杨的减数分裂过程也同自然状态一样有
规律可循 o即不同的分裂时期均需一定的时间过程 o同时不同的分裂阶段同花芽 !花药的外部形态 !颜
色亦有一定相关性 ∀因此 o在花粉加倍处理时 o水培时间 !花芽形态 !花药颜色可作为始处理时期的依
据 ∀
212 花粉染色体加倍与减数分裂阶段的关系
在大致掌握毛新杨花粉母细胞减数分裂过程的基础上 o我们对水培一定时间的雄花枝进行秋水仙
碱加倍处理 o处理前取 u ∗ v个花芽固定观察确切的减数分裂时期 ∀从表 u可以看出 o在不同的减数分
裂时期处理均能获得一定比例的大花粉 o即染色体加倍的花粉k图版 ´2x oyl ∀从花粉母细胞开始 o随
着减数分裂过程的进行 o在不同的始处理时期所取得的花粉中的大花粉的百分率也随之相应提高 ∀其
中以粗线期前后处理效果最好 o注射次数 v ∗ x次时 o大花粉百分率可达到 zs h ∗ {x h ∀粗线期以后处
理 o大花粉比率则急剧下降 ∀
始处理时期不同 o花粉加倍的效果也有所差异 o其原因可能与秋水仙碱进入细胞并发生作用需有
一定的时间过程有关 ∀如始处理时期晚于终变期时 o至四分体仅需 ts «左右 o此时注射则会出现药液
尚未发生作用 o而减数分裂已经结束的情况 ∀如始处理时期过早 o而处理次数又较少时 o药液只能对部
分细胞发生作用 o并且随着减数分裂接近中期 Œo一些细胞还会依靠自身的调节摆脱被作用状态 ∀一般
而言 o只要在水培 ws «左右 o花序出露 trw以内 o花药由淡绿转为绿黄色且未变红前处理 o也就是由细
线末期到终变期这前处理 o均能取得较好的效果 ∀
uu 林 业 科 学 vx卷
表 1 毛新杨减数分裂过程与雄花序外部特征
Ταβ .1 Τηε αππεαρανχε οφ µαλε χατκιν ανδ τηε προχεσσοφ µειοσισ οφ Π. τοµεντοσα≅ Π. βολλεανα
固定时间 水培时间 花序变化 花药颜色 减数分裂阶段
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t月 uz日 tt时 s 淡绿色 花粉母细胞
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u{日 tt时 uw 淡绿色 细线期
¤± qu{ tt }ss ¬ª«·ªµ¨ ±¨ ¨³·²·¨±¨
u{日 uv时 vy 花序微露 绿黄色 细线末期 偶线期
¤± qu{ uv }ss ¬··¯¨ ¨° µ¨ª¨ ±¦¼ ²©¦¤·®¬± ≠¨¯ ²¯º¬¶«ªµ¨ ±¨ …²∏´ ∏¨·¶·¤ª¨ o½¼ª²·¨±¨
u|日 z时 ww trw伸出鳞片 绿黄色 粗线期
¤± qu| sz }ss trw ‹¬ª«¨µ·«¤± ¶´∏¤°¤ ≠¨¯ ²¯º¬¶«ªµ¨ ±¨ °²¦«¼·¨±¨
u|日 tv时 xs trw伸出鳞片 微带红色 双线期 终变期
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u|日 t|时 xy trv伸出鳞片 浅红色 终变期 中期 Œ 后期 Œ
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u|日 uv时 ys trv伸出鳞片 浅红色 中期 Œ 后期 Œ 末期 Œ
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vs日 z时 y{ tru伸出鳞片 红 !深红色 后期 µ 末期 µ w分体
¤± qvs sz }ss tru ‹¬ª«¨µ·«¤± ¶´∏¤°¤ • §¨¤±§§¤µ®µ¨§ „±¤³«¤¶¨ µ o·¨¯ ²³«¤¶¨ µ o´ ∏¤µ·¨·
表 2 花粉染色体加倍的始处理时期与大花粉百分率
Ταβ .2 Τηεινιτιατιον τρεατµεντ περιοδ οφ πολλεν χηροµοσοµε δουβλινγ ανδ τηε περχενταγε οφ βιγ πολλεν
始处理时期
° µ¨¬²§²©
¬±¬·¬¤·¬²±·µ¨¤·° ±¨·
注射次数
׬° ¶¨²©
¬±­¨¦·¬²±
大花粉比率 ° µ¨¦¨±·¤ª¨ ²©¥¬ª³²¯¯¨ ±¶k h l
重复 ´
• ³¨¯¬¦¤·¬²± ´
重复 µ
• ³¨¯¬¦¤·¬²±µ
重复 ¶
• ³¨¯¬¦¤·¬²±¶
总 平 均
ײ·¤¯ ¤√ µ¨¤ª¨
花粉母细胞 v v qs w qy p v q{
¬¦µ²ª¤° ·¨²¦¼·¨ x uy qy t| qz p uv qu
细线前期 v wt qs vs qw u{ qw vv qv
¨³·²·¨±¨ x xv qw yu qv xt q{ xx q{
细线末期 v x{ qx xt qz y{ qs x| q{
…²∏´ ∏¨·¶·¤ª¨ x zs q| {x qv {t qs z| qt
z {{ qs {y qy {z qs {z qu
粗 线 期 v xs qx {x qx zz qy zt qu
°²¦«¼·¨±¨ x {x qw p p {x qw
双线期 !终变期 v wv qz vu qz wx qy ws qy
⁄¬³¯²·¨±¨ o§¬¤®¬±¨ ¶¬¶ x xw qy wt qw p w{ qs
终变期 !中期 Œ v ts qz y q| p { q{
⁄¬¤®¬±¨ ¶¬¶o ° ·¨¤³«¤¶¨ Œ x w qv p p w qv
中期 Œ!后期 Œ x v qv p p v qv
 ·¨¤³«¤¶¨ Œo¤±¤³«¤¶¨ Œ
213 大花粉比率 !花粉得率与处理次数的关系
从表 u中还可以看出 o在终变期之前处理 o增加注射次数可以获得较高的大花粉比率 o但并不是说
可以无限度地延长作用持续时间 ∀从表 v可知 o随着注射次数的增加 o所取得的花粉比率也随之提高 o
其中以注射 v次提高的幅度最大 o与注射 u次相比 o大花粉百分率提高约达 ws h ∀此后 o注射每增加 t
次 o大花粉百分率增加约 ts h o但超过 x次以后 o提高幅度已不太明显 ∀究其原因 o可能与秋水仙碱在
花芽内发生作用需要累积一定的药剂浓度和维持一定的时间有关 o当注射次数增加到 v次时 o恰好能
满足这一要求 o从而使加倍的花粉比率大幅度提高 ∀
然而 o随着注射次数的增加 o平均每个花序所取得的花粉量却急剧下降 o其中未处理的每序可得 ws
°ª左右花粉 o而在秋水仙注射处理 z ∗ {次时每序仅得约 u °ª∀这主要是由于随着处理次数的增加 o
注射对花芽的机械损伤和药物对花药壁等细胞的毒害加重 o正常生理代谢受到影响 o从而难以为花粉
细胞的正常发育提供保障 o最终进一步影响了花粉的得率 ∀
vu w期 康向阳等 }杨树花粉染色体加倍有效处理时期的研究
在花粉加倍的三倍体育种工作中 o加倍的大花粉的比率和得率是同等重要的 ∀综合这两项指标
看 o只有当注射次数在 v ∗ x次 o大花粉比率较高 o约达 ys h ∗ {s h o而且花粉得率也较多 o为 y ∗ {°ªr
序 o经济而有效 ∀
表 3 秋水仙碱处理次数与大花粉比率和花粉得率的关系
Ταβ .3 Τηερελατιονσηιπσ βετωεεν τηετιµεσ οφ τρεατµεντ ωιτη χολχηιχινε
ανδ τηερατε οφ βιγ πολλεν (2ν) , τηερατε οφ γοττεν πολλεν
注 射 重复 ´ • ³¨¯¬¦¤·¬²±´ 重复 µ • ³¨¯¬¦¤·¬²±µ 总平均 ײ·¤¯ ¤√ µ¨¤ª¨
次 数 大花粉比率 花粉量r序 大花粉比率 花粉量r序 大花粉比率 花粉量r序
• ¤·¨ ²© • ¬¨ª«·²© • ¤·¨ ²© • ¬¨ª«·²© • ¤·¨ ²© • ¬¨ª«·²©
׬° ¶¨²© ¥¬ª³²¯¯¨ ± ³²¯¯¨ ±r¦¤·®¬± ¥¬ª³²¯¯¨ ± ³²¯¯¨ ±r¦¤·®¬± ¥¬ª³²¯¯¨ ± ³²¯¯¨ ±r¦¤·®¬±
¬±­¨¦·¬²± k h l k°ªl k h l k°ªl k h l k°ªl
s s qs wt qs s qs ww qv s qs wv qs
t v qs vy qy t q{ vw qu u qw vx qw
u t| qs tz q{ uy qt us qv uu q{ t| qt
v x{ qx { qy yt qt z qy x| q{ { qt
w zy qu | qu yw q| z qw zs qy { qv
x {v q{ x qw {s qy y qy {u qu y qs
y {w qw t q| ) ) {w qw t q|
z {t qw u qu {z q{ t qz {w qy u qs
{ {{ q{ t qu ) ) {{ q{ t qu
214 加倍效果的早期观测及花粉倍性鉴定
在花粉加倍过程中 o由于始处理时期的差异 !处理过程中管理条件的变化以及处理人员的操作差
异等 o必然会造成处理效果的不同 o因此处理的注射次数也不能一概而论 ∀如在水培 vy «!花序微露时
开始处理 o当第 v次注射后约 z «o可取花药用醋酸洋红染色涂片观察 o此时由于秋水仙碱的抑制作用 o
细胞内染色体极度收缩 o聚集于核内成团状 o醋酸洋红染色明显 o易于观察统计k图版 ´2zl ∀而这种含
有极度收缩染色体细胞的比率往往与最终取得的大花粉比率呈一定的相关 o一般当这种细胞的比率占
{s h ∗ |s h时 o大花粉比率可达 yx h ∗ {x h ∀因此 o可通过镜检观察染色体聚集成团状的细胞比率来
预测花粉加倍效果 o并决定处理的继续或终止 ∀为进一步验证诱导出的大花粉确是未减数的 u±花粉 o
我们还进行了花粉染色体数目检查 o结果表明大花粉中染色体数目明显多于正常单倍体花粉 o有的在
显微镜下甚至可以清楚地计数为 u± € v{k图版 ´2{ o|l ∀此外 o经常规培养基法和活体直接授粉法证
明 o大花粉同普通花粉一样能正常萌发k图版 ´2ts ottl ∀
v 结论
经秋水仙溶液处理所获得的花粉中均有一定比例的形态较大的花粉 o最高可达 {{ h ∀这种大花粉
经花粉染色体检查为 u± € v{ o且均能正常萌发 ∀
毛新杨花粉染色体加倍效果与始处理时期的减数分裂阶段密切相关 ∀一般只要是在水培 ws «左
右 o花序出露 trw以内 o花药由淡绿色转为绿黄色以后且未变红之前处理 o也就是由细线末期到终变期
之前处理 o均能取得较好的效果 ∀增加处理的注射次数可提高花粉中的大花粉比率 o但同时也会造成
花粉得率的下降 ∀综合大花粉的比率和每序花粉得率这两项指标 o处理次数以 v ∗ x次 o每次间隔 x ∗ z
«为宜 ∀花芽经加倍处理后 o其部分花粉细胞的染色体在中期 t会因秋水仙碱的作用而极度收缩聚集
成团状 o易于观察 o这些细胞与最终花粉中的大花粉比率呈正相关 o据此可对加倍效果进行早期观测 ∀
参 考 文 献
董 源 q毛白杨胚胎学观察 ´k花药的结构及花粉发育l q北京林学院学报 ot|{u owkwl }{s ∗ {{
张志毅 o李凤兰 q白杨染色体加倍技术研究及三倍体育种k ´l q北京林业大学学报 ot||u otwk增 vl }xu ∗ x{
朱之悌 q全国毛白杨优树资源收集 !保存和利用的研究 q北京林业大学学报 ot||u otwk增 vl }t ∗ ux
¨ º¬¶ • ‹ q鲍文奎等译 q多倍体在植物和动物中的地位 q贵阳 }贵州人民出版社 ot|{w }tv ∗ vu
¤¶«®¬±¤ ’ ≥ o…∏µ§¤¨ √¤ o…¨ ²¯½¨ µ²√¤   ετ αλ.  ·¨«²§²©²¥·¤¬±¬±ª§¬³¯²¬§³²¯¯¨ ± ²© º²²§¼¶³¨¦¬¨¶q¨¶²√ §¨¨ ±¬¨ ot|{| ot }t| ∗ ux
wu 林 业 科 学 vx卷
康向阳等 }杨树花粉染色体加倍有效处理时期的研究 图版 ´
Ž¤±ª ÷¬¤±ª¼¤±ª ετ αλ. }≥·∏§¼ ²±·«¨ ©¨©¨ ¦·¬√¨·µ¨¤·¬±ª³¨µ¬²§©²µ³²¯¯¨ ± ¦«µ²°²¶²°¨§²∏¥¯¬±ª²© Ποπυλυσ
τοµεντοσα ≅ Π. βολλεανα °¯ ¤·¨ ´
t1 毛新杨减数分裂细线末期 ∀u1 粗线期 ∀ v1 双线期 ∀ w1 终变期 ∀ x1 中期 ´ ∀ y1 加倍诱导取得的混合花粉 o其中大的为 u±花
粉 ∀z1 处理后染色体极度收缩聚集成团 ∀{1 正常单倍体花粉k± € t|l ∀|1 人工加倍的未减数大花粉ku± € v{l ∀ts1 常规培养基法培
养中大花粉与正常花粉萌发 ∀tt1 毛新杨雌蕊柱头上大花粉与正常花粉萌发 ∀
t q׫¨ ±¨§ ²© ¯¨ ³·²·¨±¨ ²© ° ¬¨²¶¬¶²© Π. τοµεντοσα ≅ Π. βολλεανα k¥²∏´ ∏¨·¶·¤ª¨ l q u q °²¦«¼·¨±¨ q v q ⁄¬³¯²·¨±¨ q w q ⁄¬¤®¬±¨ ¶¬¶q x q
 ·¨¤³«¤¶¨ qy q ׫¨ ³²¯¯¨ ± °¬¬·∏µ¨ ¥¼ ° ¤¨±¶²©§²∏¥¯¬±ª·µ¨¤·° ±¨·o¬± º«¬¦«·«¨ ¥¬ªª¨µ³²¯¯¨ ± ªµ¤¬±¶º µ¨¨ ∏±µ¨§∏¦¨§u± ²±¨ ¶qz q× «¨ ¦«µ²°²2
¶²° ¶¨¤ªª¯²° µ¨¤·¨§ ¬¨·µ¨ °¨¯¼ ¤©·¨µ·µ¨¤·¬±ªq{ q ‘²µ°¤¯ ³²¯¯¨ ± ªµ¤¬±kt± € t|l q| q ׫¨ ∏±µ¨§∏¦¨§¥¬ªª¨µ³²¯¯¨ ± ªµ¤¬±ku± € v{l ¥¼ §²∏¥¯¬±ªq
ts q × «¨ ª¨µ°¬±¤·¬²±¶²©·«¨ ¥¬ªª¨µku±l ¤±§±²µ°¤¯kt±l ³²¯¯¨ ± ªµ¤¬±¶¦∏¯·∏µ¨§¬± ·«¨ ¦²°°²± ° §¨¬∏° qtt q ׫¨ ª¨ µ°¬±¤·¬²±¶²© u± ¤±§t±
³²¯¯¨ ± ªµ¤¬±¶²±·«¨ ¶·¬ª°¤²© Π. τοµεντοσα ≅ Π. βολλεανα q