全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（1）：1–8 http：// www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail：yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–08–30；修回日期：2013–12–11
基金项目：国家自然科学基金项目（31272150）；长江学者和创新团队发展计划项目（PCSIRT）；国家高科技研究发展计划（863 计划）
项目（2011AA100205）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-27）；农业部公益性行业（农业）科研专项（2010 03067-02-4）；
重庆市科委重点实验室专项经费项目（CSTC）；重庆市自然科学基金项目（CSTC2011JJA80029）；中央高校基本科研业务费专项
（XDJK2011C003）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zouxiuping@cric.cn；scchen2004@vip.sina.com；Tel：023-68349020）
异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达
许兰珍，彭爱红，何永睿，姚利晓，雷天刚，刘小丰，姜国金，邹修平*，
陈善春*
（西南大学柑橘研究所/中国农业科学院柑橘研究所，国家柑橘工程技术研究中心，国家柑橘品种改良中心，重庆
400712）
摘 要：为了筛选在柑橘韧皮部中特异表达的启动子，构建 GRP、Rolc、RSSl 异源韧皮部特异启动
子控制 GUS 报告基因的植物表达载体，转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS 组织化学染色
分析表明，3 个启动子均显示了维管束组织特异性。其中，GRP 启动子活性强，且具有严格的韧皮部组织
特异性；Rolc 启动子活性最强，在根和茎中呈组成型表达；RSSl 启动子活性最弱。Real-time RT-PCR 和
GUS 酶活性分析进一步证明了 GRP 启动子具有较强的韧皮部组织特异性，该启动子有望应用于柑橘抗黄
龙病基因工程育种。
关键词：枳；韧皮部特异性启动子；遗传转化；GUS
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）01-0001-08

Expression Analysis of Three Phloem-specific Promoters in Transgenic
Poncirus trifoliata
XU Lan-zhen，PENG Ai-hong，HE Yong-rui，YAO Li-xiao，LEI Tian-gang，LIU Xiao-feng，JIANG
Guo-jin，ZOU Xiu-ping*，and CHEN Shan-chun*
（Citrus Research Institute，Southwest University；Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences；
National Citrus Engineering Research Center；National Center for Citrus Varieties Improvement，Chongqing 400712，
China）
Abstract：For screening phloem-specific promoters in citrus，the plant expression vectors containing
GUS reporter cassette driven by Glycine-rich protein gene promoter（GRP）from Vigna unguiculata（Linn.）
Walp（bean），Agrobacterium Rhizogenes RolC gene promoter（Rolc）from Agrobacterium rhizogenes and
Sucrose synthase 1 gene（RSSl）promoter from Oryza sativa（rice）were constructed，and introduced into
the Poncirus trifoliata（L.）Raf. seedling epicotyls by Agrobacterium-mediated transformation.
Histochemical β-glucuronidase（GUS）analysis revealed vascular-specific expression of the GUS protein in
citrus. The GRP promoter displayed strong and strict phloem-specific expression pattern in this study while
the RSS1 promoter could drive low levels of GUS gene expression in citrus. Strong constitutive expression

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of GUS driven by the Rolc promoter was detected in root and stem. These results were further confirmed
by reverse transcription real-time polymerase chain reaction and quantitative GUS enzyme activity assays.
The strong vascular-specific promoter i.e. GRP promoter provides a good candidate for targeting
expression of antibacterial constructs to battle Citrus huanglongbing disease（HLB or citrus greening
disease），associated with a phloem-limited Gram-negative bacterium
Key words：Poncirus trifoliata；phloem-specificity promoter；genetic transformation；GUS

植物基因工程中常用的启动子是花椰菜花叶病毒 CaMV 35S 组成型启动子，它控制抗病、抗虫
等基因在植物体内各部位超量表达，难以在受侵害的靶组织如韧皮部形成较高的作用浓度。而且，
外源基因在植物体内过量表达易带来诸如持续激活植物在逆境条件下才合成的蛋白质和代谢产物、
打破植物体内激素平衡、连续刺激系统免疫应答反应等不利影响，进而影响植物的生长发育和产量
（Gurr & Rushton，2005）。
柑橘黄龙病是一种系统性的毁灭性病害，植株染病后，其根、树干、枝、叶、花、果都有病原，
目前还未找到有效的防治药剂，已发展成为世界性的柑橘病害，在亚洲、非洲和美洲的 40 多个国家
均有严重发生，每年给柑橘产业造成巨大的经济损失。柑橘黄龙病病原属于一种韧皮部杆菌属
（Garnier et al.，1984；Huang，1987）。韧皮部是植物维管组织的一部分，负责植物体内糖等有机养
料从叶到其他组织器官的运输而成为许多植物病虫害，特别是细菌、真菌、病毒等植物病源和刺吸
式昆虫的直接侵害目标。如果利用韧皮部特异表达启动子调节功能基因在维管组织中高效特异地表
达，就可以更经济有效地发挥功能基因（如抗菌肽基因）的作用，提高植物的抗病能力。
本研究中以柑橘优良砧木枳为遗传转化受体，评价了 3 种韧皮部特异表达启动子在柑橘中的表
达特异性，对今后利用基因工程技术培育抗黄龙病柑橘新种质具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2011 年 3 月至 2012 年 9 月在中国农业科学院柑桔研究所国家柑桔品种改良中心完成。
分别以发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）、水稻（Oryza sativa）和豇豆[Vigna unguiculata（Linn.）
Walp]的基因组 DNA 为模板，在前人研究（Keller & Heierli，1994；Saha et al.，2007）的基础上，
采用 PCR 法克隆到具有韧皮部特异表达的启动子序列（各启动子 PCR 扩增引物如表 1），它们是 918
bp 的发根农杆菌 RolC 基因启动子（Rolc）、1 900 bp 的水稻蔗糖合成酶基因启动子（RSS1）、608 bp
的豇豆富甘氨酸蛋白基因启动子（GRP），然后以本实验室保存的质粒 PBI121（35S 启动子）为骨
架，分别用上述 3 个不同来源韧皮部特异启动子替代 CaMV 35S 启动子构建不同启动子控制 GUS
报告基因的植物表达载体，依次命名为 PBI121-Rolc、PBI121-RSS1、PBI121-GRP，正对照为 PBI121
（图 1）；枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]无菌上胚轴由本实验室提供。
表 1 各启动子 PCR 扩增特异引物序列
Table 1 sequence of primers used to amplify the phloem-specific promoters
启动子名称 Promoter 引物序列 Prime sequence 扩增长度/ bp Amplicon length
Rolc Rolc-F 5′-CGGTACCTTAGCGAAAGGATGTC-3′
Rolc-R 5′-CTCTAGAAACAGGTTGCTTGTAC-3′
918
RSS1 RSS1-F 5′-CAAGCTTGAAATCCACCAAATCAAAC-3′
RSS1-R 5′-CTCTAGAAAGGTTACACTTAGC-3′
1 900
GRP GRP-F 5′-CAAGCTTGAAGCCATATCAATGG-3′
GRP-R 5′-CTCTAGAGTGAAGTGAAGCTG-3′
608
1 期 许兰珍等：异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达 3


图 1 不同来源启动子调控植物表达载体 T-DNA 结构图
Fig. 1 The plant expression vectors containing the different sources of
vascular-specific expression promoters
1.2 方法
1.2.1 枳上胚轴遗传转化、再生及抗性芽生根培养
枳上胚轴遗传转化参照 Zou 等（2008）方法，转化上胚轴经组织培养再生不定芽，经卡那霉素
（Km）抗性筛选成活的不定芽，待抗性芽长到 1 cm 左右时转移到生根培养基[0.5 mg · L-1 IBA、1
mg · L-1 NAA、250 mg · L-1 羧苄西林（carb）]中培养，1 个月后生根苗移栽到温室中备用。
1.2.2 转基因植株的 PCR鉴定
取转化获得的 Km 抗性苗和非转基因植株叶片各约 100 mg，使用 Aidlab 公司试剂盒（cat.No.
DN15）方法提取基因组 DNA，用引物 GUS-F 5′-CGTGCTGCGTTTCGATGCGG-3′和 GUS-R
5′-CTGCCACTGACCGGATGCCG-3′进行 PCR 扩增，检测 GUS 的整合，目的片段大小为 575 bp。
反应体积 25 μL。反应条件 ：94 4 min℃ ；94 30 s℃ ，56 45 s℃ ，72 45 s℃ ，30 次循环；72 10 ℃
min。
1.2.3 GUS组织化学染色分析
上述 PCR 检测为阳性的植株在温室中生长 3 个月后，取根、茎、叶进行 GUS 组织化学染色
（Jefferson，1987）。取上述组织放入新鲜配置的 X-Gluc 染色液中，37 ℃保温过夜。待充分染色后，
用 75%（体积比）乙醇脱色 2 ~ 3 次，至非转基因对照材料呈白色，并进行体视显微镜下的观察和
照相。同时对所有 PCR 阳性植株的根、茎、叶各组织 GUS 基因表达活性进行统计分析。
1.2.4 转基因植株 GUS酶活性测定
随机选取 4 个启动子转基因植株 5 个株系及非转基因植株的成熟叶片，液氮中磨碎，采用磷酸
缓冲液法提取总蛋白，按照 Bradford（1976）法测定样品蛋白质含量；用分光光度法检测各样品中
GUS 酶活力（Richard，1987），检测方法简述如下：以对硝基苯基–β–D–葡萄糖醛酸苷（P-
nitrophenyl-β-D-glucuronide，PNPG）为底物，GUS 催化其水解，生成对硝基苯酚（P-nitrophenol），
在 pH 7.15 时，溶液呈黄色，离子化的发色团吸收波长为 400 ~ 420 nm 的光。酶活力计算时先以酶
反应时间对生成对硝基苯酚含量作图，直线部分斜率即为酶反应初始阶段的速率。酶活力单位定义
为以每分钟水解 PNPG 生成 1 nmol 对硝基苯酚的酶量为一个单位。根据定义求出各样品的酶活力。
GUS 酶活力（U）以每分钟每毫克蛋白的酶活力表示（nmol · mg-1 · min-1）。
1.2.5 转基因植株 RNA水平 Real-time PCR定量分析
取转基因植株的叶片，提取总 RNA（Aidlab，cat.No.RN09）为模板，反转录成 cDNA（BIO-RAD
iScriptTM cDNA Synthesis Kit，cat.No.170-8891），按照 Real-time PCR 试剂盒（BIO-RAD iQTM SYBR
Green Supermix，cat.No.170-8882AP）说明书进行定量分析。内标基因 actin 表达的检测引物序列：
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actin-F 5′-CATCCCTCAGCACCTTCC-3′和 actin-R 5′-CCAACCTTAGCACTTCTCC-3′；GUS 基因表达
的检测引物序列：GUS-F 5′-CGCCGATTTTGCGACCTCGC-3′和 GUS-R 5-′CACCGAAGTTCAT
GCCAGTC-3′。
反应体积 20 μL。反应条件：95 3 min℃ ，95 10 s℃ ；56 20 s℃ ，72 20 s℃ ，40 次循环；72 ℃
10 min。每个材料重复 3 次，Real-time PCR 结果用 Bio-Rad CFX Manager 2.0 软件进行统计分析。
即不同启动子相对非转基因植株的激活转录水平采用 2-ΔΔCt 法计算：经内参 β-actin 基因及目的 GUS
基因均一化处理后，采用 2-ΔΔCt 法计算转基因植株中 GUS 基因的相对表达量，定义非转基因对照为
参照因子，即为 1，各样本相对于参照因子基因表达的倍数为 2-ΔΔCt。
2 结果与分析
2.1 转基因植株获得
利用农杆菌介导法将 PBI121-Rolc、PBI121-RSS1、PBI121-GRP 以及对照 PBI121 载体转化枳上
胚轴。卡那霉素抗性筛选转基因再生芽，继续培养至生根，移栽至营养土中成活。转基因植株经 PCR
进一步鉴定和筛选，检测的目的片段为 575 bp 的 GUS 基因特异片段。PCR 结果显示绝大部分生根
苗均扩增出了预期目的片段，而未转化的对照没有扩增出片段。
图 2为部分转基因植株 PCR检测结果。本试验中共获得 PCR 阳性植株 85株，其中，PBI121-Rolc、
PBI121-RSS1、PBI121-GRP 和 PBI121 各载体 PCR 阳性转基因株系分别为 21、19、25 和 20 株。



图 2 转基因株系 PCR 检测
M：DL2000 DNA marker；CK-：非转基因对照；CK+：质粒；1 ~ 12：转基因植株。
Fig. 2 PCR analysis of representative putative transgenic lines
M：DL 2000 DNA marker；CK-：Non-transgenic control；
CK+：Plasmid；1–12：Transgenic plants.

2.2 GUS 组织化学染色分析
试验结果表明，3 个组织特异启动子在转基因柑橘中均表现出维管束组织特异性，GUS 染色主
要集中在根、茎、叶组织的维管束区域（图 3）。在大部分 PBI121-Rolc 转基因株系中，GUS 显色强
烈，且 GUS 基因在根和茎中呈组成型表达；PBI121-RSS1 转基因株系各组织中 GUS 染色较弱（表
2，图 3）。
在分析的 25 株 PBI121-GRP 转基因植株中，GRP 启动子调控 GUS 基因在 23 株根、茎、叶中
强烈表达，GUS 染色特异性集中在维管束组织中（表 2，图 3，D）。另外，在绝大部分 PBI121 转
基因植株中，GUS 基因均呈组成型表达（表 2，图 3）。这些结果表明，相对于 Rolc 和 RSS1 启动子，
来自豇豆的 GRP 启动子在枳中展现出严格的韧皮部组织特异性且活性较强。

1 期 许兰珍等：异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达 5

表 2 转基因植株中 GUS 组织染色结果统计
Table 2 Statistical analysis of GUS expression in transgenic lines
载体名称
Vector name
PCR+ 株数
Number of PCR
positive plants
韧皮部特异染色株数
Number of phloem-specificity
gus staining plants
组成型染色株数
Number of constitutive gus
staing plants
其它染色株数
Number of others gus
staing plants
PBI121-Rolc 21 0 18 3
PBI121-RSS1 19 0 0 19
PBI121-GRP 25 23 1 1
PBI121 20 0 16 4
CK- 0 0 0 0
注：其它染色指在根或茎或叶中局部有 GUS 染色。
Note：Other gus staing means in a certain part of the roots or stems or leaves of transgenic lines showing GUS staining.

图 3 不同启动子调控 GUS 基因表达的组织化学染色
A：叶片；B：根；C：茎的纵切；D：茎的横切。
Fig. 3 Histochemical staining of GUS expression in transgenic plants containing different promoters
A：Leaf；B：Root；C：Stem longitudinal-section；D：Stem cross-section.

2.3 转基因植株 GUS 酶活性定量分析
在转基因植株中，GUS 酶活性在 14 ~ 93 nmol · mg-1 · min-1 之间。分析结果表明，GRP 和 Rolc
启动子驱动的 GUS 基因表达水平与 35S 启动子没有显著差异，而 RSS1 启动子调控 GUS 基因的表
达水平明显低于 35S 启动子（P < 0.05）（图 4）。非转基因植株中，GUS 酶活性几乎为 0。与 RSS1
相比，GRP、Rolc、35S 启动子的活性分别是其 2.5、5.1 和 3.9 倍。
2.4 转基因植株的 Real-time PCR 定量分析
如图 5 所示，定量 PCR 分析显示 GRP 和 Rolc 启动子激活 GUS 转录水平与 35S 启动子无显著
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图 4 GUS 酶活性的定量分析
* P < 0.05。GRP、Rolc、RSS1 启动子相对于
35S 启动子进行 t 检验。
Fig. 4 Quantitative analysis of GUS enzyme activity in
transgenic plants
* P < 0.05. GRP，Rolc，RSS1 promoter relative to
the 35S promoter t-test.









图 5 不同启动子转基因植株 GUS 基因的相对表达量
* P < 0.05。GRP、Rolc、RSS1 启动子相对于
35S 启动子进行 t 检验。
Fig. 5 Relative expression of GUS gene in the different
promoters transgenic plants
* P < 0.05. GRP，Rolc，RSS1 promoter relative to
the 35S promoter t-test.
差异，而 RSS1 启动子的激活水平显著低于 35S 启动子（P < 0.05）。这些结果与 GUS 组织化学染色
和酶活性分析结果一致。进一步表明，GRP 和 Rolc 启动子能激活 GUS 基因的高水平表达。


3 讨论
本试验中，首先利用前人研究（Keller & Heierli，1994；Saha et al.，2007）的结果，从双子叶
植物、单子叶植物及微生物中克隆到具有韧皮部特异的启动子序列，它们是豇豆富甘氨酸蛋白基因
启动子（GRP）、水稻蔗糖合成酶基因启动子（RSS1）、发根农杆菌 RolC 基因启动子（Rolc），其中
来自豇豆 GRP 全长启动子部分序列已被证实在转基因烟草中具有韧皮部和木质部组织特异性
（Keller & Baumgartner，1991；Keller & Heierli，1994；Ringli & Keller，1998），Rolc 启动子在转基
因马铃薯、水稻和烟草等验证了其具有茎韧皮部组织特异性（Graham et al.，1997；Saha et al.，2007），
RSS1 在转基因水稻、烟草中均具有韧皮部组织特异性（Shi et al.，1994；李永春 等，2002）。然而
本试验中 Rolc 启动子转基因枳尽管 GUS 表达量极高，但它表现出极强的组成型表达，不具备组织
特异性；RSS1 启动子转基因枳只表现极弱的 GUS 活性；有研究表明，来自单子叶植物具有很强调
控作用的启动子在双子叶植物中的调控强度表现为明显的降低（Shimamoto，1994；Dutt et al.，2012）。
本结果显示，来自豇豆的 GRP 启动子在转基因枳的根、茎、叶各组织中均表现出明显的韧皮部组织
特异性，且在根尖处未见 GUS 活性，这是由于韧皮组织尚未从根尖分生组织中产生。Real-time PCR
定量分析及 GUS 酶活测定比较结果显示，GRP 启动子调控下 GUS 基因表达与强启动子 35S 无明显
差异。因此，GRP 启动子是一个柑橘韧皮部特异高效启动子。
柑橘黄龙病细菌主要寄生在柑橘韧皮部细胞，破坏和堵塞筛管等疏导组织，干扰糖等有机养分
从叶到其他组织器官的运输，造成植株的系统性病害。因此，如果利用韧皮部特异启动子指导抗病
基因在韧皮部高效特异地表达，实现抗病基因在黄龙病菌侵染的韧皮部形成较高的作用浓度，增强
杀菌效果，有可能大大提高植株的抗性；然而，现有柑橘抗病基因工程育种中，通常采用花椰菜花
叶病毒（CaMV）35S 等组成型启动子或强表达启动子（mas 启动子）等调控外源抗病基因的表达（陈
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善春 等，1997；何永睿 等，2004；Azevedo et al.，2006；Gentile et al.，2007；Mendes et al.，2009；
Cervera et al.，2010；He et al.，2011；Yang et al.，2011）。目前，尽管还没有韧皮部特异启动子调控
抗病基因提高柑橘抗黄龙病新株系的研究报告，但是，有关筛选韧皮部特异启动子以服务于柑橘黄
龙病抗病基因工程育种的报道已有不少（Benyon et al.，2013）。如 Dutt 等（2012）将 Rolc、RSS1、
拟南芥转运蛋白 2 基因启动子（AtSUC2）和水稻东格鲁杆状病毒基因（RTBV）启动子分别与 GUS
基因融合，并转入墨西哥来檬基因组中，结果表明，RTBV 启动子在墨西哥来檬的调控表达最强，
其次为 Rolc 启动子；表达最弱的为 RSS1 启动子，这与本研究中 RSS1 启动子转基因枳中极弱的调
控表达结果一致。又如 Miyata 等（2012）为研究柑橘韧皮部特异基因的表达，将 3 个不同来源启动
子：柑橘韧皮部蛋白 2 基因（CsPP2）、拟南芥韧皮部蛋白 2 基因（AtPP2）和 AtSUC2 启动子分别
转入 3 个甜橙品种中，经叶片及叶柄 GUS 组织化学染色，结果表明各启动在叶片的维管组织中均有
明显调控表达，且 GUS 在韧皮部中有很强的表达，木质部中也有弱的表达，而本研究中的 3 个异源
启动子在转基因枳中的调控表达存在差异，这或许与启动子的来源不同及转化的受体有关，因而有
必要对新的韧皮部特异表达启动子进行前期筛选研究，为利用这类启动子用于抗病育种提供直接依
据。
本研究中筛选到一个柑橘韧皮部特异高效启动子，为靶向调控抗菌肽等抗病基因增强柑橘对黄
龙病等维管束限制性细菌病抗性奠定了基础。目前利用 GRP 启动子创造抗柑橘黄龙病新株系等研究
正在进行。

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