全 文 ：园艺学报，2016，43 (3)：578–586.
Acta Horticulturae Sinica
578 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0932；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–12–21；修回日期：2016–03–18
基金项目：高等学校博士学科点专项新教师基金项目（20122325120014）；农业部公益性行业科技专项项目（201303112）；哈尔滨市科
技局青年科技创新人才项目（2013RFQXJ029）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：spqu@neau.edu.cn）
印度南瓜转录组 SSR 信息分析及其多态性研究
王洋洋，单文琪，徐文龙，崔崇士，屈淑平*
（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）
摘 要：对印度南瓜（Cucurbita maxima）开展转录组测序分析，共获得 131 960 条 unigene（90.80 Mb），
筛选得到 12 557 个 SSR 位点（占总 unigene 的 9.52%），其发生频率为 1/7.4 kb；其中 SSR 位点中主导类
型为二核苷酸重复，占总 SSR 的 49.82%；其次是三核苷酸重复，其出现频率为 45.31%。通过 Primer5 设
计得到 7 290 对 SSR 引物，随机选择 20 对 SSR 引物对 30 种不同来源的南瓜进行多态性验证分析，结果
显示在 14 对可扩增产物的 SSR 引物中，11 对引物表现稳定可重复的多态性，UPGMA 多态性分析显示
11 对引物可将 30 份南瓜材料分为 5 类。研究表明通过对南瓜转录组分析可获得较高频率的 SSR 位点且
类型丰富，为印度南瓜遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了候选标记。
关键词：印度南瓜；转录组；SSR；多态性；遗传多样性
中图分类号：S 642.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0578-09

Analysis on SSR Information in Transcriptome and the Polymorphism of
Cucurbita maxima
WANG Yang-yang，SHAN Wen-qi，XU Wen-long，CUI Chong-shi，and QU Shu-ping*
（Horticulture College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）
Abstract：A total of 131 960 unigenes（90.80 Mb）were obtained by using transcriptome sequenceing
analysis in Cucurbita maxima，and 12 557 simple sequence repeat（SSR）loci（9.52%）with the frequency
of 1/7.4 kb were then identified. Among all SSR loci，dinucleotide repeat was the main type（49.82%），
followed by trinucleotide repeat motif（45.31%）. A total of 7 290 SSR primers were designed and 20
primers were selected randomly for PCR amplification using 30 pumpkin materials with different sources.
Results showed that 14 primers could produce clear and reproductive bands，within which 11 SSR markers
performed polymorphical bands. The pumpkin materials could be divided into five groups according to the
UPGMA analysis. Results of this present study indicated that SSR markers with high frequency and
various types could be acquired by transcriptome sequencing. The SSR markers obtained in the present
study could be candidate markers for genetic diversity analysis and genetic mapping construction in
Cucurbita maxima.
Key words：Cucurbita maxima；transcriptome；SSR；polymorphism；genetic diversity


王洋洋，单文琪，徐文龙，崔崇士，屈淑平.
印度南瓜转录组 SSR 信息分析及其多态性研究.
园艺学报，2016，43 (3)：578–586. 579

南瓜（Cucurbita L.，2n = 2x = 40）在世界范围内广泛分布（陈沁滨 等，2008），主要有印度南
瓜（C. maxima）、中国南瓜（C. moschata）、美洲南瓜（C. pepo）、黑籽南瓜（C. ficifolia）和墨西哥
南瓜（C. mixta）等 5 个栽培种（魏瑛和董秀珍，1997；林佩德，2000），具有很高的营养价值和药
用价值（范文秀和李新峥，2005；刘洋 等，2006），此外，其生物多样性、遗传多样性和生态多样
性十分丰富，堪称“多样性之最”（王鸣，2002）。
人们为了从分子水平上了解南瓜种质资源的遗传多样性，已经应用 RAPD（李俊丽 等，2005；
肖祖梅，2008）、ISSR（杨正安 等，2011）、AELP（张天明，2005）、SRAP（卢丽芳 等，2015）、
SSR（屈淑平 等，2013；李鹤 等，2014）等标记对南瓜的遗传多样性进行分析。
SSR（Simple sequence repeat，微卫星序列即简单重复序列）分子标记，广泛存在于真核和原核
生物基因组中（Kalia et al.，2011）。因其具有多态性高、操作简单、重复性好、稳定性高、成本低
廉、呈共显性等优点（Ellegren，2004），被大量应用于遗传图谱建立（石星星 等，2016）、遗传多
样性分析（Priori et al.，2013）、品种鉴定（杨宏 等，2015）等方面。
目前已开发的南瓜属 SSR 标记主要来自于美洲南瓜的基因组（Gong et al.，2008）、转录组（Blanca
et al.，2011）和中国南瓜转录组（Wu et al.，2014）数据，这些 SSR 标记具有一定的通用性，但同
一个属内不同种之间，还是具有一定程度的保守性，在印度南瓜上表现为多态性较低（向成钢 等，
2013；李雪，2014），限制了其在印度南瓜上的应用。截止至 2015 年 12 月，GenBank 中公布的 EST
序列仅有 1 105 余条，不足以开发大批量的 SSR 标记。本研究中通过 Illumina HiSeqTM2000 转录组
测序（RNA-Seq）获得 131 960 条印度南瓜转录组序列，利用 MicroSAtellite（MISA）软件进行大规
模转录组 SSR 标记的搜索，分析其分布、组成特征，开发 SSR 引物，并进行可用性评价，以期为
利用 SSR 分子标记进行印度南瓜种质资源多样性分析、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料及 DNA 提取
用于对所设计引物进行筛选和可用性评价的材料为本课题组收集保存的 30 份南瓜材料（表 1），
包括 5 份美洲南瓜（Cucurbita pepo）、19 份印度南瓜（Cucurbita maxima）、3 份中国南瓜（Cucurbita

表 1 南瓜材料
Table 1 List of pumkin
类型
Type
序号
No.
名称或编号
Name or code
类型
Type
序号
No.
名称或编号
Name or code
美洲南瓜 Cucurbita pepo 1 2013-2 印度南瓜 Cucurbita maxima 10 2013-1
2 金杂 8 号 Jinza 8 11 SW-3
3 角杂 002 Jiaoza 002 12 丹都 Dandu
4 籽番 668 Zifan 668 13 龙疆 092 Longjiang 092
5 宝库 5 号 Baoku 5 14 雪城 2 号 Xuecheng 2
中国南瓜 Cucurbita moschata 25 杂 68 Za 68 15 先丰 102 Xianfeng 102
26 杂 66 Za 66 16 南北杂 04 Nanbeiza 04
29 密本 3 号 Miben 3 17 谢花面 Xiehuamian
厄瓜多尔南瓜 27 PI 390455 18 98-2
Cucurbita ecuadorensis 28 PI 432443 19 SH-Z11
黑籽南瓜 Cucurbita ficifolia 30 黑籽 1 号 Heizi 1 20 国品天香 Guopin Tianxiang
印度南瓜 Cucurbita maxima 6 银辉 4 号 Yinhui 4 21 SH-Z17
7 045-3 22 达可 Dake
8 籽多收 1 号 Ziduoshou 1 23 2013-12
9 SW-2 24 9-6
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moschata）、1 份黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia）、2 份野生南瓜（Cucurbita ecuadorensis）。每个南瓜
材料选取种子 10 粒进行 33 ℃ 36 h 温烫浸种催芽，待胚根长到 2 ~ 3 cm，利用 CTAB 法提取南瓜
萌发根尖 DNA。
1.2 转录组数据来源
印度南瓜转录组数据来源于本课题组对印度南瓜强雌品系‘2013-12’和强雄品系‘9-6’茎尖
进行 Illumina 高通量测序的结果。2015 年 4 月在东北农业大学园艺设施工程中心的人工气候室中播
种上述两个品系，采取 2 个发育时期（第 1 片真叶 1 cm、第 10 片真叶 1 cm）的茎尖，委托上海欧
易生物医学有限公司使用 Illumina HiSeqTM 2000 测序仪进行转录组测序，并通过 De Novo 方法
（Grabherr et al.，2011）组装得到 131 960 条 unigene，作为分析背景数据。
1.3 转录组 SSR 位点鉴别及 SSR 引物设计
使用软件 MISA 对南瓜转录组中 unigene 的 cDNA 序列数据进行 SSR 位点分析，筛选的标准为：
重复单元长度 2 ~ 6 bp，二核苷酸重复次数至少 6 次以上；三核苷酸、四核苷酸重复次数至少 5 次；
五核苷酸、六核苷酸重复次数至少 4 次；复合核苷酸碱基被间隔小于或等于 100 bp，单核苷酸重复
容易发生错配而测序失败，所以没有选择。
使用软件 Primer 5 对 SSR 重复单元前后的序列进行引物设计及评价，每条 SSR 产生 1 ~ 6 条引
物。引物序列长度 12 ~ 25 bp，预计扩增产物长度 100 ~ 280 bp，GC 含量 40% ~ 60%，退火温度 55 ~
65 ℃，上、下游引物的退火温度值相差不大于 3 ℃（李翠婷 等，2014）。
设计引物时，引物不能存在 SSR，此外与 unigene 序列比对时，其 5′端允许有 3 个碱基的错配，
3′端允许有 1 个碱基的错配，最后筛选出唯一匹配的引物（李珊 等，2010）。从中随机挑选 20 对 20
bp 以上的 2 ~ 6 不同重复单元核苷酸引物，由华大基因有限公司合成。
1.4 PCR 扩增
PCR 扩增反应体系 20 μL：Premix Taq 酶 8.5 μL（康为），10 μmol · L-1 上、下游引物各 1 μL，
10 ng · μL-1 DNA 1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 反应热循环程序为：95 ℃变性 5 min；然后在 94 ℃ 30
s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 下循环 35 次；72 ℃延伸 10 min；最后在 4 ℃条件下保存。特异性引物
扩增后的产物用 1%琼脂糖检测，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，160 V 电压，90 min，银染显色。
1.5 数据处理
采用人工读带的方法，将电泳图上可重复的清晰条带记为“1”，同一位置无带或不易分辨的弱
带记为“0”，建立原始数据矩阵。利用软件 NTsys2.10e 按 UPGMA 进行聚类绘图。
2 结果与分析
2.1 印度南瓜转录组中的 SSR 位点的数量与分布
利用 MISA 工具对印度南瓜转录组的 131 960 条 unigene（90.80 Mb）的 cDNA 序列进行搜索，
在7 912条unigene中找到 12 557个符合条件的SSR位点，发生频率（含SSR的unigene数与总unigene
数之比）为 6.00%，出现频率（检出 SSR 个数与总 unigene 数之比）为 9.52%。其中含 1 个 SSR 位
点的 unigene 序列有 4 424 条，含复合型 SSR 位点的 unigene 序列有 1 428 条，平均 7.4 kb 就能发现
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1 个 SSR 位点。
印度南瓜转录组 SSR 种类较为丰富，从重复次数看，发现重复基元以重复 6 次出现的频率最高，
有 3 821 个，占总 SSR 的 30.43%。其次为 5 次和 7 次重复，分别占总 SSR 数量的 26.44%和 17.68%
（表 2）。从出现频率来看，主要集中在二核苷酸、三核苷酸重复基元上，主导类型重复基元类型是
二核苷酸重复基元，占总 SSRs 的 49.82%，其次是三核苷酸重复基元，占总 SSRs 的 45.31%。SSRs
所包含的重复基元中，二核苷酸重复基元 TC/GA 和 CT/AG 为优势重复基元类型。四核苷酸、五核
苷酸、六核苷酸重复基元类型分布较少，出现频率较低。

表 2 印度南瓜转录组中 SSR 类型分布
Table 2 Distribution of SSR type in transcriptome of Cucurbita maxima
重复次数 Repeat 基序类型
Motif type 5 6 7 8 9 10 11 > 11
总计
Total
比例/%
Proportion
2 0 1 888 1 257 1 007 1 050 811 232 12 6 257 49.82
3 2 825 1 836 957 66 2 1 0 3 5 690 45.31
4 432 76 2 3 0 0 0 1 514 4.09
5 44 8 0 4 1 0 0 0 57 0.45
6 19 13 4 2 0 0 0 1 39 0.31
总计 Total 3 320 3 821 2 220 1 082 1 053 812 232 17 12 557
比例/% Rate 26.44 30.43 17.68 8.62 8.39 6.47 1.85 0.14 100

2.2 印度南瓜转录组 SSR 的可用性评价
判断 SSR 分子标记可用性的重要依据之一是其多态性（李珊 等，2010）。SSR 的长度是影响其
多态性高低的重要因素，当 SSR 长度≥ 20 bp 时多态性较高，12 ~ 20 bp 之间的多态性中等，小于
12 bp 的多态性极低（Temnykh et al.，2001）。因此在本研究中将低于 12 bp 的 SSR 去掉。经过筛选
印度南瓜 SSR的总数为 7 290条（长度在 12 ~ 158 bp），其中长度在 12 ~ 20 bp的有 6 998条（95.99%）；
而长度在 20 bp 以上的达到 292 条（4.01%），这类 SSR 具有较高多态性。
2.3 印度南瓜转录组 SSR 引物设计与筛选
为进一步在试验中利用筛选出的印度南瓜 SSR 引物，对含 SSR 位点的 131 960 条印度南瓜序列
进行引物设计，去除不符合条件的引物，随机选择 20 bp 以上 SSR 序列 100 条，于华大基因有限公
司合成。挑选 20 对 SSR 引物并使用印度南瓜品系‘98-2’的 DNA 进行扩增，验证引物的有效性。
结果表明，14 对引物实现有效扩增（图 1 中的亮白条带），占 20 对 SSR 引物的 70%。

图 1 引物有效性扩增验证图
Fig. 1 Figure of effectiveness on primer amplification
M：Marker；1：comp101053_c0_seq1；2：comp107035_c0_seq1；3：comp11018_c0_seq1；4：comp11925_c0_seq1；5：comp13350_c0_seq2；
6：comp19204_c0_seq1；7：comp20603_c0_seq1；8：comp20708_c0_seq1；9：comp23748_c0_seq1；10：comp24325_c0_seq2；
11：comp26019_c0_seq1；12：comp27618_c0_seq1；13：comp28629_c0_seq2；14：comp28857_c0_seq1；
15：comp32835_c0_seq1；16：comp3321_c0_seq1；17：comp34467_c0_seq3；18：comp34535_c0_seq2；
19：comp36580_c0_seq2；20：comp37214_c0_seq1.
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2.4 多态性分析
利用以上 14 对有效扩增引物在 30 个不同南瓜品种中进行多态性分析，其中 11 对引物存在多
态性差异（表 3），占有效扩增引物数量的 78.57%。

表 3 PCR 筛选引物
Table 3 Filtering primers with PCR
来源
Source
SSR 类型
SSR motif
产物长度/bp
Length of product
引物序列
Primer sequence
comp107035_c0_seq1 （AC）*6 165 F：TGGAATTTGTTGGAGTCAGATG
R：ACGACCCCCTACAATGACAA
comp11018_c0_seq1 （TCA）*6 220 F：GGGAGGCTACGAAGGAAAAG
R：CAATGGGGAAGTGGTAGGTG
comp11925_c0_seq1 （GAA）*5 243 F：CCGTGCCAATTCTCTCTCTC
R：AACCAACAGCCAACTTCACC
comp13350_c0_seq2 （GA）*9 217 F：GGACGAGGAGGTTTCAACAA
R：AAGGAAGCAAGAACACTCGG
comp19204_c0_seq1 （AG）*6 130 F：TCCCAACACTCCAAACACAA
R：GCGATGATCTTGTTGCTTCA
comp20603_c0_seq1 （TC）*6 177 F：GGCCATGGAAAAGTACCTGA
R：CGCATACCCAACATGAAGAA
comp28857_c0_seq1 （TGAG）*5 187 F：GACCAACCTCTTTCCCATCA
R：AAGGCGTAATAGCAGCTCCA
comp3321_c0_seq1 （AC）*6 145 F：ATTCTGAACTCCGAAGGGGT
R：GCATTTTCTCCCAATGGAAA
comp34535_c0_seq2 （TGA）*5 170 F：AGGACAAGCTGAAAGCCAAA
R：CCAAACCCAAACACCAAGTC
comp37214_c0_seq1 （GAA）*5 242 F：CGTGTGCTCTTCCGATCT
R：CGATGGGAAAGAAGGATGAA
comp23748_c0_seq1 （TCC）*6 160 F：CCCTCAAAATGCACCAATCT
R：AATCTTGAGGTTTGCATGGG

11 对多态性引物在不同南瓜材料中扩增产物片段长度均介于 100 ~ 250 bp 之间，与预期相符，
图 2 和图 3 为 comp34535_c0_seq2 和 comp28857_c0_seq1 的扩增产物片段。

图 2 多态性引物 comp34535_c0_seq2 在不同南瓜材料中的扩增
M：Marker；品种编号名称见表 1。
Fig. 2 comp20603_c0_seq1PCR product of polymorphism of SSR primers in different Cucurbita maxima varieties
M：Marker；Code name are shown in Table 1.



图 3 多态性引物 comp28857_c0_seq1 在不同南瓜材料中的扩增
M：Marker；品种编号名称见表 1。
Fig. 3 comp27618_c0_seq1 PCR product of polymorphism of SSR primers in different Cucurbita maxima varieties
M：Marker；Code name are shown in Table 1.
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利用 11 对多态性引物对 30 个不同南瓜材料进行聚类分析，被分成 5 大类（图 4），第 1 类 5 份
材料属美洲南瓜类（1 ~ 5）；第 2 类 3 份材料，属中国南瓜类（25、26 和 29）；第 3 类 1 份材料，
属黑籽南瓜（30）；第 4 类 19 份材料，属印度南瓜类（6 ~ 24），按照亲缘关系远近，被分为 4 大类，
其中材料 6、10、23、9（来源于同一单位，具有共同亲本材料）和材料 11、18、20 归为一类；材
料 7、12、19、21、17、22 均为肉用南瓜归为一类；材料 8、14 和 15 虽然来自不同单位但归为一
类；材料 13、16、24 来自于同一单位归为一类。第 5 类 2 份材料，属野生南瓜类（27、28）。根据
聚类发现，黑籽南瓜与中国南瓜的遗传距离最近，与美洲南瓜次之，且三者均离印度南瓜较远；中
国南瓜与美洲南瓜的遗传距离大于中国南瓜与印度南瓜的距离；野生南瓜与其他 4 个南瓜群距离最
远。


图 4 供试南瓜材料的 UPGMA 聚类图
品种编号名称见表 1。
Fig. 4 Dendrogram for tested pumpkin by UPGMA
Code name are shown in Table 1.
3 讨论
由于各物种在 GenBank 中数据大小、计算标准不同，或是在物种间真实的 SSR 信息存在差异
（黄海燕 等，2013）时，不同物种的出现频率也大不相同。在印度南瓜 131 960 条 unigene 中，共
搜索出 12 557 个 SSR，平均出现频率是 1 /7.4 kb，其出现频率与大豆（1/7.4 kb）（Gao et al.，2003）
相似、高于小麦（1/15.6 kb）（Eujayl et al.，2002）及拟南芥（1/13.83kb）、番茄（1/11.1kb）、棉花
（1/20.0 kb）、杨树（1/14.0kb）（Cardle et al.，2000；Varshney et al.，2005）等植物，这表明印度南
瓜转录组中 SSR 数量很丰富。
研究发现，印度南瓜转录组 SSR 重复基元中，二核苷酸重复基元和三核苷酸重复基元为主要重
复类型，二核苷酸重复基元 TC/GA 和 CT/AG 为优势重复基元类型，与张国裕（2011）对南瓜属
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EST-SSR 标记开发的研究结果一致，这种占优势的重复基元可能与其编码相应蛋白质的使用频率较
高有关（范三红 等，2003）。
随机挑选 20 对引物，使用印度南瓜品系‘98-2’的 DNA 检查引物的特异性，结果表明，14 对
引物实现有效扩增，其中 11 对引物在不同南瓜材料中存在多态性差异。这说明印度南瓜序列中 SSR
位点多，SSR 引物扩增率较高，同时其多态性也相对较高，主要源于其 DNA 转录序列的保守性（刘
峰 等，2012）。
使用上述 11 对多态性差异引物对 30 个南瓜品种进行 UPGMA 聚类，被分为 5 类。其中黑籽南
瓜与中国南瓜的遗传距离小于黑籽南瓜与美洲南瓜，这是因为黑籽南瓜与中国南瓜的亲缘关系更近
于黑籽南瓜与美洲南瓜（刘永庆 等，1988）；三者较于印度南瓜，其亲缘关系更近，可能是因为三
者起源于同一中心带中南美洲，而印度南瓜起源于南美洲，这与前人采用不同标记手段得出的分类
结论一致（李海真 等，2000；向成钢 等，2013）；中国南瓜与美洲南瓜的距离大于中国南瓜与印度
南瓜的距离，这与向成钢等（2013）的结论相符；野生南瓜类与上述 4 种南瓜类遗传距离最远，可
能因其为多年生南瓜，且未被驯化的原因。本研究比较准确地反映出 30 个南瓜品种之间的差异，由
于本研究使用的多态性引物及南瓜材料较少，没有更深的探究南瓜种质资源之间的遗传信息和遗传
关系，所以还需要更多的分子标记来验证。
综上所述，印度南瓜转录组 SSR 出现频率高、类型丰富，具有较高的可用性，为印度南瓜的分
子标记辅助育种和功能基因的挖掘等奠定了基础，同时对南瓜分子标记类型、遗传资源评价、绘制
遗传图谱、实现特定性状的辅助选择和进行比较基因组学研究也有重要意义。

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