全 文 ：园艺学报，2016，43 (2)：320–328.
Acta Horticulturae Sinica
320 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0696；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–12–15；修回日期：2016–02–01
基金项目：国家自然科学基金项目（31372049）；山东省良种工程项目（2012-2015）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chwang@qau.edu.cn）
梨 β–微管蛋白基因及其在矮生型与普通型梨
茎尖中的表达差异
侯董亮，王彩虹*，田义轲，肖玉雄，张 蓓
（青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109）
摘 要：以模式植物拟南芥的 β–微管蛋白为参考依据，通过电子克隆的方法，从西洋梨基因组中克
隆了 9 个 β–微管蛋白基因，并根据苹果和梨基因组间的保守性及共线性原理，实现了这些基因的染色体
定位。序列分析显示，这组基因均含有 3 个外显子和两个内含子。起源于全基因组复制事件而形成的成
对染色体上的基因不仅在外显子和内含子长度上具有较高的保守性，而且编码的氨基酸残基也有更高的
序列相似性。对 9 个 β–微管蛋白基因在矮生梨与普通梨杂种群体中的荧光定量表达分析表明，有 7 个基
因在茎尖组织中表达，其中定位于 chr16 上的转录本号为 PCP044487.1 的基因在矮生型和普通型梨茎尖中
的转录水平出现极显著差异，推测该基因可能与梨矮生性状形成的分子调控有重要关系。
关键词：梨；矮生性状；β–微管蛋白；基因结构；转录水平
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）02-0320-09

A Group of β-tubulin Genes and Their Expression Difference in Stem Tips
Between the Dwarf and Standard Type Pears
HOU Dong-liang，WANG Cai-hong*，TIAN Yi-ke，XIAO Yu-xiong，and ZHANG Bei
（College of Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China）
Abstract：Using the β-tubulins of Arabidopsis as references，9 β-tubulin genes were identified from
the Pyrus communis genome. These genes were mapped in the corresponding chromosomes based on the
principle of conservation and collinearity between the genomes of apple and pear. Sequence analysis
showed that each of these genes contain 3 exons and 2 introns. For the genes located in the pair of
chromosomes which originated from the genome wide duplication in evolution，the lengths of exons and
introns are more conserved，and their coding sequences of amino-acid residues are with higher similarity.
The result of qRT-PCR showed that，7 out of the 9 β-tubulin genes expressed normally in the tissue of stem
tips. Among them，the transcriptional level of the gene with the transcript number of PCP044487.1，
mapped in chromosome 16，is significantly different at P ≤ 0.01 between the dwarf type and the standard
type pears stem tips，which suggested that this gene probably related to molecular regulation of the dwarf
trait formation.
Key words：pear；dwarf trait；β-tubulin；gene structure；transcriptional level

侯董亮，王彩虹，田义轲，肖玉雄，张 蓓.
梨 β–微管蛋白基因及其在矮生型与普通型梨茎尖中的表达差异.
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真核生物中，微管在维持细胞形态、细胞的有丝分裂、细胞内物质运输和细胞壁的构建等方面
起着至关重要的作用。微管的排布方式在很大程度上决定了植物的生长发育和形态建成（黄聪聪 等，
2008）。植物微管蛋白是构成细胞的骨架成分，对保持细胞内部结构的有序性和维持细胞的形态有重
要作用。另外，微管蛋白与微纤丝的合成有关，从而影响植物细胞次生壁的生长和发育。植物微管
蛋白主要有 α–微管蛋白和 β–微管蛋白（时兰春 等，2007）。在植物的生长发育中，微管蛋白是
以基因家族的形式发挥作用，各成员之间相互协调作用，但不同成员可能行使不同的功能（饶国栋
等，2015）。自从 Ledbetter 和 Porter（1963）首次证实植物细胞中存在微管结构以来，在草本植物，
如拟南芥（Snustad et al.，1992）、水稻（Jeon et al.，2000；Yoshikawa et al.，2003）、大豆（Han et al.，
1991）、玉米（Villemur et al.，1994）、棉花（Whittaker & Triplett，1999；He et al.，2008）等植物中
分离鉴定了为数众多的 α–微管蛋白基因和 β–微管蛋白基因。后来，在木本植物杨树（Oakley et al.，
2007；饶国栋 等，2015）、桉树（陈鸿鹏 等，2014）等树种上也报道了一些 α–微管蛋白基因和 β–
微管蛋白基因。目前植物微管蛋白在果树上的研究甚少。近来有人从龙眼胚性愈伤组织中分离两条
β–微管蛋白基因（王亚婷 等，2014）。
果树的矮生性状有利于早花早果和果园管理，因此在矮密栽培上具有重要的应用价值。大量的
解剖学研究表明，矮生果树在茎组织结构上明显不同于普通型（Fideghelli et al.，2003；Elkins et al.，
2012；Hajagos & Végvári，2013）。‘Nein Vert’是在西洋梨中发现的矮生变异品种。20 世纪 90 年代，
本项目组从英国东茂林果树试验站引入携带‘Nein Vert’矮生基因的西洋梨种质资源，之后将其与
中国梨主栽品种进行了杂交，得到了矮生型与普通型性状分离的杂种群体。最近的研究发现，矮生
梨的茎不仅在疏导组织上，还在皮层及髓薄壁组织的细胞长度、胞壁厚度、细胞形状和排列方式等
方面有别于普通型梨（Chen et al.，2015）。造成这些表型效应的分子调控机制还不清楚。鉴于微管
蛋白对细胞形态发育有重要影响，本研究中对梨的 β–微管蛋白基因进行研究，以期了解其在矮生
梨茎尖中的表达特征，为进一步揭示矮生性状形成的分子机制提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
2015 年春季于青岛农业大学莱阳果树试验站从‘矮生梨’ב茌梨’的杂交群体中随机抽取 12
年生的矮生型及普通型杂种各 10 株。‘矮生梨’为西洋梨矮生品种‘Nein Vert’的一个矮生型实生
后代，树冠紧凑，树体矮小，着生大量短枝，一年生枝节间高度短缩，枝条尖削度小。‘茌梨’为中
国白梨主栽品种，树体表现为普通型。在杂种群体中，矮生型和普通型的表型差异明显，无中间类
型，通过目测评估即可。
2015 年 5 月中旬，从杂种实生树快速生长的新梢上切取茎尖组织（长度约为 0.5 cm），快速投
入液氮，带回室内，置于–70 ℃超低温冰箱保存备用。
1.2 RNA 的提取与反转录
茎尖总 RNA 的提取采用北京原平皓公司的 EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒，反转录反应
用 Fermentas 公司的 RevertAid First-strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒，具体步骤参考试剂盒说明书
进行。
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表 1 拟南芥的 9 个 β–微管蛋白
Table 1 The nine β-tubulin in Arabidopsis thaliana
蛋白名称
Protein name
GenBank 序列号
GenBank accession number
肽链长度/aa
Peptide length
TUB1 AEE35758 447
TUB2 AAA32881 450
TUB3 AAA32882 450
TUB4 AED95098 444
TUB5 AEE29922 449
TUB6 AED91783 449
TUB7 AEC08272 449
TUB8 AED93224 449
TUB9 AEE84372 444
1.3 梨 β–微管蛋白基因的克隆与定位
以 GenBank 中拟南芥的 9 个 β–微管蛋白
的氨基酸序列（表 1）为种子序列，在西洋梨
基因组的蛋白数据库 Pear draft genome v1.0
hybrid proteins（https：//www. rosaceae. org/tools/
ncbi_blast）中进行 BLASTp 搜索比对，选择
E-value 为 0 的蛋白序列号，然后在基因组中搜
索并下载其相应的蛋白序列。根据植物 β–微
管 蛋 白 的 特 征 结 构 域 进 行 筛 选 ， 并 用
DNAMAN 软件分析不同成员的氨基酸序列相
似性。根据筛选结果，用蛋白序列号在西洋梨
基因组中寻找相应的转录本，据此确定其在基因组中的位置。
1.4 基因结构特征比较与染色体定位
从西洋梨基因组数据库（https：//www. rosaceae. org/species/pyrus/pyrus_communis/genome_v1.0）
中下载相关基因序列，比较不同成员的外显子和内含子结构特点。用基因的编码序列在苹果基因组
中进行搜索，参考苹果基因组进行相应的染色体定位。
1.5 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析
取 1.0 μg 总 RNA，用 PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）进行反转录。将
反转录产物稀释 20 倍用于 qRT-PCR 分析。
根据不同成员的编码序列差异，设计各自的特征引物（表 2），用于基因转录水平的荧光定量表
达分析。PCR 产物范围：60 ~ 200 bp。以梨 Actin（AB190176.1）作为内参基因（引物序列：F：5′C
CCAGAAGTGCTCTTCCAAC3′；R：5′TTGATCTTCATGCTGCTTGG3′）。引物由上海生工合成。
qRT-PCR 在 LightCycler® 480Ⅱ（Roche）实时荧光定量 PCR 仪上进行。PCR 反应体系为 20 μL，
内含 1× LightCycler 480 GreenⅠMaster（Roche）、1.0 μL 稀释的反转录产物、0.25 μmol · L-1 正反向
引物、2.0 mmol · L-1 MgCl2。反应程序：95 ℃预变性 10 min，然后按照 95 ℃变性 10 s、58 ℃退火
10 s、72 ℃延伸 10 s 的程序进行 30 个循环。熔解曲线分析程序：PCR 反应结束后，将温度升至 95 ℃
5 s，然后降至 65 ℃ 1 min，再升至 97 ℃。从 65 ~ 97 ℃的升温过程中收集荧光（每升高 0.2 ℃收集
荧光 1 次）。最后一步将温度冷却至 40 ℃即可。每样品设 3 次重复。
用 2-Ct 方法（Livak & Schmittgen，2001）计算目标基因的相对表达量。t 测验分析差异显著性。
表 2 梨 β–微管蛋白基因 qRT-PCR 分析引物序列
Table 2 Primers of pear β-tubulin genes for qRT-PCR analysis
基因转录本号
Transcript
正向引物（5′–3′）
Forward primer
反向引物（5′–3′）
Reverse primer
PCP025803.1 CATGAATGATTTGGTTGCGG TAATTCTCTTCGGCACCTTC
PCP015491.1 GTTTAGGAGAGTGAGTGAGC CTCATCCTCGTATTCCTCCT
PCP030872.1 TGAGTTGATCGATTCGGTTCTT ACAGACAAGGTTGCGTTGTAA
PCP000517.1 GGAGTTGATCGATTCTGTTCTC ACAGACAGGGTTGCATTATAG
PCP014579.1 GAACGATCTGGTTTCTGAGT TCATACTCTTGCTGCTCATC
PCP009887.1 GGTAAGAGAAGAATTTCCGGAC GCTTAAGAGTCCTGAAGCAT
PCP011736.1 GATCAGAGAAGAATTCCCAGAT GCTTAAGAGTCCTAAAACAG
PCP044487.1 GGTCATGTTTAGGAGGAAGG CCAGCTCTTCCTCATCATAC
PCP010448.1 CCTACTTCGTTGAGTGGATC CTAGTCCTCGTAATGCTCTT
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2 结果与分析
2.1 梨 β–微管蛋白基因的克隆与定位分析
以拟南芥的 β–微管蛋白（表 1）为种子序列，在西洋梨上共搜索到 E-value 为 0 的蛋白序列共
12 个。其中 9 个含有植物的 β–微管蛋白的保守序列，包括微管蛋白标志信号片段 GGGTGSG（即
GTP 结合位点）和转录后调控片段 MREI（即磷酸化位点）（图 1）。这些蛋白的氨基酸序列长度在
378 ~ 540 aa，除了 PCP014579.1 和 PCP010448.1 之外，其余的肽链长度基本相近，为 440 ~ 450 aa。

图 1 梨 β–微管蛋白氨基酸序列比对
GTP 结合位点（GGGTGSG）和磷酸化位点（MREI）分别见方框位置。
Fig. 1 Amino acid sequences alignment of pear β-tubulins
The GTP binding site（GGGTGSG）and the phosphorylation site（MREI）was shown in the boxes，respectively.
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图 2 梨 β–微管蛋白氨基酸序列同源性分析
Fig. 2 Homology analysis of amino sequences for
β-tubulins in pear

基因组中的搜索结果表明，编码这些蛋白的基因分别位于 9 个不同的 scaffolds 上（表 3）。
目前公布的梨基因组未完成整条染色体的组装。但进化上，梨和苹果基因组间有高度的相似性
和共线性。有大量研究通过 DNA 分子标记标记建立了两个物种间遗传连锁群间的对应关系
（Pierantoni et al.，2004；Yamamoto et al.，2007；Celton et al.，2009；Fan et al.，2013）。据此，可
以确定染色体间的对应关系。因此，对这 9 个基因序列在苹果基因组数据库中进行搜索，找出了其
在苹果基因组中对应的染色体位置（表 3），从而也了解了这些基因在梨基因组中的染色体分布情况。
结果显示，这些基因分别位于染色体 chr12、chr4、chr11、chr3、chr6、chr14 和 chr16 上。

表 3 从西洋梨基因组数据库中搜索到的梨 β–微管蛋白及其编码基因
Table 3 β-tubulins and their coding genes searched from the genome database for Pyrus communis
蛋白/转录本序列号
Protein/transcript ID
肽链长度/aa
Peptide length
转录本在西洋梨基因组中的位置
Transcript location in Pyrus communis
genome
转录本在苹果基因组中的对应位置
Corresponding position of transcripts in
Malus × domestica genome
PCP025803.1 449 scaffold00017：560,469..563,663 (+) chr12：21148289..21209706
PCP015491.1 446 scaffold01170：44,736..47,120 (+) chr11：7374481..7389408
PCP030872.1 447 scaffold00420：235,246..237,490 (+) chr4：14553213..14601538
PCP000517.1 447 scaffold00241：34,877..36,967 (–) chr12：22846431..22865857
PCP014579.1 540 scaffold00030：207,546..210,266 (+) chr3：6945842..6954129
PCP009887.1 449 scaffold00047：191,446..193,849 chr6：23805661..23824789
PCP011736.1 449 scaffold00228：194,166..196,740 (+) chr14：28342538..28361846
PCP044487.1 443 scaffold00374：64,328..66,579 (+) chr16：16826720..16846026
PCP010448.1 378 scaffold00527：124,226..126,885 (+) –
注：括号内“+”表示正链序列，“–”表示负链序列。
Note：“+”and“–”in parentheses represent positive strand and negative strand sequences，respectively.

2.2 蛋白序列同源性分析
对以上 9 个蛋白的氨基酸序列进行比较分
析表明，它们之间的氨基酸同源性在 90%以上。
其中成员 PCP014579.1 和 PCP015491.1 间的同
源性接近 100%，成员间 PCP000517.1 和
PCP030872.1 以 及 成 员 PCP009887.1 和
PCP011736.1 的间的同源性接近 99%（图 2）。
根据表 3 中的染色体定位结果可知，它们
的编码基因分别位于染色体 chr3 和 chr11、
chr12 和 chr4、chr6 和 chr14 上。苹果基因组上
的研究认为，每对染色体的形成均与物种进化
史上的全基因组复制事件有关（Velasco et al.，
2010）。
2.3 基因结构比较
对 9 个蛋白的编码基因序列的比较结果显
示，它们在结构上相近，均由 3 个外显子和两
个内含子构成（图 3）。外显子的大小具有相对较高的保守性，其中，中间外显子长度在所有成员上
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均相同，而最后一个外显子长度有较为明显的变化。基因成员间在内含子的长度上差异较大。然而，
其中的两对基因（转录本号分别为：PCP030872.1 和 PCP000517.1、PCP009887.1 和 PCP011736.1）
不仅外显子长度相似，而且内含子长度也非常接近，它们分别位于因全基因组复制事件形成的成对
染色体上。因此，这种高度的保守性应源于基因组进化过程中染色体间的复制。


图 3 梨 β–微管蛋白基因结构比较
Fig. 3 Structure comparation of β-tubulin genes in pear

2.4 基因在矮生型与普通型梨茎尖中的转录水平比较
根据 mRNA 序列比较，设计各成员的特异引物，通过 PCR 扩增测序验证后进行荧光定量 PCR
分析。结果显示，在分析的 9 个基因中，除了转录本号为 PCP009887.1 和 PCP011736.1 的基因外，
其余成员均在茎尖组织中检测到了正常的表达。在正常转录的 7 个基因中，转录本号为 PCP010448.1
和 PCP044487.1 的基因的转录水平在矮生型和普通型间分别出现了显著差异和极显著差异，且矮生
型低于普通型（图 4）。其余各基因在两种类型间的转录差异均不显著。










图 4 β–微管蛋白基因在矮生型与普通型梨茎尖组织中的转录水平比较
Fig. 4 Tanscriptional levels comparison of β-tubulin genes in stem tips between dwarf type and standard type pears
* P ≤0.05；** P≤0.01.
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综合差异显著性和转录量来看，PCP044487.1 可能对矮生性状形成调控有较大影响。
3 讨论
目前已在拟南芥中发现了 9 个 β–微管蛋白基因（Snustad et al.，1992），在水稻上发现了 16 个
β–微管蛋白基因（Jeon et al.，2000；Yoshikawa，2003），在杨树上发现了 20 个 β–微管蛋白基因
（Oakley et al.，2007）。关于果树的微管蛋白基因的研究依然少有报道。但近年来，果树的基因组
测序进展十分迅速，很多重要的树种实现了全基因组测序，蔷薇科的苹果和梨均在其中。这些研究
成果极大地方便了基因的克隆、定位及功能分析。由于植物微管蛋白是一种高度保守的蛋白，本研
究在参考模式植物拟南芥的 β–微管蛋白序列的基础上，通过与西洋梨的基因组数据库的对比分析，
获得了 9 个梨的 β–微管蛋白基因。这些基因编码的氨基酸序列同源性达 90%以上。除了其中的两
个成员外，它们编码的氨基酸残基长度上也非常近似。以往，在杨树上报道的 20 个 β–微管蛋白基
因均由 3 个外显子和两个内含子组成（Oakley et al.，2007）。本研究中，梨的 9 个 β–微管蛋白基因
也都含有 3 个外显子和两个内含子。可见，这类基因在进化上的保守性很高。
基因的遗传定位对进一步研究基因的功能与进化具有重要意义。目前，已公布的梨基因组未完
成染色体的组装。然而，苹果和梨亲缘关系较近，二者的基因组间具有高度的保守性，染色体具有
共线性特征（Wu et al.，2013；Chagné et al.，2014）。因此，本研究参考苹果基因组，将 9 个梨 β–
微管蛋白基因分别定位于染色体 chr3、chr4、chr6、chr11、chr12、chr14 和 chr16 上。苹果基因组测
序分析认为 chr3 和 chr11、chr4 和 chr12、chr6 和 chr14 两两之间在染色体起源上具有同源性（全基
因组复制事件）（Velasco et al.，2010）。本研究中发现，位于这类成对的同源性染色体上的一些基因
在结构上也出现了相对较高的保守性，如位于chr4上的PCP030872.1和位于chr12上的PCP000517.1、
位于 chr6 上的 PCP009887.1 和位于 chr14 上的 PCP011736.1。出现这种现象的原因有可能是基因组
进化过程中染色体片段复制造成的。
微管蛋白不仅在保持细胞的形态方面起支撑作用，而且还影响纤维素和木质素的合成（时兰春
等，2007）。因此，微管蛋白合成方面的变化，会直接影响到细胞的生长与分裂，因而可能会对茎的
伸长生长造成影响，成为导致果树矮生的原因之一。近期研究发现，矮生型梨茎组织中细胞壁厚度、
细胞形状和排列方式确实与普通型梨存在极其显著的差异（Chen et al.，2015）。目前，造成这一矮
生性状的分子基础还不清楚。鉴于微管蛋白对细胞形态建成的作用，本研究对其编码基因在矮生型
与普通型上的表达差异进行了分析，找出了一个可能与梨矮生性状密切相关的家族成员，这为进一
步研究探讨矮生性状的调控机理有重要意义。
在植物中，不同的微管蛋白基因家族成员，可能行使的功能有差异。本研究中对 9 个 β–微管
蛋白基因的荧光定量表达分析结果显示，其中两个在茎尖组织中没有出现转录现象（转录本号为：
PCP009887.1 和 PCP011736.1）。这两个基因分别位于同源染色体 chr6 和 chr14 上，它们可能是假基
因，也可能是在发育的不同阶段表达的基因家族成员。在正常转录的 7 个成员中，发现只有转录本
号为 PCP044487.1 的基因在矮生型和普通型组间出现极显著的转录水平差异，且矮生型上的转录水
平显著低于普通型。从染色体定位结果来看，PCP044487.1 位于 chr16 上，与前期通过 DNA 标记定
位的矮生基因 PcDw 位于同一条染色体上（Wang et al.，2011）。但位置比较分析显示，两个位点间
的距离较远。因此，PCP044487.1为PcDw候选基因的可能性不大。根据本研究结果推测，PCP044487.1
有可能参与到矮生性状形成的分子调控过程，但具体的作用机制，还有待进一步的探究。
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