全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（3）：417–428 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–10–29；修回日期：2014–02–27
基金项目：重庆市自然科学基金项目（cstc2011jjA80010）；科技部农村领域国家科技计划课题（2011AA100205）；国家现代农业产业技
术体系建设专项资金项目（CARS-27）；农业部公益性行业（农业）科研专项（2010 03067-02-4）；柑橘学重庆市市级重点实验室开放基金计
划项目（CKLC201105）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2012B023）
* E-mail：zouxiuping@cric.cn，scchen@cric.cn；Tel：023-68349020
分泌型 Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其
抗溃疡病水平
邹修平*，彭爱红，刘琦琦，何永睿，王军政，许兰珍，雷天刚，姚利晓，
陈善春*
（中国农业科学院柑橘研究所/西南大学柑橘研究所，国家柑橘品种改良中心，柑橘学重庆市级重点实验室，重庆
400712）
摘 要：为了利用 Cecropin B（CB）抗菌肽基因提高柑橘对溃疡病的抗性，人工合成了两个含有信
号肽的 Cecropin B 抗菌肽基因 PR1aCB 和 AATCB。洋葱表皮瞬时表达分析表明，与非分泌型 CB 抗菌肽
相比，PR1aCB 和 AATCB 抗菌肽在细胞间隙中优势积累。进一步构建了 CaMV 35S 调控 PR1aCB 和 AATCB
基因的植物表达载体，转化塔罗科血橙（Citrus sinensis Osbeck）上胚轴，获得转基因植株。GUS 组织化
学染色、PCR 和 Southern blot 分析表明外源基因已成功整合入柑橘基因组。Real-time PCR 定量分析表明，
抗菌肽基因在转基因植株中成功表达。柑橘叶片离体抗性分析表明，转 PR1aCB 和 AATCB 基因植株的抗
性显著强于非转基因植株，其抗性水平与高抗品种‘南丰蜜橘’（C. succosa Hort. Ex Tan）和‘四季橘’
（C. madurensis）相当。
关键词：柑橘；信号肽；抗菌肽；柑橘溃疡病；遗传转化；抗性
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）03-0417-12

Secreted Expression of Cecropin B Gene Enhances Resistance to Xanthomonas
axonopodis pv. citri in Transgenic Citrus sinensis‘Tarocco’
ZOU Xiu-ping*，PENG Ai-hong，LIU Qi-qi，HE Yong-rui，WANG Jun-zheng，XU Lan-zhen，LEI Tian-gang，
YAO Li-xiao，and CHEN Shan-chun*
（Citrus Research Institute，Southwest University；Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences；
National Citrus Engineering Research Center；National Center for Citrus Varieties Improvement，Chongqing 400712，
China）
Abstract：A Citrus canker caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac）is a very destructive
disease，which affects the citrus industry in most citrus-producing areas of the world. Here，we reported the
production of transgenic Tarocco blood orange（C. sinensis Osbeck）containing the synthetic antibacterial
peptide genes and the evaluation of transgenic plants for resistance to Xac. Two new Cecropin B（CB）
antibacterial peptide genes PR1aCB and AATCB with signal peptide（SP）sequence were synthesized by

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PCR. Transient RFP expression showed that fluorescence accumulation was observed predominantly in
intercellular space surrounding the onion epidermal cells transformed with PR1aCB︰rfp and AATCB︰rfp
genes compared with CB︰rfp without SP，indicating the SPs could direct protein secretion to the apoplast.
PR1aCB and AATCB gene cassettes driven by CaMV 35S were introduced into Tarocco blood orange by
Agrobacterium-mediated transformation. Integration of transgenes into citrus genome was confirmed by
GUS histochemical staining，PCR and Southern blot. Transcriptions of PR1aCB and AATCB genes were
detected by Real-time quantitative PCR in transgenic plants. Transgenic leaves were in vitro inoculated
with suspension of Xac. Compared to control（nontrangenic plants and pGN transgenic plants without
antibacterial gene），ten transgenic lines showed significant increase in resistance to citrus canker. The
levels of the resistance of the transgenic lines were equivalent to that of the highly resistant varieties：
Nanfeng Miju（C. succosa Hort. Ex Tan）and Calamondin（C. madurensis）.
Key words：Citrus；signal peptide；antibacterial peptide；citrus canker；genetic transformation；
resistance

柑橘溃疡病是柑橘的重要病害之一，其病原菌是黄单胞菌属地毯草黄单胞菌柑橘致病变种
Xanthomonas axonopodis pv．citri（Gottwald et al.，2002）。该病几乎危害所有柑橘品种，特别是甜
橙和柚类，往往造成非常严重的经济损失。培育抗病品种是解决柑橘溃疡病危害的根本途径。现代
生物技术的飞速发展为柑橘抗病育种提供了新的途径，它可以获得常规育种难以得到的新类型，创
造出新种质（Febres et al.，2011；Gong & Liu，2013；Zou et al.，2013）。
在柑橘抗病基因工程育种中，来源于昆虫等生物的抗菌肽（antimicrobial peptides）由于具有抗
菌能力强、抗菌谱广、抗性不易丧失等特性而被广泛的使用（陈善春 等，1996；何永睿 等，2004；
Boscariol et al.，2006；Cardoso et al.，2010；He et al.，2011）。自 20 世纪 80 年代开始，柞蚕（Antheraea
pernyi）抗菌肽 D 基因、天蚕（Hyalophora cecropia）抗菌肽 Cecropin B 和人工合成抗菌肽 Shiva A
基因先后转入锦橙、新会橙、沙田柚、脐橙等对溃疡病高度易感的柑橘品种中，通过对所获得的转
基因植株进行温室和田间抗病性试验，从上千份材料中筛选到 11 个对柑橘溃疡病抗性显著提高的转
基因株系（He et al.，2011；王军政，2012)。然而，绝大部分转基因植株对柑橘溃疡病的抗性并没
有明显的提高。
在转基因烟草和马铃薯中表达天蚕抗菌肽 B 或其合成类似物并没有增强对细菌的抗性，推测是
由于宿主细胞质中的蛋白酶降解抗菌肽所致（Hightower et al.，1994；Allefs et al.，1995)。因此，
防止被宿主细胞降解，对提高抗菌肽的杀菌效果是至关重要的。一些基因的信号肽序列能够将所表
达的外源蛋白分泌到细胞外，从而避免胞质蛋白酶的降解（Jan et al.，2010)。研究表明，利用信号
肽将抗菌肽分泌到细胞间隙能增强转基因植株的抗病性（Li et al.，2001；Boscariol et al.，2006；Coca
et al.，2006；Jan et al.，2010)。
柑橘溃疡病病原菌主要是通过气孔、伤口等入侵植物体，并驻留在细胞间隙繁殖。因此，将
Cecropin B 等抗菌肽分泌到细胞间隙，不但可以避免被宿主细胞质中蛋白酶降解，而且可以提高抗
菌肽直接攻击病原菌的效率。
为此，本研究中通过选取合适的异源信号肽序列指导抗菌肽基因的胞外分泌表达，构建分泌型
Cecropin B 抗菌肽基因，并利用农杆菌介导法将其导入栽培品种塔罗科血橙中，以期获得抗性提高
的转基因材料，为柑橘抗病基因工程育种提供新的基因资源和思路。
3 期 邹修平等：分泌型 Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其抗溃疡病水平 419

1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2011 年 1 月—2013 年 10 月在中国农业科学院柑橘研究所国家柑橘品种改良中心完成。
瞬时表达载体 pSAT6-mRFP-N1 由本实验室保存。植物表达载体 pGN 由本实验室构建。该载体含有
用于转基因植株筛选的 nptⅡ抗性和 gus 报告融合基因以及用于外源基因插入的多克隆位点（图 1，
A）。植物转化农杆菌菌株为 EHA 105（本实验室保存）。柑橘遗转化受体为塔罗科血橙（C. sinensis
Osbeck）无菌上胚轴。

图 1 植物表达载体 T-DNA 结构图
A：构建抗菌肽基因表达载体所用的 pGN 载体；B：用于抗菌肽亚细胞定位分析的载体；C：pPR1aCB 和 pAATCB 植物表达载体。
35S：花椰菜花叶病毒 CaMV 35S 启动子；GUS︰NPTⅡ：β–葡萄糖醛酸酶基因 gus 与卡那霉素抗性基因 nptⅡ的融合基因；
nos：胭脂碱合酶基因转录终止序列；MCS：多克隆位点。
Fig. 1 Structures of T-DNAs used in the study
A：T-DNA of pGN plant expression vector；B：T-DNAs of vectors used for onion cell transformation；C：T-DNAs of plant expression vectors used
for citrus transformation. 35S：Cauliflower mosaic virus 35S promoter（CaMV 35S）；GUS︰NPTⅡ：The fusion gene of β-glucuronidase and
neomycin phosphotransferase genes；nos：The terminator of nopaline synthase gene；MCS：Multiple cloning sites.

1.2 分泌型 Cecropin B 基因的筛选与克隆
将不同信号肽的核酸序列分别添加到 Cecropin B 5′ 端的编码框中（ATG 密码子之后），构建融
合基因序列。利用在线软件 SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析不同信
号肽与 Cecropin B 融合后，融合蛋白中信号肽剪切位点的精确性，筛选能保证抗菌肽前体分泌后正
确剪切的信号肽序列。根据选取的序列设计引物，PCR 合成分泌型 Cecropin B 基因 spCB，并在抗
菌肽基因序列两端引入 BamHⅠ和 SalⅠ酶切位点以及在起始密码子 ATG 上游加上植物翻译增强序
列“AACA”（Haseloff et al.，1997）。具体构建过程参见王军政（2012）所述。
1.3 植物表达载体的构建
设计引物，利用 PCR 在上述分泌型抗菌肽基因 spCB（包括野生型基因 CB)的 5′和 3′端分别加
上 HindⅢ和 BamHⅠ酶切位点，去掉翻译终止密码子，然后将其插入 HindⅢ/BamHⅠ酶消化的
pSAT6-mRFP-N1 载体的 rfp 红色荧光蛋白基因上游，构建 spCB︰rfp 和 CB︰rfp 融合基因。最后，
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BglⅡ/XbaⅠ将 spCB︰rfp、CB︰rfp 融合片段从该载体上卸下，连入 BamHⅠ/SpeⅠ酶消化的 pGN 载
体中，构建 CaMV 35S 启动子控制融合基因表达的载体用于抗菌肽的亚细胞定位分析（图 1，B）。
进一步用 BamHⅠ/SalⅠ消化所获得的抗菌肽基因，插入相同酶消化的 pGN 表达载体中，构建 CaMV
35S 启动子控制抗菌肽基因表达的载体（图 1，C）。
通过电激法将上述植物表达载体导入农杆菌中，用于柑橘遗传转化。
1.4 洋葱表皮细胞的遗传转化
参照李伟明（2009）的方法：将洋葱鳞茎切成 1 cm2 小块，剥取上表皮细胞浸于无菌水中。然
后用无菌滤纸吸干表面的残余水分，平铺于 MS 固体培养基中，26 ℃避光预培养 24 h。将预培养的
洋葱表皮在农杆菌中浸染 30 min。无菌滤纸吸干洋葱表皮的残余菌液，转入 MS 固体培养基中培养
48 h。最后将浸染培养后的洋葱表皮细胞置于载玻片上，在荧光显微镜下观察外源基因的表达情况。
1.5 柑橘遗传转化
将获得的转基因芽嫁接到无菌锦橙实生苗上，置于 MS 液体培养基中培养；待幼苗长到 5 cm 左
右时将其嫁接到枳橙实生苗上，于温室中培养备用（王军政，2012)。
1.6 GUS 组织化学染色
取抗性芽叶片组织放入新鲜配置的 X-Gluc 染色液中 37 ℃保温过夜。充分染色后用 75%乙醇脱
色 2 ~ 3 次，至非转基因对照材料呈白色，体视显微镜下观察和照相（Jefferson，1987；Zou et al.，2008）。
1.7 PCR 分析
取柑橘叶片 100 mg，用 Aidlab 公司试剂盒（cat.No.DN15）提取基因组 DNA，PCR 检测抗菌肽
基因的整合。反应体积 25 μL，反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 次循
环；72 ℃ 10 min。上游引物序列分别为：PRla-f：5′-GATATAACAATGGGATTTGTTC-3′，检测目
的片段为长 240 bp PR1aCB 基因；AAT-f：5′-GAGATATAACAATGGCTCCA-3′，检测目的片段为长
200 bp AATCB 基因；检测上述目标片段的下游引物均为：CB-r：5′-CTAACCAAGAGCTTTAGCT-3′。
nptⅡ-f：5′-TTGAACAAGATGGATTGCACGCAGG-3′和 nptⅡ-r：5′-GCCATTTTCCACCATGATATT
CGGC-3′，用于检测 pGN 空载转基因植株中 nptⅡ基因的整合，目的片段大小为 700 bp。
1.8 Southern blot 分析
将 GUS 和 PCR 检测呈阳性转基因植株的总 DNA（100 µg）用 EcoRⅠ（图 1，C）完全酶切，
酶切产物转移到尼龙膜上与以 DIG 标记 gus 的特异性探针进行杂交。探针标记、杂交以及信号检测
等操作按杂交试剂盒（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，Roche）说明书进行。
1.9 转基因植株的 Real-time PCR 分析
用 EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒（Aidlab，cat.No.RN09）提取叶片总 RNA。cDNA 第
一链的合成按照 BIO-RAD iScriptTM cDNA Synthesis Kit（BIO-RAD，cat.No.170-8891）说明书进行。
用 Real-time PCR 试剂盒（BIO-RAD iQTM SYBR Green Supermix，cat.No.170-8882AP）定量分析
PR1aCB 和 AATCB 基因的表达。PRlaCB 和 AATCB 基因表达的检测引物序列均为：spCB-F 5′-AGA
AAATCGAGAAGATGGGTCGT-3′和 spCB-R 5′-CCAAGAGCTTTAGCTTCACCC-3′。内标基因 actin
表达的检测引物序列：actin-F 5′-CATCCCTCAGCACCTTCC-3′和 actin-R 5′-CCAACCTTAGCACT
TCTCC-3′。反应体积 20 μL。反应条件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s；56 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40 次循
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环；72 ℃ 10 min。试验重复 3 次，数据用 Bio-Rad CFX Manager 2.0 软件进行统计分析。采用 2-ΔΔCt
法计算转基因植株中抗菌肽基因的相对表达量，定义非转基因植株为参照因子，即为 1，各样本相
对于参照因子基因表达的倍数为 2-ΔΔCt。
1.10 转基因植株的抗病性检测
柑橘溃疡病病原菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri，Xac）的分离、纯化、培养方法参见李云
峰和李祥（2000）所述。接种菌液浓度为 1 × 106 CFU · mL-1。选取成熟的新成叶（每个转基因株系
选取 3 ~ 5 片叶片），用无菌水洗净，置于无菌培养皿中。接种方法采用针刺法（李云锋和李祥，2000），
用 0.5 mm 大小针头蘸取菌液针刺叶片，每片叶针刺 10 ~ 12 孔。28 ℃，16 h 光照培养。每天观察发
病情况，统计针刺点发病数，计算转基因株系的针刺点发病率（Incidence of needle-punctured spots，
INS），以此评价植株的抗性强弱。试验重复 3 次。INS（%）= 病斑孔数/总接种孔数 × 100。
进一步以非转基因植株和高抗品种‘南丰蜜橘’（C. succosa Hort. Ex Tan）和‘四季橘’（C.
madurensis）为参照，分析转基因植株的相对病情指数（Relative resistant ratio，RRR）（张戈壁 等，
2004），评价植株的抗性水平。试验重复 3 次。RRR（%）= 转基因株系针刺点发病率/非转基因株
系针刺点发病率 × 100。
2 结果与分析
2.1 分泌型 Cecropin B 抗菌肽基因的构建
将不同信号肽碱基序列添加到 Cecropin B 5′端的编码框中（ATG 密码子之后），构建融合基因。
在线软件 SignalP 3.0 Server 分析融合蛋白中信号肽的保真性和剪切位点的精确性。由图 2 可知，预
测 PR1aCB 的信号肽序列为氮端 30 个 PR1a 氨基酸残基，信号肽剪切位点位于第 30 号和 31 号氨基
酸残基之间（CRA-AK）。预测 AATCB 的信号肽序列为氮端 25 个 AAT 氨基酸残基，信号肽剪切位
点位于第 25 号和 26 号氨基酸残基之间（SLA-AK）。上述预测结果与设计的完全一致。其中，PR1a
为烟草病程相关蛋白基因 PR1a 的信号肽 MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA（Yuan et al.，
2000）；AAT为人 α–1–抗胰蛋白酶素（α-1-antitrypsin）基因的信号肽MAPSSVSWGILLLAGLCCLVP
VSLA（Agarwal et al.，2008）。根据这些结果，利用 PCR 人工合成了 PR1aCB 和 AATCB 融合基因，
并在上游加上植物翻译增强序列，以增强基因的表达。PR1aCB 和 AATCB 的碱基序列参见王军政
（2012）所述。
为了进一步分析 PR1a 和 AAT 信号肽指导 Cecropin B 抗菌肽胞外分泌的能力，将 PR1aCB 和
AATCB 融合基因与 rfp 红色荧光蛋白基因融合，构建含有 35S︰︰PR1aCB：rfp 和 35S︰︰AATCB︰ rfp
表达框的植物表达载体（图 1，B），利用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞。如图 3 所示，转 35S︰︰
PR1aCB︰ rfp 和 35S︰︰AATCB︰ rfp 洋葱表皮细胞中，红色荧光主要富集于细胞间隙中，而转 35S︰︰
CB︰ rfp 洋葱表皮细胞中，红色荧光弥散分布于细胞质内。表明信号肽 PR1a 和 AAT 能高效地将
Cecropin B 抗菌肽分泌到细胞间隙中。
2.2 转基因植株的获得
利用根癌农杆菌介导法将 pPR1aCB 和 pAATCB 载体转化血橙，以转空载 pGN 载体和非转基因
植株为对照。由于载体中均含有 gus 报告基因，因此对再生芽进行 GUS 组织化学染色筛选转基因植
株。如图 4 所示，转基因幼苗的叶和茎均显蓝色，而非转基因植株不显色。

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图 2 PR1aCB（A）和 AATCB（B）融合蛋白的信号肽预测与剪切位点分析
红色箭头表示最有可能的剪切位点。
Fig. 2 Prediction of signal peptide and cleavage site in PR1aCB（A）and AATCB（B）fusion proteins by SignalP 3.0 server
Red arrowhead indicates max cleavage site.

图 3 PR1aCB︰RFP 和 AATCB︰RFP 融合蛋白在洋葱表皮细胞瞬时表达的亚细胞定位观察
Fig. 3 Sub-cellular localization analysis of PR1aCB︰RFP and AATCB︰RFP fusion proteins



图 4 pPR1aCB（A）、pAATCB（B）、pGN（C）转基因与非转基因（D）植株的 GUS 组织化学染色鉴定
Fig. 4 GUS histochemical staining of pPR1aCB（A），pAATCB（B），pGN（C）transgenic and nontransgenic（D）citrus plants
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PCR 进一步鉴定外源基因的整合。结果显示，在 GUS 阳性 pPR1aCB、pAATCB 植株中均检测
出相应的 PR1aCB、AATCB 特异片段（图 5，A、B)。表明抗菌肽基因已成功整合入柑橘基因组中。
在 GUS 阳性转空载 pGN 植株中，均检测到 700 bp 的 nptⅡ特异片段（图 5，C）。经 GUS 组织化学
染色和 PCR 鉴定获得：pPR1aCB 转基因植株 18 株；pAATCB 转基因植株 23 株；pGN 转基因植株
9 株。


图 5 pPR1aCB（A）、pAATCB（B）和 pGN（C）转基因植株的 PCR 鉴定
M：DNA 分子 marker；N：非转基因对照；P：质粒；1 ~ 9：转基因植株。
Fig. 5 PCR analysis of pPR1aCB（A)，pAATCB（B）and pGN（C）transgenic citrus plants
M：DNA molecular marker；N：Nontransgenic plant；
P：Plasmid；1–9：Transgenic lines.

2.3 转基因植株的 Southern blot 检测
对 GUS 和 PCR 检测呈阳性的植株进行 Southern blot 检测，结果表明，所有转基因植株中均检
测出特异性杂交信号，而非转基因植株中未出现任何杂交信号，说明外源基因已整合到柑橘基因组
中（图 6）。其中，外源基因在 PC3、PC6、PC8、AC9、AC12、AC14 株系中的拷贝数为 1，在 PC7、
PC11、AC11 株系中为 2，在 AC6 株系中为 3。
2.4 转基因植株的 Real-time PCR 定量分析
以 GUS、PCR 和 Southern blot 检测为阳性的植株、pGN 空载转基因植株和非转化植株 cDNA
为模板，Real-time PCR 定量分析 PR1aCB 和 AATCB 抗菌肽基因在转基因植株中的表达水平。
结果（图 7）显示，抗菌肽基因在转基因植株中成功表达。其中，PR1aCB 基因在 pPR1aCB 转
基因株系 PC3、PC6、PC11 中表达水平较高；AATCB 基因在 pAATCB 转基因株系 AC6、AC9、AC11
中表达量较高。
转 pGN 空载和非转基因植株中没有检测到 PR1aCB 和 AATCB 抗菌肽基因的表达。
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图 6 转基因植株的 Southern blot 检测
pGN3、pGN6：pGN 转基因植株；H2O：ddH2O 为模板；NT：非转基因植株；PC3、PC6、PC7、PC8、PC11：pPR1aCB 转基因植株；
AC6、AC9、AC11、AC12、AC14：pAATCB 转基因植株。
Fig. 6 Southern blot identification of transgenic plants
pGN3 and pGN6：Transgenic lines transformed with pGN control vector；H2O：ddH2O as template；
NT：Nontransgenic plants；PC3，PC6，PC7，PC8 and PC11：pPR1aCB transgenic lines；
AC6，AC9，AC11，AC12 and AC14：pAATCB transgenic plants.



图 7 抗菌肽基因 PR1aCB 和 AATCB 在转基因植株中的相对表达量分析
NT：非转基因植株；pGN：pGN 空载转基因植株。
Fig. 7 Relative expression of antibacterial peptide gene PR1aCB and AATCB in transgenic plants
NT：Nontransgenic plants；pGN：Transgenic plants transformed with pGN control vector.

2.5 转基因植株的抗病性检测
对转基因植株的离体叶片接种溃疡病病原菌，评价转基因植株的抗病性，接种 15 d 后统计针刺
点发病率。如图 8 显示，在供试的 18 株 pPR1aCB 和 24 株 pAATCB 转基因植株中，5 株 pPR1aCB
转基因植株（PC3、PC6、PC7、PC8、PC11 株系）和 5 株 pAATCB 转基因植株（AC6、AC9、AC11、
AC12、AC14 株系）离体叶片针刺点发病率分别在 24.56% ~ 71.30%和 2.63% ~ 43.13%，显著低于转
空载 pGN 和非转基因叶片的发病率（分别为 88.43%和 84.38%）。其中，AC14 株系抗性最强，发病
率仅为 2.63%。结果表明，转 PR1aCB 和 AATCB 基因能显著增强柑橘对溃疡病的抗性。
为了进一步评价转基因植株对溃疡病的抗性水平，选取溃疡病高抗品种‘南丰蜜橘’和‘四季
橘’（彭祝春 等，2010）与上述 10 个抗性增强的株系进行平行的离体抗病性比较试验。接种 15 d
后，统计针刺点的发病率。以非转基因植株为参照，分析转基因植株的相对病情指数。试验结果表
明，测试的 10 个转基因株系的抗性水平均显著高于非转基因植株，pAATCB 和 pPR1aCB 转基因植
株的相对病情指数分别在 34.33% ~ 70.42%和 3.29% ~ 56.12%（图 9）。其中，AC14 株系的抗性水平
与南丰蜜橘和四季橘的抗性水平相同，达到高抗水平。
3 期 邹修平等：分泌型 Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其抗溃疡病水平 425




图 8 pPR1aCB 和 pAATCB 转基因柑橘离体叶片溃疡病抗性统计分析
pGN：pGN 空载转基因植株；NT：非转基因植株。
不同的字母表示差异显著（邓肯氏新复极差法；P < 0.05）。
Fig. 8 Resistance evaluation of in vitro leaves from transgenic citrus to Xanthomonas axonopodis pv. citri
pGN：pGN transgenic lines transformed with pGN control vector. NT：Nontrangenic lines.
Different letters represent significant differences
（Duncan’s multiple range tests；P < 0.05）.



图 9 转基因柑橘与高抗品种的溃疡病抗性比较分析
SJ：四季橘；NF：南丰蜜橘；NT：非转基因植株。
不同的字母表示差异显著（邓肯氏新复极差法；P < 0.05）。
Fig. 9 Relative resistant ratio of in vitro leaves from transgenic citrus to Xanthomonas axonopodis pv. citri
SJ：Calamondin；NF：Nanfeng Miju；NT：Nontrangenic plants as a control.
Different letters represent significant differences from control plant
（Duncan’s multiple range tests；P < 0.05）.

接种 8 d 后，在非转基因和 pGN 转基因叶片中，几乎所有的针刺点均出现典型的病斑（图 10，
A、B）。而 pPR1aCB 和 pAATCB 转基因叶片中，病斑仅出现在少数针刺点，且病斑小、扩散速度
慢（图 10，C、D）。
进一步观察发现，转基因株系的病斑表型与‘南丰蜜橘’和‘四季橘’相似，针刺点塌陷，病
原菌不扩散到叶片表面形成典型溃疡病斑；而在非转基因植株的叶片中，病原菌在针刺点迅速扩散
并外凸形成火山状病斑（图 11）。
这些结果暗示，抗菌肽能有效抑制溃疡病病原菌在植物组织中的繁殖和扩散。
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图 10 转基因柑橘离体叶片溃疡病抗性观察
A：非转基因；B：pGN；C：pPR1aCB（PC11 株系）；D：pAATCB（AC14 株系）。5 d、8 d、15 d 表示接种后的培养天数。
Fig. 10 Resistance of in vitro leaves from transgenic citrus to Xanthomonas axonopodis pv. citri
A：Nontransgenic plants；B：pGN；C：pPR1aCB（line PC11）；D：pAATCB（line AC14）.
5 d，8 d，15 d indicate days after Xac inoculation.

图 11 转基因柑橘与高抗品种的溃疡病抗性比较
Fig. 11 Resistance of in vitro transgenic leaves to Xanthomonas axonopodis pv. citri
3 讨论
目前关于抗菌肽的抗病机理主要有两种假说：细胞膜损伤和胞内损伤（Brogden，2005）。前者
认为抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道，造成细菌细胞膜结构破坏，引起胞内
3 期 邹修平等：分泌型 Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其抗溃疡病水平 427

水溶性物质大量渗出，最终导致细菌死亡；后者认为抗菌肽分子是通过细菌膜上特异受体进入细胞
质中，干扰一些关键的胞内因子或结构（如 DNA、RNA、质体等），导致细菌死亡。无论哪种作用
机制，抗菌肽必须与细菌细胞直接作用才能起到杀菌效果。柑橘溃疡病病原菌是一种细胞间隙繁殖
细菌，主要通过伤口、气孔等入侵。根据抗菌肽分子直接与细菌作用的杀菌特点，选取胞外富集抗
菌肽的方式来提高杀菌效果。生物信息学分析表明，来自烟草 PR1a 和人类 AAT 信号肽能准确剪切
Cecropin B 抗菌肽前体，产生成熟的抗菌肽（图 2）。洋葱表皮细胞瞬时表达表明，PR1a 和 AAT 信
号肽能在细胞间高效富集抗菌肽（图 3）。转基因柑橘研究表明，转 PR1aCB 和 AATCB 基因植株对
溃疡病具有明显的抗性，28% pPR1aCB 和 21%的 pAATCB 转基因植株显著增强了对溃疡病的抗性。
与作者前期从上千份转非分泌性抗菌肽基因材料中仅获得 10 余株抗性增强株系的试验相比，本结果
显示，PR1a 和 AAT 信号肽能明显提高 Cecropin B 抗菌肽的杀菌效果，显著提高抗性材料的获得频
率。这对于降低遗传转化成本、节约劳动力、加速抗性材料的筛选以及促进抗菌肽基因在柑橘抗病
育种中的应用具有重要意义。
在柑橘溃疡病抗性品种中，‘南丰蜜橘’和‘四季橘’属于高抗品种（彭祝春 等，2010)。离
体抗性试验表明，AC14 株系的抗性水平与这两个品种相当，达到了高抗水平。而且，转基因植株
的抗性表型与两者相似，病原菌不能在叶片表面形成典型的菌落生态群。转基因植株的这种抗性表
型可能是由于抗菌肽在细胞间隙有效杀死病原菌，进而抑制病原菌的繁殖而使其不能向外扩散形成
病斑。其确切的抗病机理有待进一步研究。
10 个转基因血橙株系对柑橘溃疡病的抗性存在一定的差异，其中，PC7、PC11 和 AC11、AC14
抗性较强。这种差异可能是由于目的基因整合位点或拷贝数不同，导致抗菌肽的表达量不同。
Southern blot 分析发现，外源基因在 AC14 株系中为单拷贝插入，在 PC7、PC11 和 AC11 株系中均
为双拷贝插入，而在 AC6 株系中为三拷贝插入。显然，外源基因在基因组中的拷贝数与植株的抗性
强弱没有相关性。Real-time PCR 进一步分析显示抗菌肽基因在 AC14、PC7 株系中表达水平较低，
但抗病性评价表明其抗性水平较高。这些结果表明抗菌肽基因的转录水平与其抗性不具有正相关
（Boscariol et al.，2006）。总之，本试验中利用异源信号肽指导抗菌肽的胞外富集，转化柑橘，获
得了对溃疡病有显著抗性的转基因植株，为选育新的柑橘抗性品种提供了新的材料和方法。进一步
的田间抗性评价、抗性水平以及相关机制的研究正在进行中。
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