全 文 ：园艺学报，2015，42 (4)：613–622.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1056；http：//www. ahs. ac. cn 613
收稿日期：2015–01–21；修回日期：2015–04–01
基金项目：国家自然科学基金项目（31101516）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（1610032012006）；农业公益性行业科研
专项（201203075-05）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：jshling@163.com）
梨矮化砧木‘中矮 1 号’生长素氢转运体基因
PcAHS 及其启动子的克隆与表达分析
汤常永 1，段续伟 2，欧春青 1，王 斐 1，姜淑苓 1,*
（1 中国农业科学院果树研究所，农业部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城 125100；2 中国农业大学农学
与生物技术学院，北京 100193）
摘 要：以梨（Pyrus communis L.）紧凑型矮化砧木‘中矮 1 号’及其母本‘锦香’新梢韧皮部为试材，
根据转录组测序结果设计特异性引物，克隆到 1 个长 1 239 bp 的基因序列。该序列在两个品种间不存在差异，
均编码 412 个氨基酸，其氨基酸序列与苹果（np_001280772.1）、梅（xp_008242099.1）、毛果杨
（xp_002306421.2）、草莓（xp_00428771.1）的生长素氢转运体基因（AHS）编码的氨基酸序列的相似性在
67% ~ 99%之间，命名为 PcAHS。qRT-PCR 分析发现，‘中矮 1 号’新梢韧皮部中 PcAHS 的表达量均低于母
本‘锦香’，推测其启动子序列存在差异。‘中矮 1 号’及其母本‘锦香’PcAHS 基因上游启动子长度分别
为 828 bp 和 888 bp，二者相似性 89.1%。序列分析发现‘中矮 1 号’PcAHS 基因启动子有一段 58 bp（–496
bp ~–553 bp）的缺失；利用植物顺式作用元件数据库 PLACE 和 PLANTCARE 分析表明，‘中矮 1 号’启
动子含有一个‘锦香’没有的 BPBF 转录因子结合元件 P-box。推测‘中矮 1 号’PcAHS 基因启动子特有的
片段缺失和 P-box 转录因子结合元件可能是导致其表达量低并通过影响生长素的运输最终引起矮化的原因。
关键词：梨；矮化砧木；生长素氢转运体基因；启动子；克隆
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）04-0613-10

Isolation and Analysis of PcAHS Gene and Its Promoter from Dwarfing
Rootstock‘Zhongai 1’Pear
TANG Chang-yong1，DUAN Xu-wei2，OU Chun-qing1，WANG Fei1，and JIANG Shu-ling1,*
（1Institute of Pomology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Horticultural Crops Germplasm
Resourses Utilization，Ministry of Agriculture，Xingcheng，Liaoning 125100，China；2College of Agriculture and
Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）
Abstract：‘Zhongai 1’is a pear dwarfing rootstock selected from the open pollinated seedlings of
‘Jinxiang’. One gene with 1 239 bp was obtained from the new shoot phloem of‘Zhongai 1’and
‘Jinxiang’and it was designated as PcAHS. PcAHS had no difference in sequence between the two
varieties and it encoded 412 amino acids which had a sequence identity from 67% to 99% with the AHS
gene in Malus × domestica（np_001280772.1），Prunus mume（XP_008242099. 1），Populous trichocarpa
（XP_002306421.2）and Fragaria vesca（xp_00428771.1）. The expression of PcAHS gene in new shoot

Tang Chang-yong，Duan Xu-wei，Ou Chun-qing，Wang Fei，Jiang Shu-ling.
Isolation and analysis of PcAHS gene and its promoter from dwarfing rootstock‘Zhongai 1’pear.
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phloem of‘Zhongai 1’was lower than that in its female parent‘Jinxiang’during the shoot growing stage，
so we speculated that there may be difference in their promoter sequences. The promoter sequences of
PcAHS gene isolated from‘Zhongai 1’and‘Jinxiang’had 828 bp and 888 bp respectively and the sequence
identity was 89.1%. Sequence analysis showed that there is a deletion fragment of 58 bp（–496 bp to
–553 bp）from PcAHS gene promoter sequence in‘Zhongai 1’. According to PLACE and PLANTCARE
online database analysis，PcAHS gene promoter sequence of‘Zhongai 1’contained a particular BPBF
transcription factor binding element P-box which was absent in‘Jinxiang’. So we speculated that fragment
deletion and the particular transcription factor binding element P-box may be the cause of low expression
of the gene and then influence auxin transport，eventually lead to dwarf.
Key word：pear；dwarfing rootstock；auxin hydrogen symporter gene；promoter；clone

梨（Pyrus communis L.）矮化砧木‘中矮 1 号’是中国农业科学院果树研究所梨育种课题组从
‘锦香’梨实生后代中选育的优良品种，较母本‘锦香’树体矮小（姜淑苓 等，2000），其矮化和
致矮机理尚不清楚。目前果树矮化机理的研究主要集中在形态解剖结构、水势、同化物与矿质元素、
酶活性、激素调节等方面。研究认为生长素、细胞分裂素、赤霉素与脱落酸含量与树体高矮有直接
关系（Rogers & Beakbane，1957；Lockard & Schneider，1981；Atkinson & Else，2001）。其中生长
素和细胞分裂素的作用尤为显著（Soumelidou et al.，1994；Kamboj，1996；Michalczuk，2002；Peng
et al.，2008）。苹果矮化砧木 M9 的韧皮部的生长素运输能力弱，使得基部获得的生长素不足，引起
细胞分裂素合成减少，使地上部分得不到足够的细胞分裂素而造成树体矮化（Lockard & Schneider，
1981；Soumelidou et al.，1994；Kamboj，1996；Kamboj et al.，1997；Li et al.，2012）。生长素运输
是由生长素运输载体控制的（Soumelidou et al.，1994；Kamboj，1996）。拟南芥的 mdr1-1 突变体和
mdr1-1pgp1-1 双突变体植株生长素运输能力减弱而表现出矮化表型（Noh et al.，2001；Luschnig，
2002）。另外，Ross 等（2000）利用外源生长素运输载体抑制剂（NPA）对野生型豌豆节间处理后，
造成 IAA 向作用点以下节间中运输量减少引起植株矮化。生长素运输载体主要包括 PIN 蛋白家族、
PGP 蛋白家族、AUX1/LAX 蛋白家族（Bangerth，1993；Blakeslee et al.，2005），而生长素氢转运
体（AHS）是另一种生长素运输载体，目前研究较少，仅在苹果上有过相关报道（Dal et al.，2009）。
本课题组通过转录组测序分析发现 1 个生长素氢转运体基因在‘中矮 1 号’中的表达量显著低于母
本‘锦香’，推测生长素运输载体控制生长素向基部运输量的减少可能导致其矮化。因此，本研究中
以矮化砧木‘中矮 1 号’及其母本‘锦香’为试材，在克隆其生长素转运体基因及其启动子的基础
上，通过生物信息学及表达分析，解析‘中矮 1 号’的矮化机理，为梨矮化种质的创制和利用提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
‘锦香’梨（半矮化，作为对照）及其实生后代‘中矮 1 号’（矮化砧木）均定植于中国农业
科学院果树研究所梨试验园（辽宁省兴城市），树龄 20 年以上，基砧均为杜梨（Pyrus betulifolia Bge.）。
分别于 2013 年新稍生长期各阶段（5 月 22 日、6 月 7 日、6 月 20 日、7 月 3 日）采集树体不同方位
新梢顶端韧皮部（图 1），锡箔纸包裹，液氮速冻后保存于–80 ℃冰箱中待用。
汤常永，段续伟，欧春青，王 斐，姜淑苓.
梨矮化砧木‘中矮 1 号’生长素氢转运体基因 PcAHS 及其启动子的克隆与表达分析.
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图 1 试验材料与取样部位
Fig. 1 Materials and samples location

1.2 总 RNA 的提取及逆转录反应
Plantol 高效总 RNA 提取试剂盒（深圳莱伯克生物科技有限公司）提取韧皮部 RNA，如有 DNA
污染，使用DNaseⅠ（深圳莱伯克生物科技有限公司）去除，RNA反转录使用 Prime ScriptTM RT reagent
Kit（大连宝生物科技有限公司），操作均按各试剂的使用说明书进行。
1.3 PcAHS 基因克隆
以转录组测序获得的 AHS 基因序列为模板设计特异引物 AHSF：5′-ATGGGTTTCTGGACGCTG
TTGG-3′和 AHSR：5′-TCAAGACAAGATCCACATGAAG-3′，以‘中矮 1 号’和‘锦香’韧皮部 cDNA
为模板，扩增 AHS 基因编码序列。反应体系为 20 μL：其中 2× Es Taq MasterMix 10 μL，上、下游
引物（10 μmol · L-1）各 1 μL，反转录产物 1 μL，用 ddH2O 补足体系至 20 μL。PCR 扩增程序：94 ℃
预变性 5 min；94 ℃变性 30 s；55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。扩
增后，经 1%琼脂糖凝胶回收目标产物，连接于 pMD-19T 载体（大连宝生物科技有限公司），并转
化到 E. coli DH5α 感受态细胞（天根生化科技有限公司）后测序，测序由中美泰和生物技术有限责
任公司完成。
1.4 氨基酸序列同源性分析
将验证正确的梨 PcAHS 核苷酸序列用 DNAMAN 软件（Version 5.2.2）翻译和预测其蛋白的分
子量、等电点，并对氨基酸序列进行比对分析。
1.5 PcAHS 基因 qRT-PCR 分析
韧皮部总 RNA 提取、纯化和反转录方法同上（参照 TaKaRa 反转录试剂盒）。仪器为 iCycler iQ5
实时定量 PCR 仪器（Bio-Rad，美国）。反应体系为 20.0 μL，含有 10.0 μL SYBR PremixEx TaqTMⅡ
（TaKaRa），2.0 μL cDNA，7 μL ddH2O，上下游引物各 0.5 μL（引物浓度 10 μmol · L-1）。运行程序
为：95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性 20 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，40 次循环。每个样品 3
次重复。以 β-actin（F：5′-CTCGACTCAGGAGATGGTGT-3′，R：5′-CATGGATGGCTGGAAGAGGA-
3′）基因为内参，PcAHS 基因的上游引物为 AHSLEFT724：5′-TTCGTTCGCCAGATTTTGCA-3′，
AHSRIGHT917：5′-TTGCCTCCGAGAATGAGTGT-3′。采用 Livak 和 Schmittgen（2001）的 2-∆∆CT
公式计算基因的相对表达量。
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Isolation and analysis of PcAHS gene and its promoter from dwarfing rootstock‘Zhongai 1’pear.
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图 2 PcAHS 的克隆
M：DL2000 marker；1：‘中矮 1 号’；2：‘锦香’。
Fig. 2 PcAHS gene clone
M：DL2000 marker；1：‘Zhongai 1’；2：‘Jinxiang’.
1.6 PcAHS 基因启动子克隆
参照 CTAB 法（林元震，2006），以新梢韧皮部为材料提取总 DNA，利用 PcAHS 序列比对苹果
基因组（http：//genomics. research. iasma. it/index. htal），Genome Browser 找到对应的 MdAHS 基因
的 DNA 序列，在起始密码子 ATG 上游 1 000 bp 处和 ATG 下游设计引物：AHSF2：5′-CGAGAG
CGTTAGAATGTTAAATTG-3′；AHSR2：5′-CCCAACACACTGAATATGAGAACTT-3′。以 DNA 为模
板进行 PCR 扩增，反应体系为 20 μL；其中 2× Es Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物（10 μmol · L-1）
各 1 μL，DNA 0.5 μL，用 ddH2O 补足体系至 20 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性
30 s；58 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 60 s，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。扩增后，回收目标产物，连接
于 pMD-19T 载体，并转化到 E. coli DH5α 细胞后测序（中美泰和生物技术有限责任公司）。
1.7 PcAHS 基因启动子区域比对及顺式作用元件分析
用 DNAMAN 软件进行序列比对，TSSP-TCM 软件（Shahmuradov et al.，2005）预测转录起始
点，PLACE（Higo et al.，1999）和 Plant CARE（Lescot et al.，2002）分析启动子序列上的作用元件。
2 结果与分析
2.1 PcAHS 基因克隆与分析
以‘中矮 1 号’及对照品种‘锦香’新梢
韧皮部cDNA为模板，特异性引物PCR扩增后，
回收测序，均获得一段 1 239 bp 核苷酸序列（图
2），测序结果表明二者序列完全一致。其编码
的氨基酸序列与苹果（np_001280772.1）、草莓
（xp_00428771.1）、梅（xp_008242099.1）及毛
果杨（xp_002306421.2）的 AHS 基因编码氨基
酸序列的相似性分别为 99%、85%、72%和 67%
（图 3），因此将克隆出的 cDNA 序列命名为
PcAHS。DNAMAN 软件分析发现，该基因编
码 412 个氨基酸，预测其蛋白质分子量为 44.82
kD，等电点为 9.47；DNA STAR package 分析
发现，其大部分的氨基酸是疏水性残基，其中包括 25 个碱性氨基酸和 35 个酸性氨基酸；CDD 及
STITCH（http：//stitch. embl. de/）在线分析显示 PcAHS 蛋白属于膜转运蛋白 pfam01758 亚家族，
且基本不能和其他蛋白发生互作，而是单独发挥功能的。
2.2 PcAHS 的表达分析
提取‘中矮 1 号’及对照‘锦香’新梢不同生长时期新梢韧皮部的总 RNA，经检测其 A260/A280
值在 1.8 ~ 2.0 之间，符合下一步试验要求。qRT-PCR 检测发现，‘中矮 1 号’的 PcAHS 基因在新梢
生长期各阶段（5 月 22 日、6 月 7 日、6 月 20 日、7 月 3 日）新梢顶端韧皮部中的表达量均比其母
本‘锦香’低，约为其一半（图 4）。由于苹果中 MdAHS 参与生长素的运输，推测 PcAHS 的表达量
低可能会引起‘中矮 1 号’中生长素运输受阻，进而使得基部生长素减少，引起树体矮化。
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图 3 PcAHS 与其他物种 AHS 氨基酸序列的同源性比较
Fig. 3 Multiple sequence alignment of various PcAHS amino acid sequences

2.3 PcAHS 启动子的克隆与分析
基因转录一般受上游启动子调控（石翠翠 等，2014），因此，对‘中矮 1 号’和对照‘锦香’
PcAHS 上游启动子进行了克隆分析，均获得了 1 条 1 000 bp 左右的片段（图 5）。片段经回收测序，
确定获得了起始密码子ATG上游长度分别为 828 bp和 888 bp的片段。用TSSP-TCM软件分析PcAHS
基因起始密码子上游序列，预测出转录起始点为 A，这与普遍认为的转录起始点为 A（朱建裕 等，
2006）相同。用 DNAMAN 比较分析发现两个品种间 PcAHS 启动子碱基序列的相似性为 89.1%，推
测可能是‘中矮 1 号’PcAHS 启动子引起 PcAHS 的表达量较‘锦香’低。



图 5 PcAHS 基因启动子的克隆
M：DL2000 marker；1：‘中矮 1 号’；2：‘锦香’。
Fig. 5 PcAHS gene’s promoter clone
M：DL2000 marker；1：‘Zhongai 1’；2：‘Jinxiang’.
图 4 ‘中矮 1 号’和‘锦香’不同时期新梢韧皮部中
PcAHS 基因的相对表达量
Fig. 4 Relative expression levels of PcAHS gene in new shoot
phloem of two pear varieties in different periods
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用 PlantCARE 软件分析两品种 PcAHS 启动子序列，发现二者启动子都具有基本转录元件
TATA-box、CAAT-box，缺氧应答元件 ARE-motif，光应答元件 ATC-motif、Box4、Skn1、G-box 和
节律钟 Ciradian 等共有的作用元件；‘中矮 1 号’PcAHS 启动子上还具有胚乳特异表达相关元件
AACA-motif、低温响应元件 LTR、防御与逆境应答元件 TC-rich repeats、水杨酸响应元件
TCA-element、BFBP 转录因子结合元件 P-box 等‘锦香’没有的作用元件和一段 58 bp（–496 bp ~
–553 bp）缺失片段，推测片段缺失可能是‘中矮 1 号’PcAHS 启动子活性降低并导致新梢韧皮部
中的 PcAHS 表达量较‘锦香’低的一个原因，这使得生长素向基部运输量减少，进一步调节‘中矮
1 号’的生长发育。此外，‘锦香’PcAHS 启动子上也存在‘中矮 1 号’所不具备的作用元件，如光
应答元件 ATCT-motif、I-box 和 ERE（图 6）。





































图 6 PcAHS 基因启动子比对和分析
方框内代表启动子上的顺式作用元件，+ 1：转录起始位点，M：起始密码子。
Fig. 6 PcAHS gene’s promoter blast and analyze
Inside of the box represent the promoter cis-acting element. + 1：Transcription start site. M：Start codon.
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用 PlACE 对二者 PcAHS 启动子区域进行分析，发现两个品种中均具有 TATA-box 和 CAAT-box
等基本元件及多个与逆境应答有关的顺式作用元件，如病害和盐胁迫相关元件 GT1GMSCAM4；伤
害应答元件 WBOXNTERF3；二者 PcAHS 启动子上还含有多个转录因子结合位点，如 MYB 转录因
子识别和结合位点 MYB1AT、MYBCORE；MYC 转录因子识别位点 MYCCONSENSUSAT；WRKY
类转录因子结合位点 WRKY71OS；二者共有的序列还包含光调控元件 GT1CONSENSUS、
IBOXCORE。但光调控元件 -10PEHVPSBD、胚乳响应元件 AACACOREOSGLUB1、赤霉素响应元
件 GAREAT 和低温响应元件 LTRE1HVBLT49 为‘中矮 1 号’PcAHS 启动子所特有，乙烯响应元件
ERELEE4 为‘锦香’PcAHS 启动子特有（表 1）。

表 1 PLACE 分析 PcAHS 启动子顺式作用元件
Table 1 cis elements analysis of PcAHS promoter by PLCAE
功能
Function
元件与序列
Motif and sequence
位置
Location
参考文献
Reference
病原及盐胁迫应答
Pathogen and salt stress response
GT1GMSCAM4
（GAAAAA）
77+263+711-
（76+208+654-）
Park et al.，2004
伤害应答
Wound response
WBOXNTERF3
（TGACY）
786-
（729-）
Nishiuchi et al.，2004
MYB 转录因子结合序列
MYB transcription factor binding sequence
MYB1AT
（WAACCA）
107+164-
（193+）
Abe et al.，2003
MYBCORE
（CNGTTR）
871+
（811+414-）
Urao et al.，1993
MYC 转录因子识别
MYC transcription factor identification
MYCCONSENSUSAT
（CANNTG）
23+361-
（499+561-23-361-499-）
Abe et al.，2003
WRKY 转录因子结合位点
WRKY transcription factor binding sites
WRKY71OS
（TGAC）
38-600-787-
（38-545-730-）
Eulgem et al.，2000
光应答元件
Light response element
GT1CONSENSUS
（GRWAAW）
77+244+263+451+584+354+
（76+189+208+396+529-299-654-）
Zhou，1999
-10PEHVPSBD
（TATTCT）
123+ Thum et al.，2001
IBOXCORE
（GATAA）
244+355-
（189+300-）
Terzaghi & Cashmore，
1995
组织特异性表达相关元件
Tissue specificity express related components
CAATBOX
（CAAT）
40+49+307+403+517+398-
（49+252+348+462+462+456-）
Shirsat et al.，1989
TATABOX
（TATA）
218-
（273-127-140-）
Shirsat et al.，1989
乙烯响应元件
Ethylene-responsive element
ERELEE4
（AWTTCAAA）
（490+） Montgomery et al.，1993
赤霉素响应元件
Gibberellin response element
GAREAT
（TAACAAR）
167- Ogawa et al.，2003
低温响应元件
Low temperature response element
LTRE1HVBLT49
（CCGAAA）
759+ Dunn et al.，1998
胚乳响应元件
Endosperm-specific response element
AACACOREOSGLUB1
（AACAAAC）
166- Wu et al.，2000
注：+：正义链；-：反义链；括号内位置代表‘中矮 1 号’，括号外代表‘锦香’。
Note：+ ：Sense chain；-：Antisense chain；Figures inside and outside of brackets respectively represent‘Zhongai 1’and‘Jinxaing’in location
column.
3 讨论
植物生长素在茎尖及幼叶合成后，通过极性运输到根系来控制植株的生长（陈晓阳 等，
2011）。生长素合成量的减少及向基部的极性运输受阻会导致植株矮化（Noh et al.，2001；
Luschnig，2002），如依赖色氨酸的生长素合成途径中类黄素单加氧酶基因 YUCCA 突变后，造成生
长素合成量减少，导致植株矮小（Cheng et al.，2007）。但本课题组研究发现‘中矮 1 号’生长素
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合成部位——叶片中 IAA 的含量并不比乔化对照中的少（陈长兰，1996），说明其矮化并不是由生
长素合成酶及相关基因异常导致的，推测可能是由生长素合成后在从叶片源端向根系库端运输过程
中的载体蛋白或基因异常所致。目前研究发现，生长素运输载体ABCB1和ABCB19基因突变后生长
素显著低于野生型，导致植物矮小（Multani et al.，2003；Knöller et al.，2010）。本课题组利用转
录组测序分析发现生长素氢转运体基因 PcAHS 表达量在‘中矮 1 号’中显著低于母本‘锦香’。
本研究中从矮化砧木‘中矮 1 号’和其对照母本‘锦香’中克隆了 1 个生长素氢转运体基因
（PcAHS），测序结果表明 PcAHS 基因的碱基序列在两个品种中没有差异，因此‘中矮 1 号’的矮
化并不是由 PcAHS 基因突变导致的，但表达量分析发现‘中矮 1 号’在新梢韧皮部内表达显著低于
‘锦香’。Zhou（1999）和 Abe 等（2003）的研究表明转录因子或启动子差异可以导致基因表达水
平发生变化。因此，推测 PcAHS 基因表达量的不同可能是由于启动子序列差异或不同转录因子的
调控导致的。
进一步分离了‘中矮 1 号’和‘锦香’PcAHS 基因的启动子序列并进行比对发现二者的相似性
仅为 89.1%，且‘中矮 1 号’存在着一段 58 bp 的片段缺失。启动子片段缺失可能会导致启动子活
性减弱（朱建裕 等，2006），因此‘中矮 1 号’启动的片段缺失可能是导致 PcAHS 基因的表达量
低的原因。另外，基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基
因的表达（石翠翠 等，2014；田奇琳 等，2014）。在‘中矮 1 号’和‘锦香’PcAHS 基因的启动
子上存在诸多差异作用元件，如低温响应元件、防御与逆境应答元件、水杨酸响应元件、光调控元
件、BPBF 转录因子结合元件等。由于本试验中‘中矮 1 号’和‘锦香’的生长环境相同，因此 PcAHS
基因的表达差异是由于光、水杨酸等环境因子影响的可能性不大。前人研究发现转录因子 BPBF 能
结合在启动子的 P-box 元件（CCTTTT）上而抑制下游基因的表达（Mena et al.，1998），而本研究
中 P-box 元件正是‘中矮 1 号’所特有，因此，PcAHS 基因在‘中矮 1 号’中表达量低可能是由于
BPBF 转录因子与其启动子上 P-box 元件结合造成的。目前，还未见有对其他 AHS 基因启动子功能
的研究报道，其功能还有待于进一步的验证。

References
Abe H，Urao T，Ito T，Seki M，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K. 2003. Arabidopsis AtMYC2（bHLH）and AtMYB2（MYB）function as
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