全 文 ：园艺学报，2015，42 (12)：2497–2504.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0098；http：//www. ahs. ac. cn 2497
枳橙CPMAX2 基因的克隆、载体构建及其表达
研究
袁飞荣 1,2，袁耀明 2,3，李智鑫 2,3，Alessandra Gentile4，邓子牛 5,*
（1武汉生物工程学院园林系，武汉 410415；2 武汉生物工程学院应用生物技术研究中心，武汉 430415；3武汉生物
工程学院生命科学与技术学院，武汉 430415；4 Catania University，Dipartimento Diortofloroarboricolturae Tecnologie
Agroalimentari，Catania 95123，Italy；5国家柑橘改良中心长沙分中心，长沙 410128）
摘 要：转 rolABC 基因枳橙莲座状分枝、矮化性状突出。为探索其侧枝生长的植物激素调控机制，
通过 RT-PCR 法从枳橙中克隆到独脚金内酯信号转导关键元件 CPMAX2 基因，分析了该基因在转 rolABC
基因枳橙腋生嫩叶中的转录表达，构建了 CPMAX2 植物过表达载体。研究表明：CPMAX2 与甜橙中同源
基因一致性为 99.66%，编码 694 个氨基酸，具有一个典型的 F-box 蛋白结构域和两个 LRR 重复区，与甜
橙 MAX2 氨基酸序列一致性为 99.14%。CPMAX2 在转 rolABC 基因枳橙 3 个株系腋生嫩叶中的转录表达
均比野生型显著下调。试验表明 CPMAX2 在转 rolABC 基因枳橙莲座型分枝生长中扮演重要角色。
关键词：柑橘；独脚金内酯；CPMAX2；腋芽萌发
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）12-2497-08

Cloning，Constructing the Over-expression Vector and Expression Analysis
of CPMAX2 in Transgenic Citrange with rolABC Genes
YUAN Fei-rong1,2，YUAN Yao-ming2,3，LI Zhi-xin2,3，Alessandra Gentile4，and DENG Zi-niu5,*
（1Department of Landscape Architecture，Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，China；2 Center of Applied
Biotechnology，Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，China；3 College of Life Science and Technology，Wuhan
Bioengineering Institute，Wuhan 430415，China；4 Dipartimento Diortofloroarboricolturae Tecnologie Agroalimentari，
Catania University，Catania 95123，Italy；5 National Center of Citrus Improvement，Changsha Subcenter，Changsha
410128，China）
Abstract：Transgenic citrange lines with rolABC genes behave resset branching and extreme
dwarfing. To explore the regulatory mechanism of plant hormones in axillary shoot growth of transgenic
citrange，a full length cDNA of CPMAX2 was cloned from citrange[Citrus sinensis（L.）Osb × Poncirus
trifoliate（L.）Raf.] by RT-PCR in this study. The expression of CPMAX2 was detected in axillary tender
leaves of 3 transgenic citrange lines and the wild type；Additionally，we constructed an over-expression
vector CPMAX2-pCAMBIA1301 for further study. The results showed that the cDNA sequence and its
putative peptide sequence shared 99.66% and 99.14% of identity with its citrus sinensis ortholog MAX2.
The deduced amino acid sequence contained putatively one F-box and two LRR repeat domains that are

收稿日期：2015–08–18；修回日期：2015–12–14
基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（31301750）；国家‘863’计划项目（2011AA100205）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：deng7009@163.com）
Yuan Fei-rong，Yuan Yao-ming，Li Zhi-xin，Alessandra Gentile，Deng Zi-niu.
Cloning，constructing the over-expression vector and expression analysis of CPMAX2 in transgenic citrange with rolABC genes.
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highly conserved in MAX2 genes. CPMAX2 was obviously down-expressed in tender leaves of 3 transgenic
citrange lines compared with the wild type. The results suggest CPMAX2 play an important role in
regulating the rosette shoot growth in transgenic citrange with rolABC genes.
Key words：citrus；strigolactone；CPMAX2 gene；axillary bud outgrowth

近年来，一种新型植物激素独脚金内酯（strigolactones，SLs）被发现（Gomez-Roldan et al.，2008），
该植物激素合成于根部，通过 MAX2 信号转导参与侧芽生长发育的调控（Nelson et al.，2011）。MAX2
（More Axillary Growth 2）编码定位于核内的亮氨酸重复 F-box 蛋白，在光形态建成（Shen et al.，
2007）、非生物胁迫（Bu et al.，2014）及 SLs 的信号转导等多方面发挥重要作用（Chevalier et al.，
2014）。MAX2 通过形成 SCF（SKP1/Cullin/F-box）蛋白酶复合体降解靶标蛋白，实现对下游响应基
因的调节，进而发挥抑制侧芽萌发的功能（Stirnberg et al.，2007）。研究发现，水稻中 SLs 和油菜素
内酯（brassinosteroid，BR）信号交叉，通过同一转录因子 BES1 间接调控侧枝发育。MAX2 与底物
BES1 互作调控 SLs 下游响应基因的表达，根系合成的 SLs 结合受体蛋白 D14 在 SCFmax 复合体作用
下可促进 BES1 的降解，并证实 BES1 基因的沉默对 max2 突变体的多分枝表型有显著的抑制效应
（Wang et al.，2013）。SCFMax2 复合体的另一个降解对象是类似分子伴侣 SMXL 家族的 D53 蛋白，
D53 是 SLs 信号转导重要的负调控者（Jiang et al.，2013），该蛋白的主要功能是在细胞核作用于 TPR
并形成复合物，阻遏 SLs 信号途径下游效应基因的表达。水稻中与 MAX2 同源的基因是 d3，d3、d53
的水稻单突变体和双突变体都表现矮化和大量分蘖，但通过 RNA 干扰下调 d3 水稻突变体中 d53 的
表达能部分恢复野生型性状（Zhou et al.，2013）。近来研究证实 MAX2 调控降解一类 DELLA 级的
转录因子，并参与 GA 信号转导的调控（Nakamura et al.，2013）。植物侧枝生长发育是由多种植物
激素协同调控的，MAX2 可能是多种植物激素信号转导通路共用的关键因子。转 rolABC 基因枳橙
分枝剧增，节间缩短（胡春华 等，2006），过去已证实其用作砧木具有诱导甜橙和沙田柚矮化的效
应（袁飞荣，2011），但有关该砧木莲座状分枝的分子机制还不明确。本研究中通过克隆枳橙中的
CPMAX2 基因，分析该基因在转 rolABC 基因枳橙中的表达情况，并成功构建了 CPMAX2 基因植物
过表达载体，为下一步探索其功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 RNA的提取和分枝调查
本试验所用的转 rolABC 基因 Troyer 枳橙 B、D、E 系及野生型种植在国家柑橘改良中心长沙分
中心温室（N 28°10′47.10″，E 113°04′36.88″），2014 年 4 月枳橙大量萌芽阶段，每处理取 10 个枝梢，
每枝取腋生嫩叶 1 ~ 2 片，分别混合后用液氮研磨 3 ~ 4 次，Trizol 法提取总 RNA，经 DNase 消化处
理，电泳检测 28S︰18S > 1，立即合成 cDNA。7 月，从 RNA 提取植株中每处理选取 30 个当年生健
康的枝梢挂牌，调查其春梢段（皮质鲜绿，老枝和夏梢之间的一段当年生枝梢）上的分枝数。
1.2 cDNA的合成
用日本岛津公司紫外分光光度计 UV-1800 调整各样品浓度一致，参照 TaKaRa Reverse
Transcriptase M-MLV kit 说明书合成 cDNA。0.2 mL PCR 管中依次添加 3 μL RNA（约 2 μg），0.5 μL
Oligo DT18 随机引物，11.5 μLDEPC 水。然后将样品于 72 ℃处理 5 min，转至冰浴迅速冷却。立即
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取出 PCR 管，再依次加入 5 μL 缓冲液（5×），3 μL dNTP 混和液，0.5 μL RNase 抑制剂（30 U · L-1），
0.5 μL M-MLV RTase（200 U · L-1），DEPC 水补足到 25 μL。PCR 仪中 42 ℃处理 60 min，95 ℃下加
热 5 min 终止反应，获得的产物–20 ℃保存备用。
1.3 枳橙CPMAX2 克隆及qRT-PCR分析
以上述 cDNA 为模板，PCR 反应体系 15 µL：ddH2O 3.75 µL，缓冲液（10×）1.5 µL，MgCl2（25
µmol · L-1）1.5 µL，dNTP（1 µmol · L-1）3 µL，上游、下游引物（2.5 µmol · L-1）各 1.5 µL（表 1），
cDNA（20 ng · L-1）2 µL，Taq 酶（1 U · µL-1）0.25 µL。94 ℃变性 5 min 后于 94 ℃ 30 s，55 ℃ 1
min 30 s，72 ℃ 1 min，循环 35 次，最后 72 ℃ 10 min。PCR 产物在 1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶
成像系统分析，切胶后回收（AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒）。TA–克隆法将其连接至 pUCm-T 载
体（pUCm-T Vector Cloning Kit），送上海生工生物工程有限公司测序，采用 DNAMAN8.0，MEGA5.1
对 CPMAX2 序列进行生物信息学分析。BglⅡ和 BstEⅡ双酶切 pCAMBIA1301 质粒及 T 载体，T4 连
接酶连接，获得 CPMAX2-pCAMBIA1301 重组质粒。采用美国应用生物技术公司 ABI 7500 荧光定
量 PCR 仪，SYBR GreenⅠ法（ABI，Power SYBR® Green PCR Mix）进行 qRT-PCR 分析。其中 20 µL
反应体系为：Power SYBR® Green PCR Mix（2×）10.0 µL，上游引物（2.5 µmol · L-1）、下游引物（2.5
µmol · L-1）各 1.5 µL（表 1），cDNA 1.5 µL，ddH2O 5.5 µL，每样本设置 3 个重复，并设置 NTC 空
白对照。qRT-PCR 反应条件：第一步 95 ℃ 30 s；第二步 95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40
个循环。在 72 ℃延伸步骤收集荧光信号，采用 2-ΔΔCt法进行相对定量分析（Kenneth & Thomas，2001）。
表 1 CPMAX2 基因克隆及 qRT PCR 分析引物序列
Table 1 The primers of CPMAX2 cloning and qRT-PCR analysis
基因
Gene name
引物
Primer

用途
Application
CPMAX2 F 5′-TTTAGATCTTTTTACTCATCGCCCACCT-3′
R 5′-TCCGGTTACCCGAAATCGTTCATGCCTCT-3′
全长 cDNA 扩增
Full-length cDNA amplification
CPMAX2 F 5′-ACCAACTGTCCGAAACTGA-3′
R 5′-AATGAGCCTACGACACCC-3′
qRT-PCR
β-actin F 5′-CACACTGGAGTGATGGTTGG-3′
R 5′-ATTGGCCTTGGGGTTAAGAG-3′
qRT-PCR
2 结果与分析








图 1 枳橙 CPMAX2 基因 RT-PCR 扩增产物电泳
1、2：CPMAX2 基因扩增产物，M：分子量标记 DL5000。
Fig. 1 Electrophoresis of RT-PCR products for
cloning of CPMAX2
1，2：RT-PCR products of CPMAX2；M：DL5000 DNA marker.
2.1 枳橙CPMAX2 基因的克隆及序列分析
RT-PCR 克隆到 CPMAX2 的序列长度为
2 297 bp（图 1）。对测序获得的序列进行生物
信息学分析得知，该序列包含独脚金内酯信号
转导关键元件 CPMAX2 的 CDS 全长 2 085 bp
（GenBank 登录号 KT376470），与公布的甜橙
基因组的 MAX2 基因序列一致性达到 99.66%，
翻译 694 个氨基酸，在 9 ~ 50 处具有典型的
F-Box 蛋白结构域，在 346 ~ 371、372 ~ 379
存在两个 LRR 重复区（图 2），与甜橙 MAX2，
基因编码的氨基酸序列一致性为 99.14%。

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图 2 枳橙 CPMAX2 氨基酸序列的分析
红色区代表 F-box 结构域，蓝色区为两个 LRR 重复区。
Fig. 2 Analysis the amino acid sequence of CPMAX2 from citrange
Red represents F-box demain. Blue represents two LRR repeat demains.
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图 3 BglⅡ和 BstEⅡ双酶切 CPMAX2-pCAMBIA1301
质粒电泳结果
Fig. 3 Electrophoresis results of CPMAX2-pCAMBIA 1301
digest by BglⅡ and BstEⅡ

2.2 枳橙CPMAX2 基因植物过表达载体的构
建
利用引物中引入的 BglⅡ和 BstEⅡ酶切位
点，将 CPMAX2 基因从 T 载体切出回收，并对
pCAMBIA 1301 进行同样酶切，将两者在 16 ℃
连接，转化大肠杆菌 DH5α，挑取单菌落提取
质粒，酶切鉴定，能切出 2 297 bp 大小的片段
（图 3），说明成功构建 CPMAX2-pCAMBIA-
1301 植物过表达载体，其中驱动 CPMAX2 的
启动子为花椰菜花叶病毒 CaMV 35S，终止子
为 NOS（图 4）。




















图 4 CPMAX2-pCAMBIA1301 质粒图谱
启动子：CaMV 35S；终止子：NOS。
Fig. 4 CPMAX2- pCAMBIA1301 vector
The promoter：CaMV 35S；Terminator：NOS.
2.3 枳橙CPMAX2 基因的进化分析
将 CPMAX2 的 CDS 区序列翻译成氨基酸，在 NCBI 中用 BlastP 进行同源序列搜索，选取其中
26 条来自于不同植物的 MAX2 氨基酸序列，采用 MEGA5.1 软件近邻相接法对 CPMAX2 氨基酸序
列进行进化分析。结果发现 MAX2 氨基酸序列在枳橙与胡杨、葡萄的差异明显，其他植物主要聚类
分成 7 支（图 5）。芸香科的枳橙、甜橙、克里曼丁橘和枳聚成第 1 支，枳橙作为枳与甜橙的杂交种，
遗传背景变化较大，但 CPMAX2 的氨基酸与亲本甜橙变异不明显，可见该基因主要遗传信息来自
于甜橙。锦葵科的雷蒙德氏棉和陆地棉聚成第 2 支，大戟科的蓖麻和麻风树聚成第 3 支，十字花科
的拟南芥、欧洲油菜、芜菁聚成第 4 支；葫芦科的黄瓜、甜瓜聚成第 5 支；蔷薇科的苹果、湖北海
棠、山荆子、碧桃、梅花聚成第 6 支；茄科的绒毛烟草、马铃薯、番茄聚成第 7 支。

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图 5 26 个物种 MAX2 蛋白的系统进化树
进化树中的数值代表支持率。
Fig. 5 Poylogenetic analysis of MAX2 proteins from 26 different plant species
The value of the evolutionary tree represents bootstrap support values.
2.4 CPMAX2 基因在转rolABC基因枳橙中的表达分析
qRT-PCR 分析表明，CPMAX2 在转 rolABC 基因枳橙腋生嫩叶中的转录表达均比野生型下调（图
6）。前期的研究表明 rolABC 基因转入枳橙促使主干基部大量侧枝丛生（袁飞荣 等，2011），本次
对其当年生梢分枝情况（图 7）观测发现，2014 年 7 月，所选植株当年生梢都能正常抽生春梢和夏











图 7 转 rolABC 基因枳橙 B、D、E 株系春梢分枝数
Fig. 7 The number of axillary shoots on spring shoot of clones
B，D and E of transgenic citrange with rolABC genes
图 6 CPMAX2 基因在转 rolABC 基因枳橙 B、D、E 株系
腋生嫩叶中的表达分析
Fig. 6 The relative expression value of CPMAX2 in axillary
tender leaves of clones B，D and E of transgenic
citrange with rolABC genes
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梢，其中转 rolABC 基因枳橙春梢段的分枝数明显比野生型多，E 系分枝数最多，平均值达到 3.5 个，
其次是 B、D 系，而野生型的分枝平均值仅有 1.9 个。可见 CPMAX2 的下调表达在转基因枳橙分枝
中发挥重要作用，但 3 个株系中的 CPMAX2 表达量与分枝数相关性不显著。推测转 rolABC 基因枳
橙分枝生长的机制是：CPMAX2 的下调引发 SLs 信号传递障碍，从而使其抑制侧芽萌发的功能下降，
并且打破生长素、细胞分裂素、赤霉素等调控侧芽萌发和生长相关植物激素的平衡，多种植物激素
协同促进侧芽萌发，导致转 rolABC 基因枳橙莲座状侧枝大量生长。
3 讨论
F-box 蛋白在植物体中广泛存在，过去证实其参与多种植物激素的信号转导、自交不亲和、花
器官发育、生物胁迫等（Bi et al.，2006）。F-box 蛋白结构域是与 SCF（Skp1-Cullin-F-box protein）
复合体中的 Skp1 或 skp1 类似蛋白结合的区域，位于蛋白质的 N 端，由大约 40 ~ 50 个氨基酸组成，
没有严格的保守序列，其中仅有几个位置的氨基酸残基比较保守，位置 9 多为亮氨酸或甲硫氨酸；
位置 10 为脯氨酸；位置 17 为异亮氨酸或缬氨酸；位置 21 为亮氨酸或甲硫氨酸，位置 33 为丝氨酸
或半胱氨酸（Kipreos & Pagano，2000）。本研究中克隆到的 CPMAX2 氨基酸序列含有典型的 F-box
结构域，保守氨基酸残基中位置 21 变为异亮氨酸，位置 33 变为缬氨酸，其他序列位置都保守不变。
过去的研究认为 F-box 结构域与蛋白质 C 端的其他基序结合起来发挥作用，其功能机制是通过蛋白
酶体途径对靶标蛋白进行降解（Cheng et al.，2011），调控下游反应基因的表达，进而对植物性状产
生影响。
MAX2 是首个在拟南芥中鉴定的独脚金内酯信号转导调控元件，max2 突变体增强了拟南芥侧
枝分枝表型，嫁接试验显示其为 SLs 响应基因的正调控因子（Stirnberg et al.，2002）。MAX2 编码的
F-box 蛋白，是 SCF E3 泛素连接酶复合体中的一个亚基，主要在木质部的薄壁细胞中表达（Stirnberg
et al.，2007）。本试验中使用的转 rolABC 基因枳橙具有莲座型分枝、矮化、节间变短等特征，qRT-PCR
证实 3 个转基因株系腋生嫩叶中 CPMAX2 基因表达显著下调，可见 SLs 信号参与了转 rolABC 基因
枳橙的侧芽萌发和生长调控，其机制可能是转 rol 基因枳橙 SLs 信号转弱，抑制下游响应基因的表
达，阻碍了 SLs 对侧芽萌发的抑制作用，促使大量腋芽萌发，形成莲座型枝，从而产生灌生矮化的
株形，但 MAX2 的表达下调可能仅仅是促使植物侧芽萌发的重要因素之一。对转 rolABC 基因枳橙
B、D、E 株系的形态学和生理特性进行了多年观测，发现 E 系分枝较 B、D 系更多，并且转基因植
株春季枝梢中部叶相比野生型玉米素含量显著增加（胡春华 等，2006），顶芽 GA3 和 IAA 含量均显
著降低（袁飞荣，2011）。本研究中发现 CPMAX2 在转 rolABC 基因枳橙中下调表达，并且分枝数均
比野生型显著增多。但未发现 B、D、E 株系中 CPMAX2 表达量与植株分枝数显著相关性的证据，
可能因为各转基因枳橙株系 rol 基因插入的位置和拷贝数不同，打破了其他分枝相关植物激素的平
衡，推测 CPMAX2 介导的 SLs 信号与其他多种植物激素信号互作，协同调控转 rolABC 基因枳橙侧
芽生长发育过程。目前在拟南芥、水稻、矮牵牛等植物中证实生长素、细胞分裂素、赤霉素、油菜
素内酯等植物激素参与调控侧芽萌发（Ferguson & Beveridge，2009；Muller & Leyser，2011；Bennett
& Leyser，2014），其协同调控的机制目前依然不清楚。下一步将利用构建的过表达载体将 CPMAX2
转入转 rolABC 基因枳橙中，观测其腋芽萌发和分枝特性，分析 CPMAX2 及上述多种植物激素合成
基因和信号转导因子的时空表达，探索 CPMAX2 基因和相关植物激素在侧枝生长和株型调控中的作
用机制。

Yuan Fei-rong，Yuan Yao-ming，Li Zhi-xin，Alessandra Gentile，Deng Zi-niu.
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