全 文 ：园艺学报，2015，42 (11)：2133–2143.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0269；http：//www. ahs. ac. cn 2133
收稿日期：2015–06–02；修回日期：2015–11–13
基金项目：国家自然科学基金项目（31371866）；浙江省自然科学基金项目（LQ15C00004）；浙江省教育厅攀登计划项目（PD2013328）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yangzf@zwu.edu.cn）
桃果实 PpOAT 和 PpP5CS 的克隆及其对外源
GABA 处理的响应表达
宋春波 1,2，晁青青 2，梁敏华 2，邵佳蓉 2，陈 伟 2，杨震峰 2,*
（1 上海海洋大学食品学院，上海 201306；2浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波 315100）
摘 要：利用 RT-PCR 结合 RACE 技术从‘玉露’桃果实中克隆得到Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶
（P5CS）和鸟氨酸转氨酶（OAT）基因的全长 cDNA 序列，分别命名为 PpP5CS 和 PpOAT（GenBank 登
录号分别为 KP973954 和 KP973956）。PpP5CS 全长 2 511 bp，开放阅读框为 2 151 bp，编码 717 个氨基酸
组成的蛋白质多肽，5′-UTR 长度为 123 bp，3′-UTR 序列长度为 235 bp；PpOAT 全长 1 686 bp，开放阅读
框 1 416 bp，编码 472 个氨基酸，5′-UTR 长度为 151 bp，3′-UTR 序列长度为 119 bp。进化树分析发现，
PpOAT 和 PpP5CS 与湖北海棠的同源性最高，与 MhOAT 和 MhP5CS 的相似性分别达到 88%和 91%。采
用荧光定量 PCR 分析了外源 5 mmol · L-1 GABA 处理对桃果实 0 ℃贮藏期间果实冷害发生和内源脯氨酸
合成关键基因 PpOAT 和 PpP5CS 表达的影响。结果表明，GABA 处理能显著抑制‘玉露’桃果实 0 ℃贮
藏期间果肉出汁率的下降，减轻冷害。通过上调果实中 PpOAT 和 PpP5CS 的表达，提高内源脯氨酸的合
成和积累，进而增强了果实抵抗低温胁迫的能力，可能是外源 GABA 处理减轻桃果实冷害的重要原因。
关键词：桃；果实；PpP5CS；PpOAT；脯氨酸；冷害
中图分类号：S 662.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）11-2133-11

Molecular Cloning of PpOAT and PpP5CS and Their Expression Profile in
Responses to Exogenous GABA in Postharvest Peach Fruit
SONG Chun-bo1,2，CHAO Qing-qing2，LIANG Min-hua2，SHAO Jia-rong2，CHEN Wei2，and YANG
Zhen-feng2,*
（1College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2College of Biological
and Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo，Zhejiang 315100，China）
Abstract：Full-length cDNAs of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase（PpP5CS）and ornithine
aminotransferase（PpOAT）were isolated from peach fruit using degenerate RT-PCR and RACE（rapid
amplification of cDNA ends）method. The sequences of these two genes were then deposited in GenBank
database with the accession number KP973954 and KP973956，respectively. PpP5CS was 2 511 bp in full
length and encoded a predicted protein of 717 amino acids（ORF length 2 151 bp），and flanked by 123
nucleotides at the 5′-UTR and 235 nucleotides at the 3′-UTR. The full length of PpOAT was 1 686 bp with
ORF 1 416 bp，5′-UTR 151 bp and 3′-UTR 119 bp，which encoded a deduced polypeptide of 472 amino
acids. Phylogenetic analysis indicated that PpOAT and PpP5CS shared high similarity with other
Song Chun-bo，Chao Qing-qing，Liang Min-hua，Shao Jia-rong，Chen Wei，Yang Zhen-feng.
Molecular cloning of PpOAT and PpP5CS and their expression profile in responses to exogenous GABA in postharvest peach fruit.
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plants with 88% and 91% homology with MhOAT and MhP5CS，respectively. Furthermore，the effect of
5 mmol · L-1 γ-aminobutyric acid treatment on chilling injury incidence and PpOAT and PpP5CS
expression，which were involved in proline biosynthesis，in postharvest peach fruit stored at 0 ℃ was
investigated. The results showed that 5 mmol · L-1 γ-aminobutyric acid treatment significantly inhibited the
decline of extractable juice，and alleviated chilling injury in peach fruit during cold storage. Meanwhile，
the expression of these two genes in peach fruit was induced by the treatment during cold storage. These
results suggested that γ-aminobutyric acid treatment could increase proline biosynthesis and accumulation
by up-regulating the expression levels of PpOAT and PpP5CS thereby promote chilling tolerance in
cold-stored peach fruit.
Key words：peach；fruit；PpP5CS；PpOAT；proline；chilling injury

桃（Prunus persica）果实为典型的呼吸跃变型，采收后在常温下迅速进入呼吸跃变期，果肉迅
速软化，极易受到机械损伤和病原微生物侵染而导致大量腐烂（Brummell et al.，2004）。低温冷藏
能有效抑制桃果实后熟软化和腐烂，延长贮藏寿命（陈克明 等，2013；陈伟 等，2013）。但桃果实
属于冷敏性水果（Lurie & Crisosto，2005），低温下贮藏易发生冷害，表现为果实色泽暗淡，果心褐
变，果肉粉质化或糠化，汁液减少，失去后熟作用和丧失风味等。研究采后果实对低温胁迫的生理
响应及提高果实采后抗冷性技术，一直是国内外果实采后生理及保鲜技术研究的热点（Sevillano et
al.，2009）。
脯氨酸作为渗透平衡物质和亚细胞结构的保护物质，其含量的高低与采后果蔬的冷敏性密切相
关（Purvis，1981）。低温胁迫下，冷敏感的果蔬组织细胞中蛋白质降解速率大大超过合成速率，造
成蛋白质匮乏和有毒物质的积累；随着蛋白质含量的下降，游离氨基酸与游离氨也随之大量积累，
尤其是脯氨酸含量增加显著。脯氨酸是重要的渗透调节物质，可加强质膜稳定性，提高细胞耐脱水
能力（Verbruggen & Hermans，2008）。Zhang 等（2010）研究发现用精氨酸处理可以提高番茄果实
中脯氨酸的含量，从而增强果实的抗冷性。经甜菜碱处理的黄瓜果实中脯氨酸含量较高，能较好地
维持细胞膜结构的完整性，有效地减轻冷害的发生（张海英 等，2008）。Cao 等（2012）用 10
μmol · L-1MeJA 处理枇杷果实，增强了果实中谷氨酸脱羧酶（GAD）、Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶
（P5CS）和鸟氨酸转氨酶（OAT）活性，抑制脯氨酸脱氢酶（PDH）活性，诱导果实内源脯氨酸和
γ–氨基丁酸（GABA）积累，提高枇杷低温贮藏期间的抗冷性。最近的研究也证实，外源 5
mmol · L-1GABA 处理‘白凤’桃果实，诱导了果实中 GAD、P5CS 和 OAT 活性，提高了果实中内
源 GABA 和脯氨酸的水平，减轻桃果实在 1 ℃贮藏 5 周后冷害的发生（Shang et al.，2011；Yang et
al.，2011）。这表明，适宜浓度的外源 GABA 处理能诱导冷敏果实脯氨酸的积累，从而提高果实的
抗冷性。
植物中脯氨酸的合成有两条途径（Delauney & Verma，1993）：一条是以谷氨酸为底物，经 P5CS
的催化生成谷氨酸半醛，谷氨酸半醛自发环化成吡咯啉–5–羧酸后，经 Δ1–吡咯啉–5–羧酸还原
酶（P5CR）的作用还原生成脯氨酸；另一条是以鸟氨酸为底物在 OAT 的催化下转氨基生成谷氨酸
半醛，谷氨酸半醛自发环化成吡咯啉–5–羧酸后经 P5CR 的作用还原生成脯氨酸。其中，P5CS 与
OAT 分别是谷氨酸途径和鸟氨酸途径中的关键酶，其编码基因和功能已经在拟南芥、甘蔗、豌豆等
植物中得到克隆和证实（Liu & Zhu，1997）。本研究中以‘玉露’水蜜桃果实为材料，利用 RT-PCR
与 RACE 技术分离并克隆了 P5CS 与 OAT 基因全长 cDNA 序列，并对其进行生物信息学分析，通过
宋春波，晁青青，梁敏华，邵佳蓉，陈 伟，杨震峰.
桃果实 PpOAT 和 PpP5CS 的克隆及其对外源 GABA 处理的响应表达.
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实时荧光定量 PCR 分析外源 GABA 处理对上述基因在果实采后低温贮藏期间表达的影响，以期为
揭示 GABA 诱导果实内源脯氨酸积累，进而减轻桃果实冷害发生的分子机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
‘玉露’水蜜桃（Prumus persica L. Batsch.‘Yulu’）果实于 2014 年 7 月 20 日（硬熟期）采自
奉化市水蜜桃研究所实验基地，并在 1 h 内运回实验室。选择大小均匀，成熟度一致的健康果实随
机分为 2 组，每组 60 个，重复 3 次。一组果实于 5 mmol · L-1GABA 溶液中浸泡 10 min，另一组果
实在清水中浸泡 10 min 作为对照。浸泡后的果实自然风晾干后置于 0 ℃环境下放置贮藏，每隔 7 d
取样转置 25 ℃环境下继续贮藏 2 d，即每隔（7 + 2）d 取样，立即测定果实出汁率；取果肉液氮速
冻，置于–80 ℃超低温冰箱储存备用。
1.2 桃果实 RNA 提取及 cDNA 合成
采用改进的植物总 RNA 提取试剂盒（Omega）提取桃果实总 RNA。用无 RNase 活性的 DNaseⅠ
（Omega）去除剩余的基因组 DNA，核酸蛋白仪检测总 RNA 的浓度，1.0%琼脂糖凝胶电泳法检测
总 RNA 的完整性。以总 RNA 为模板，采用 SuperRT cDNA 第一链合成试剂盒（CWBIO）合成 cDNA。
1.3 OAT 和 P5CS 基因全长 cDNA 序列克隆
从 NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）下载桃果实近缘植物 OAT 和 P5CS 基因序列，根据
这些序列利用 Primer Premier 5.0 软件设计简并引物（表 1）。以桃果实 cDNA 第一链为模板，分别以
OATF、OATR 和 P5CSF、P5CSR 为引物扩增中间片段。PpOAT 基因 PCR 扩增程序为：94 ℃预变性

表 1 引物序列
Table 1 Primers sequences
用途 Purpose 引物名称 Primer name 核苷酸序列*（5′→3′） Nucleotide sequence
OATF TCTGCTGTTAACCAAGGACATTGYCAYCCNAA
OATR TCCTCCCAATCGCAAGCNARCATYTTNC
P5CSF GACAAAACTCTCTGATGGCTCTGTAYGAYACNHT
中间片段扩增
Intermediate fragment
amplification
P5CSR GGTGCCCAAATATGAGCATCYTGRTGRAA
5Race-OATR1 AAATCCAGCTATTCTATCTCCATACTCTTCA
5Race-OATR2 TTCAGCACCAGTGTTCATAGGCAGCACCAT
5Race-P5CSR1 CTTTGATGCTTCTCCTTTATGTATGTATGG
5′-RACE PCR 扩增
5′-RACE amplification
5Race-P5CSR2 ATAAACCGTCCACATCACTCAAAAGAACAA
3Race-OATF1 AGGCATTACAAGAACAGGCAGAAAGGCTCA
3Race-OATF2 TGAGGCTATTATTGTCTCGTGTTGTGGCTGCTT
3Race-P5CSF1 TCTTGTTCTTTTGAGTGATGTGGACGGTTTA
3′-RACE PCR 扩增
3′-RACE amplification
3Race-P5CSF2 GTGGGTATGCTCCGGGAAACCTCAGTAAAG
fOATF ATGGTGCTGCCTATGAAC
fOATR GCTGAATCTGGAGTAACTGA
fP5CSF CAGAGGCTTAGATACAGGAA
全长 cDNA 扩增
Full-length cDNA amplification
fP5CSR CGATAACGCAATCAGTATGT
qOATF
qOATR
CCTTATTGCCTGGACATCT
CAGCCTCTCCTTGAATGG
定量 PCR 引物
Primer for Quantitative PCR
qP5CSF
qP5CSR
CGCATCGTTCTCAAGGTT
GCTCCTGATGACACCAATA
内参引物
Reference Primer
TEF2F
TEF2R
GGTGTGACGATGAAGAGTGATG
TGAAGGAGAGGGAAGGTGAAAG
* H = A/T/C；V = G/A/C；R = A/G；Y = C/T；N = A/T/C/G。
Song Chun-bo，Chao Qing-qing，Liang Min-hua，Shao Jia-rong，Chen Wei，Yang Zhen-feng.
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5 min；94 ℃变性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，进行 33 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min；4 ℃
保存。PpP5CS 基因的退火温度为 50 ℃。
利用 Primer Premier 5.0 软件和上述克隆得到的中间片段序列设计 OAT 和 P5CS 基因的 5′-RACE
和 3′-RACE 特异引物（表 1），利用 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒（Clontech）进
行嵌套 PCR 反应以获得目的基因的 5′–末端序列，利用 3′-Full RACE Core Set 试剂盒（TaKaRa）进
行 PCR 反应获得目的基因的 3′–末端序列。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，将目的条带切
下并使用 TIANgel Midi Purification 试剂盒（TIANGEN）回收目的片段。回收纯化后的 PCR 产物连
接到 pMD18-T（TaKaRa）载体上进行克隆并转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞（TaKaRa），经 PCR
鉴定和酶切鉴定后挑选合适的重组质粒送上海立菲生物技术公司测序。利用 DNAMAN5.2.2 软件对
测序得到的 OAT 和 P5CS 序列进行拼接得到全长 cDNA 序列。
1.4 生物信息学分析
利用 NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）的 Blastx 程序对 PpOAT 和 PpP5CS 全长 cDNA
序列进行比对分析，根据比对结果确定该基因是否为全长基因；用 ORF Finder 程序寻找基因的开放
阅读框，并对 ORF 的氨基酸序列进行 Blast 比对，验证所获得的 ORF 的正确性。利用 TMPRED（http：
//www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html）对基因编码的氨基酸序列进行跨膜区预测。用
GeneDoc 软件进行基因同源性序列的多序列分析，采用 MEGA5.1 软件绘制分析进化树。
1.5 实时荧光定量 PCR 分析
以反转录后的 cDNA 为模板，根据 PpOAT 和 PpP5CS 基因全长序列采用 Primer Premier 5.0 软
件设计荧光定量 PCR 引物（表 1），以桃果实 PpTEF2 为内参基因，研究外源 GABA 处理对 PpOAT
和 PpP5CS 表达的影响。采用 SYBR Green 荧光染料法进行相对荧光定量 PCR 反应，操作步骤参照
DyNAmo Flash SYBR Green qPCR 试剂盒（Thermo）的说明书进行。PpOAT 的 qPCR 程序为：95 ℃
初始热变性 7 min，95 15 s℃ ，57 ℃退火 30 s，重复 40 个循环，PpP5CS 的退火温度为 56 ℃。qRT-PCR
的数据分析采用 2-ΔΔCT 方法，每个样品设置 4 次生物学重复。
1.6 果肉出汁率与脯氨酸含量的测定
参考 Shang 等（2011）的方法，称取 10 g 果肉块（直径 6 mm，厚 6 mm）装入垫有吸水棉的离
心管中，1 500 × g 离心 10 min，以果实离心后的失重率作为果实的出汁率。脯氨酸含量采用茚三酮
比色法测定，随机取果肉样品 1 g，加入 5 mL 3%磺基水杨酸溶液进行匀浆，沸水浴 10 min，冷却后
4 ℃下 3 000 × g 离心 10 min，随后依次加入 2 mL 冰醋酸和 2 mL 茚三酮试剂，涡旋振荡数秒后，沸
水浴 30 min。最后加入甲苯 5 mL 振荡，静置分层吸取甲苯层在 520 nm 处测吸光值。用脯氨酸标准
液制定标准曲线，计算果实中脯氨酸含量，结果以 μg · g-1 FW 表示。
2 结果与分析
2.1 基因克隆与序列分析
经 RNA 提取、反转录、简并 PCR 扩增获得 PpOAT 基因的的中间片段，长为 600 bp。利用该片
段序列设计 RACE 引物，通过 3′-RACE 和 5′-RACE 技术克隆分别得到 1 条长度为 1 225 bp 的序列
和 645 bp 的序列，使用 DNAMAN5.2.2 软件将 3 条序列进行拼接获得 1 条长度为 1 686 bp 的全长
宋春波，晁青青，梁敏华，邵佳蓉，陈 伟，杨震峰.
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cDNA 序列。序列分析表明，该序列 ORF 序列长 1 416 bp，编码由 472 个氨基酸组成的蛋白质多肽，
5′-UTR 长度为 151 bp，3′-UTR 序列长度为 119 bp。Protparam tool 预测该多肽分子量为 52.1388 kD，
等电点为 6.35。经 Blastp 比对表明，克隆基因编码的氨基酸与其他植物 OAT 基因编码的氨基酸序
列具有很高的同源性（图 1），其中与湖北海棠 MhOAT、葡萄 VvOAT、茶 CsOAT 和蓖麻 RcOAT 的
同源性分别为 88%、84%、83%、83%和 81%，表明新克隆得到的 cDNA 序列为桃果实鸟氨酸转氨
酶基因 PpOAT，GenBank 登录号为 KP973954。


图 1 桃果实 PpOAT 的氨基酸序列比对
PpOAT：桃 KP973954；MhOAT：湖北海棠 NP_001288848；AtOAT：拟南芥 NP_199430；CsOAT：茶 AIC77166；RcOAT：蓖麻 XP_002519647；
NtOAT：烟草 ADM47437；VvOAT：葡萄 NP_001268069；PmOAT：辽杨 ACQ66335；GmOAT：大豆 NP_001237150；
BnOAT：欧洲油菜 ACA63476。星形标记代表磷酸吡哆醛结合位点中的 8 个氨基酸残基。
Fig. 1 Alignment of the deduced PpOAT amino acid sequence of PpOAT with other plants
PpOAT：Prunus persica KP973954；MhOAT：Malus hupehensis NP_001288848；AtOAT：Arabidopsis thaliana NP_199430；CsOAT：Camellia
sinensis AIC77166；RcOAT：Ricinus communis XP_002519647；NtOAT：Nicotiana tabacum ADM47437；VvOAT：Vitis vinifera NP_001268069；
PmOAT：Populus maximowiczii ACQ66335；GmOAT：Glycine max NP_001237150；BnOAT：Brassica napus ACA63476.
Asterisk stand for pyridoxal phosphate binding site.

PpP5CS 基因的简并引物通过 PCR 扩增获得了 1 条 572 bp 的中间片段。利用该片段序列设计引
物，通过 3′-RACE 和 5′-RACE 技术克隆分别得到 1 条长度为 1 707 bp 的序列和 584 bp 的序列，拼
接后得到 1 条长度为 2 511 bp 的全长 cDNA 序列。ORF Finder 分析出该序列 ORF 序列长 2 151 bp，
Song Chun-bo，Chao Qing-qing，Liang Min-hua，Shao Jia-rong，Chen Wei，Yang Zhen-feng.
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编码由 717 个氨基酸组成的蛋白质多肽，5′-UTR 长度为 123 bp，3′-UTR 序列长度为 235 bp。Protparam
tool 预测该多肽分子量为 77.6629 kD，等电点为 6.31。Blast 比对结果（图 2）显示，克隆基因编码
的氨基酸与其他植物 P5CS 基因编码的氨基酸序列具有很高的同源性，与湖北海棠 MhP5CS（Malus

图 2 桃果实 PpP5CS 的氨基酸序列比对
Ⅰ为ATP结合位点，Ⅱ为假想的亮氨酸保守域，Ⅲ为谷氨酸激酶保守域，Ⅳ为NADPH结合保守域，Ⅴ为谷氨酸—半醛脱氢酶保守域。PpP5CS：
桃 KP973956；MhP5CS：湖北海棠 AEO51062；BnP5CS：苎麻 AEV46825；GaP5CS：树棉 ACI62865；MnP5CS：川桑 EXC19384；JcP5CS：
麻疯树 ADK37758；CmP5CS：马泡瓜 AEO27874；TcP5CS：可可 XP_007009199；CmP5CS：笋瓜 AEN04066；RcP5CS：蓖麻 XP_002524230。
Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequence of PpP5CS with other plants
Ⅰ：ATP-binding site；Ⅱ：Putative Leu domain；Ⅲ：Conserved Glu-5- kinase；Ⅳ：NADPH- binding domain；Ⅴ：Conserved GSA-DH domain.
PpP5CS：Prunus persica KP973956；MhP5CS：Malus hupehensis AEO51062；BnP5CS：Boehmeria nivea AEV46825；GaP5CS：Gossypium
arboreum ACI62865；MnP5CS：Morus notabilis EXC19384；JcP5CS：Jatropha curcas ADK37758；CmP5CS：Cucumis melo AEO27874；TcP5CS：
Theobroma cacao XP_007009199；CmP5CS：Cucurbita maxima AEN04066；RcP5CS：Ricinus communis XP_002524230.
宋春波，晁青青，梁敏华，邵佳蓉，陈 伟，杨震峰.
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hupehensis，AEO51062）、树棉 GaP5CS（Gossypium arboreum，ACI62865）、苎麻 BnP5CS（Boehmeria
nivea，AEV46825）、蓖麻 RcP5CS（Ricinus communis，XP_002524230）和可可 TcP5CS（Theobroma
cacao，XP_007009199）基因的同源性分别为 91%、87%、86%、85%和 85%，表明这个新克隆的
cDNA 序列为桃果实 Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶基因 PpP5CS，GenBank 登录号为 KP973956。
2.2 生物信息学分析
利用 NCBI 数据库的 CDD 软件对 PpOAT 的结合位点和结构域进行分析，表明 PpOAT 属于天冬
氨酸转氨酶超家族磷酸吡哆醛依赖酶，具有催化转氨作用的关键部位磷酸吡哆醛（PLP）结合位点
由（G142A143F177H178E234D265Q268K294）8 个氨基酸残基构成，其中 294 位的赖氨酸是催化中心（图 1）。
利用 GENEDOC 软件对 PpOAT 氨基酸序列与 9 种其他真核生物 OAT 氨基酸序列进行多重序列比对
分析，发现其一致性高达 70%，说明预测的初级结构与其他真核生物 OAT 具有较高同源性，主要
功能域在进化上比较保守。根据 TMPRED（http：//www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html）
预测模型分析，N 末端位于膜内，在 167 ~ 184 位和 288 ~ 308 位形成两个可能的跨膜螺旋，其中
167 ~ 184 位氨基酸跨膜方向由内向外，288 ~ 308 位氨基酸跨膜方向由外向内，推测 PpOAT 基因编
码的蛋白为跨膜蛋白。
利用 NCBI 数据库的 CDD 软件对 PpP5CS 的结合位点和结构域进行分析，表明 PpP5CS 多肽的
N 端为氨基酸激酶（AAK）超家族成员 G5K 结构域，含有 ATP 结合位点、磷酸结合位点和脯氨酸
的变构结合位点，G5K 催化 ATP 释放能量并转移末端磷酸基团给 L-Glu 生成谷氨酰磷酸（CGP）；
C 端为醛脱氢酶（ALDH-SF）超家族 C–谷氨酸磷酸还原酶（GPR 等同于 GSADH）结构域，催化
NADPH 传递氢给 CGP 生成 GSA（图 2）。多重序列比对分析，发现其保守区域一致。P5CS 蛋白保
守结构域包含 5 个主要功能域：谷氨酰激酶（γ-GK）保守域、谷氨酸–γ–半醛脱氢酶（GSADH）
保守域、一个假设的亮氨酸保守域及 ATP 结合位点和 NADPH 结合位。根据 TMPRED 模型分析，N
末端位于膜外，在 51 ~ 70 位和 247 ~ 267 位形成两个可能的跨膜螺旋，其中 51 ~ 70 位氨基酸跨膜
方向由外向内，247 ~ 267 位氨基酸跨膜方向由内向外，推测 PpP5CS 基因编码的蛋白也为跨膜蛋白。
2.3 系统进化树分析
选择 14 个与 PpOAT 编码的氨基酸同源性较高的 OAT 氨基酸序列，利用 MEGA6 构建邻接法
NJ（Neighbor joining）系统进化树（图 3）。桃果实 PpOAT 编码蛋白与其近缘湖北海棠 MhOAT（Malus


图 3 PpOAT 与其他植物 OAT 蛋白的系统进化关系
Fig. 3 Phylogenetie relatedness among PpOAT and other OAT proteins in plants
Song Chun-bo，Chao Qing-qing，Liang Min-hua，Shao Jia-rong，Chen Wei，Yang Zhen-feng.
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hupehensis）编码蛋白之间的亲缘关系最近，在同一分支，可能为直系同源蛋白；其次与双子叶植物
葡萄 VvOAT（Vitis vinifera）亲缘关系较近，而与双子叶植物大豆（Glycine max）、蒺藜苜蓿（Medicago
truncatula）和裸子植物欧洲赤松（Pinus sylvestris）的亲缘关系最远。
选择 30 个与 PpP5CS 编码的氨基酸同源性较高的 P5CS 氨基酸序列构建系统进化树（图 4）。结
果表明，桃果实 PpP5CS 与湖北海棠 MhP5CS（Malus hupehensi）的亲缘关系最近，遗传距离也最
近，可能为直系同源蛋白；双子叶植物苎麻 BnP5CS（Boehmeria nivea）、树棉 GaP5CS（Gossypium
arboreum）、川桑 MnP5CS（Morus notabilis）与同为双子叶植物的桃果实 PpP5CS 距离较近；而与
单子叶植物甘蔗 ShcP5CS（Saccharum hybrid cultivar）和斑茅 SaP5CS（Saccharum arundinaceum）
亲缘关系最远。


图 4 PpP5CS 与其他植物 P5CS 蛋白的系统进化关系
Fig. 4 Phylogenetie relatedness among PpP5CS and other P5CS proteins in plants

2.4 GABA 处理对 PpOAT 和 PpP5CS 表达的影响
5 mmol · L-1 GABA 处理和对照桃果肉在 0 ℃贮藏 7 d 后置 25 ℃贮藏 2 d 过程中，PpOAT 表达水
平略有下降，随后，GABA 处理果实 PpOAT 表达逐渐增强，并且在 0 ℃贮藏 21 d 25 ℃贮藏 2 d 时
达到最高水平，然后开始下降（图 5，A）。在贮藏 14 ~ 35 d 过程中，GABA 处理果实中 PpOAT 的
表达量显著高于对照果实（P ≤ 0.01），这表明外源 GABA 处理能上调 PpOAT 的表达。
对照果实 PpP5CS 的表达量在整个贮藏期间无显著变化（图 5，B），而 5 mmol · L-1 GABA 处理
能诱导果实中 PpP5CS 的表达增强，使得果实在整个贮藏期间 PpP5CS 的表达量显著高于对照（P ≤
0.05），随后 PpP5CS 的表达逐渐降低。说明外源 GABA 处理能维持桃果实采后低温贮藏期间较高的
PpP5CS 表达水平。
宋春波，晁青青，梁敏华，邵佳蓉，陈 伟，杨震峰.
桃果实 PpOAT 和 PpP5CS 的克隆及其对外源 GABA 处理的响应表达.
园艺学报，2015，42 (11)：2133–2143. 2141



图 5 GABA 处理对桃果肉在冷害温度下 PpOAT（A）和 PpP5CS（B）表达量的影响
Fig. 5 Effect of GABA treatment on expression of PpOAT（A）and PpP5CS（B）in peach flesh at chilling injury temperature

2.5 GABA 处理对出汁率及脯氨酸含量的影响
GABA 处理和对照果实出汁率均呈现先上升后下降趋势（图 6，A），在 0 ℃贮藏 14 d 后转置
25 ℃下 2 d 时出汁率达到最大值，之后逐渐下降，但 5 mmol · L-1GABA 处理显著高于对照（P ≤
0.05）。受到低温逆境胁迫，对照桃果实 0 ℃贮藏 21 d 期间脯氨酸含量逐渐积累，随后逐渐下降（图
6，B）；GABA 处理在贮藏前 14 d 与对照无显著差异，贮藏后期显著高于对照（P ≤ 0.01）。果实 0 ℃
贮藏 35 d 后转置 25 ℃下 2 d 时，GABA 处理果实中脯氨酸含量为 9.2 μg · g-1 FW，是对照果实脯氨
酸含量的 1.44 倍。



图 6 GABA 处理对桃果实出汁率（A）和脯氨酸含量（B）的影响
Fig. 6 Effect of GABA treatment on extractable juice rate（A）and proline content（B）of peach fruit
3 讨论
本研究中以‘玉露’水蜜桃果实为材料，对几种桃近缘植物 OAT 和 P5CS 基因序列进行多重比
对，设计简并引物，克隆得到了分别编码 OAT 和 P5CS 基因的 cDNA 全长序列。同源性比较分析发
现，PpOAT 和湖北海棠的同源性最高达 92%，PpP5CS 基因编码的基酸序列与已知的 30 种植物 P5CS
基因的氨基酸序列同源性均较高，这说明这两个基因在物种进化上具有高度的保守性；结构域分析
表明，PpOAT 蛋白初级结构由非保守的 N 末端、PLP 结合区域和 C 末端 3 部分组成，其中 N–端
Song Chun-bo，Chao Qing-qing，Liang Min-hua，Shao Jia-rong，Chen Wei，Yang Zhen-feng.
Molecular cloning of PpOAT and PpP5CS and their expression profile in responses to exogenous GABA in postharvest peach fruit.
2142 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (11)：2133–2143.
氨基酸残基的变异较大，表明 N–端前肽序列可能具备线粒体转运肽的基本特征。已有研究证实，
除酵母外，所有动物和植物的鸟氨酸转氨酶都是由核基因编码，并在细胞质中合成蛋白质后利用其
转运肽序列进行线粒体定位。PpP5CS 与其他植物 P5CS 具有相同的高度保守区域，包括谷氨酸激酶
保守域、谷氨酸—半醛脱氢酶保守域、ATP 和 NADPH 结合域；跨膜区预测 PpOAT 和 PpP5CS 蛋白
均为跨膜蛋白，有两个可能的跨膜区；系统进化分析表明，PpOAT 和 PpP5CS 与湖北海棠 MhP5CS
可能是直系同源基因。
低温贮藏期间果肉出汁率是评价桃果实低温贮藏冷害发生的重要指标之一（Cao et al.，2012）。
桃果实采后常温（25 ℃）贮藏 2 ~ 3 d，果实能正常后熟，表现为果实质地软化，出汁率增加；随着
低温贮藏时间的延长，果肉质地发绵，果实汁液明显减少而发生絮状败坏，呈现出典型的冷害症状
（陈克明 等，2013；陈伟 等，2013）。本试验结果发现，5 mmol · L-1 GABA 处理能显著抑制‘玉
露’桃果实 0 ℃贮藏期间果肉出汁率的下降，这表明适宜浓度的外源 GABA 处理能减轻桃果实低温
长时间贮藏过程中冷害的发生。前期的研究也已经证实，外源 5 mmol · L-1 GABA 处理诱导了‘白
凤’桃果实中 GAD、P5CS 和 OAT 酶活性，提高了内源 γ–氨基丁酸和脯氨酸的水平，减轻桃果实
在 1 ℃贮藏 5 周后冷害的发生（Shang et al.，2011；Yang et al.，2011）。这表明，适宜浓度的外源
GABA 处理能诱导冷敏果实脯氨酸的积累，从而提高果实的抗冷性。
植物体内游离脯氨酸的积累是植物对低温胁迫下的一种适应性反应（Verbruggen & Hermans，
2008）。谷氨酸途径和鸟氨酸途径是植物合成内源脯氨酸的主要方式，而这两条途径的主要区别在于
初始底物分别为谷氨酸和鸟氨酸，限速关键酶分别是 P5CS 和 OAT。研究表明，烟草在渗透胁迫后
期 OAT 基因的上调表达促进了脯氨酸的积累，提高了烟草在渗透胁迫下的耐受性（Hong et al.，
2000）；而干旱、高盐及重金属等逆境胁迫下植物细胞中 P5CS 基因的表达水平提高能增强了植株抵
抗逆境的能力（Lutts et al.，1999；Lin et al.，2002；Ruiz et al.，2002；Thippeswamy et al.，2010）。
将 OAT 和 P5CS 分别转入烟草植株中发现，转基因烟草植株中脯氨酸含量显著提高，同时转基因烟
草的耐盐性增强（Hong et al.，2000）。Cao 等（2012）研究发现，10 μmol · L-1 茉莉酸甲酯处理能提
高枇杷果实 1 ℃贮藏期间 P5CS 和 OAT 酶活性，增加内源 GABA 和脯氨酸的积累，进而减轻果实
冷害的发生；采前 5 mmol · L-1 外源草酸处理能提高杧果果实采后 P5CS 活性和脯氨酸含量，显著抑
制果实贮藏冷害的发生；Wang 等（2014）的研究也证实，20 mmol · L-1GABA 处理能显著提高香蕉
果实采后P5CS活性和脯氨酸的积累，进而抑制果实 7 ℃贮藏期间冷害的发生。本研究中，5 mmol · L-1
GABA 处理显著提高了‘玉露’桃果实中 PpOAT 和 PpP5CS 表达，且表达水平的提高与果实中脯氨
酸的积累一致。这表明，外源GABA处理能通过上调脯氨酸合成途径中关键酶基因PpOAT和PpP5CS
的表达水平，增强果实内源脯氨酸的合成和积累，这可能是 GABA 通过调控内源脯氨酸合成进而减
轻果实冷害发生的重要原因。但外源 GABA 处理是同时影响桃果实中谷氨酸途径和鸟氨酸途径，还
是影响其中一条途径为主仍不清晰，有待进一步研究。
综上所述，适宜浓度的 GABA 处理（5 mmol · L-1）上调了桃果实中 PpOAT 和 PpP5CS 的表达，
提高了果实采后低温贮藏期间内源脯氨酸含量的积累，进而增强了果实抵抗低温胁迫的能力，减轻
了桃果实低温贮藏期间冷害的发生。同时也发现，桃果实 PpOAT 和 PpP5CS 对低温胁迫的响应并不
一致，目前仍缺乏直接的证据证实外源 GABA 处理与内源脯氨酸合成之间的直接联系。今后将通过
RNAi 和超表达技术，进一步研究 PpOAT 和 PpP5CS 在果实冷害发生中的变化，为揭示 GABA 减轻
果实冷害发生的作用机制提供理论依据。

宋春波，晁青青，梁敏华，邵佳蓉，陈 伟，杨震峰.
桃果实 PpOAT 和 PpP5CS 的克隆及其对外源 GABA 处理的响应表达.
园艺学报，2015，42 (11)：2133–2143. 2143

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