全 文 ：园艺学报，2016，43 (2)：205–217.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0579；http：//www. ahs. ac. cn 205
收稿日期：2015–11–09；修回日期：2016–02–18
基金项目：国家高技术研究发展计划（‘863’）项目（2008AA10Z157）；北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX20140202）；
国家自然科学青年基金项目（31201606）；科技创新能力建设专项（KJCX20140110）；北京市科委重大项目（D131100000113001）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：jwm0809@163.com）
Cre/loxp 系统的构建及无选择标记转基因苹果
植株的获得
李茂福，王媛花，王 华，金万梅*
（北京市农林科学院林业果树研究所，北京市落叶果树工程技术研究中心，农业部华北地区园艺作物生物学与种质
创制重点实验室，北京 100093）
摘 要：利用 Cre/loxp 系统位点专一性重组的特点构建诱导表达的定位重组系统，特异性地敲除转
基因植物的选择标记基因。通过多重酶切、连接及测序后成功构建植物表达载体 pBI121-Cre-GUS。利用
农杆菌介导的叶盘法将此目标基因转入平邑甜茶中，通过抗性筛选和 PCR 鉴定获得转基因阳性植株。对
阳性植株进行热激诱导后通过 PCR 及 GUS 染色进行检测转基因植株的删除效果，最终获得了无选择标记
基因的转基因苹果植株。
关键词：平邑甜茶；烟草；Cre/loxp 重组删除系统；无选择标记基因
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）02-0205-13
Constructed the Cre/loxp Recombination Inducible Excision System and
Obtained Marker-free Transgenic Apple Plants
LI Mao-fu，WANG Yuan-hua，WANG Hua，and JIN Wan-mei*
（Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing Engineering Research
Center for Deciduous Fruit Trees，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North
China），Ministry of Agriculture，Beijing 100093，China）
Abstract：Used the Cre/loxp to establish inducible expression systems with site-specific recombination
ability，to eliminate the selectable marker genes in transgenic plants specifically. Firstly，a binary expression
vector PBI121-Cre-GUS with the Cre/loxp system was constructed to eliminate a marker gene from
transgenic plants conveniently by digesting three intermediate vector and pBI121. Secondly，transgenic
Malus hupehensis var. pinyiensis were obtained by using Agrobacterium mediated leaf disc method. These
transgenic plants were induced by heat shock. Subsequently，the elimination efficiency was determined by GUS
staining and PCR amplification. Finally，the transgenic plants without selectable marker gene were obtained.
Key words：Malus hupehensis var. pinyiensis；tobacco；Cre/loxp recombination excision system；
marker-free selectable gene
随着转基因产品的不断商品化，人们对其生物安全性心存疑虑。选择标记基因在筛选转基因植
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株时是必不可少的。为了保证转基因产品的安全性，打消人们的担忧，转基因产品中选择标记基因
的安全性评价越来越被重视（刘苗霞 等，2011）。因此，培育无选择标记基因的转基因植物已成为
当前研究的热点。培育无选择标记基因的方法主要有共转化法（Komari et al.，1996）、同源重组法
（Iamtham & Day，2001）、转座子法（Goldbrough et al.，1993；Gu et al.，2014）、位点特异重组
酶系统法（Cre/loxp）（Ow，2002）、多元自主转化载体系统法（甄伟 等，2001；Endo et al.，2002）。
共转化法要求较高的转化频率，同时共转化的目的 DNA 和选择标记基因在转化细胞中要处于不连
锁的状态，这两个条件使得其应用受到了限制（Ebinuma et al.，2001）。在转座子系统中，被修饰
的转座子在被切除后往往会重新插入到基因组中的其他位置，引起其他基因的插入突变（张余洋 等，
2004）。同源重组系统和位点特异性重组系统是借助重组作用使选择标记基因缺失，从而达到去除
的目的。同源重组法由于在植物中发生的频率很低，所以其应用受到限制（Hohn et al.，2001；Iamtham
& Day，2001）。位点特异重组酶系统法是指在重组酶介导下，在特异的重组位点间发生重组，导
致重组位点间相互交换的一种精确重组形式。由于其精确性和较高的重组频率，在无标记转化方面
的应用越来越受到重视（Kilby et al.，1993；Sauer，1994）。位点特异性重组能够在植物中发生 3
类重组反应：Cre/loxp、FLP/FRT 和 R/Rs，其中 Cre/loxp 系统研究最广泛和深入。
Cre 重组酶来自噬菌体 P1 基因编码的一个蛋白，是位点特异性重组系统的关键因子，其活性直
接影响着重组效率的高低。Cre 酶识别的 loxp 序列基本结构长 34 bp，中间是 8 bp 的核心序列，两
边是 13 bp 的反向重复序列。不需其他辅助因子和额外能量参与便可进行 DNA 分子重组反应。当
Cre 重组酶识别 loxp 位点后，可以在该位置切断 DNA，并在断端形成中间体，在 Cre 重组酶催化下
可重组连接。因此，同一条 DNA 分子上若有两个 loxp 位点，如果顺序相同，重组后则 loxp 位点间的
核酸序列被特异性删除，利用此原理来删除转基因中不需要的标记基因（Odell et al.，1994；Ow，1996，
2007）（图 1）。Cre/loxp 重组系统多用于烟草等模式植物，较少用于遗传转化较为困难的果树。本
实验室通过系统研究建立了平邑甜茶的转基因体系，为培育无选择标记基因的苹果奠定基础。
图 1 Cre/loxp 系统介导删除标记基因的示意图
Fig. 1 Schematic diagram for Cre/loxp mediated marker-free transgenic
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2008 年选用山西省农业科学院果树研究所无融合生殖苹果砧木平邑甜茶（Malus hupehensis var.
pinyiensis）及本氏烟草（Nicotiana benthamiana）组培苗作为遗传转化的受体，pMM23 载体为北京
大学林忠平教授惠赠，p-hsp、pMD-loxp-GUS 等用于载体构建的中间载体为本实验室构建或保存。
1.2 pBI121-Cre-GUS 载体构建
利用 Cre/loxp 重组系统，先构建两个中间载体 pMM23-hsp-Cre-loxp-GUS 和 pGEM-T-hsp-Cre-
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loxp-GUS，再对载体 pBI121 进行改造，最终构建完成植物表达载体 pBI121-35S-loxp-NPTⅡ-hsp-Cre-
loxp-GUS（简写为 pBI121-Cre-GUS）。
载体构建分 3 步。首先用 HindⅢ和 XbaⅠ切去质粒 pBI121 的 35S 序列，并切下质粒 pMD-35S-loxp
的35S-loxp序列，将二者连接得到质粒pBI121-35S-loxp。用XbaⅠ和SacⅠ分别切去质粒pBI121-35S-loxp
的 GUS 序列，并切下质粒 T-nos-NPTⅡ-nos 的 nos-NPTⅡ-nos 序列，将二者连接，得到质粒
pBI121-35S-loxp-NPTⅡ。用 HindⅢ和 BamHⅠ分别切下质粒 pBI121-35S-loxp-NPTⅡ的 35S-loxp-NPTⅡ，
并切去质粒的 pBI121 的 35S 序列，将二者连接，得到质粒 pBI121-35S-loxp-NPTⅡ-GUS（图 2）。
图 2 pBI121-35S-loxp-NPTⅡ-GUS 载体构建示意图
Fig. 2 Structure diagram of pBI121-35S-loxp-NPTⅡ-GUS vector
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然后用 HindⅢ和 XbaⅠ切去质粒 pMM23 的 35S 序列，并切下质粒 p-hsp 的 hsp 序列，将二者
连接，得到质粒 pMM23-hsp-Cre。用 SacⅠ和 SphⅠ切去质粒 pMM23-hsp-Cre 的 Tnos 序列，并切下
质粒 pMD-loxp-GUS 的 loxp-GUS 序列，将二者连接，得到质粒 pMM23-hsp-Cre-loxp-GUS（图 3）。
图 3 pMM23-hsp-Cre-loxp-GUS 载体构建示意图
Fig. 3 Structure diagram of pMM23-hsp-Cre-loxp-GUS vector
最后，用 SacⅠ和 ApaⅠ双酶切质粒 pGEM-T，回收大片段，与人工合成的多克隆位点（MCS）
连接，得到改造后的质粒 pGEM-T。其中人工合成的 MCS 如图 4 所示，委托生工生物工程（上海）
股份有限公司合成。用 Hind Ⅲ和 SacⅠ分别双酶切改造后的质粒 pGEM-T 和 pMM23-hsp-Cre-
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loxp-GUS，各自回收大片段后连接，得到质粒 pGEM-T-hsp-Cre-loxp-GUS。分别用 BamHⅠ和 SacⅠ双
酶切质粒 pGEM-T-hsp-Cre-loxp-GUS 和 pBI121-35S-loxp-NPTⅡ-GUS，各自回收大片段后连接，即
得到植物表达载体 pBI121-Cre-GUS（图 4）。
图 4 pBI121-Cre-GUS 载体构建示意图
Fig. 4 Structure diagram of pBI121-Cre-GUS vector
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1.3 烟草及平邑甜茶的转化
利用农杆菌介导的叶盘转化法进行。根癌农杆菌 LBA4404，在 28 ℃下在含 100 mg · L-1 卡那霉
素的 LB 液体培养基中培养 16 h，备用。
在超净工作台上取组培苗伸展叶片，剪成约 0.1 cm2 的叶盘。将叶盘放在上述含有携带载体
pBI121-Cre-GUS 的根癌农杆菌的培养物中 5 min，然后接种在 MS + TDZ 2.0 mg · L-1 + IBA 0.2
mg · L-1 再生培养基上，在黑暗条件下培养 1 d；然后转接在 MS + TDZ 2.0 mg · L-1 + IBA 0.2 mg · L-1
附加 300 mg · L-1 头孢霉素和 5 mg · L-1 卡那霉素的分化培养基上，在（25 ± 1）℃下暗培养 14 d，然
后置于光周期为 16 h 光照/8 h 黑暗，光照强度为 30 μmol · m-2 · s-1 的条件下再培养 30 d，可获得转化
芽和转基因植株。
用相同方法同时侵染烟草叶盘，获得转基因烟草植株。
1.4 pBI121-Cre-GUS 转基因植株的 GUS 染色
将获得的转基因植株取其芽顶端幼叶，剪取 1 ~ 2 cm 的叶块，放入装有 GUS 染色液的离心管
中，37 ℃培养箱中进行 GUS 组织染色，16 h 后取出叶片，先以 20%乙醇清洗样品 20 min，再用 50%
乙醇清洗 30 min，最后用 70%的乙醇脱色，脱至白色为止。将脱色后的叶块进行镜检和拍照。
1.5 pBI121-Cre-GUS 转基因植株的热激处理及分子检测
将转基因株系置于 37 ℃以上的高温条件下处理 3 d，然后取抗性芽长约 2 ~ 3 cm 进行 GUS 染
色，同时以 CTAB 法提取热激处理后植物总 DNA，以 pBI121-Cre-GUS 质粒作为阳性对照，非转基
因植株作为阴性对照，使用 NPTⅡ基因特异引物 5′-CCGGTATAAAGGGACCACCT-3′和 5′-ATGTTG
CTGTCTCCCAGGTC-3′；Cre 基因特异引物 5′-ATGTCCAATTTACTGACCGTA-3′和 5′-CTAATCGCC
ATCTTCCAGCAG-3′及 GUS 基因特异引物 5′-GTCAGTCCCTTATGTTACG-3′和 5′-TGATTCATTGTT
TGCCTC-3′进行 PCR 分析。
扩增条件为 94 ℃ 2 min，98 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共 35 个循环。最后 72 ℃延
伸 10 min。PCR 扩增产物在 1.0%的琼脂糖中进行电泳检测。
2 结果与分析
2.1 无标记基因植物表达载体的获得
以载体 pBI121 为骨架，利用中间载体 pMM23、p-hsp、pMD-loxp-GUS，通过酶切连接，先构
建两个中间载体 pMM23-hsp-Cre-loxp-GUS（图 2）和 pGEM-T-hsp-Cre-loxp-GUS（图 3），再对载
体 pBI121 进行改造，最终构建完成植物表达载体 pBI121-35S-loxp-NPTⅡ-hsp-Cre- loxp-GUS（简写
为 pBI121-Cre-GUS，图 4）。
利 用 Hind Ⅲ 和 BamH Ⅰ 双 酶 切 pMM23-hsp-Cre-loxp-GUS ， Hind Ⅲ 和 Sac Ⅰ 双 酶 切
pGEM-T-hsp-Cre-loxp-GUS，HindⅢ和 SacⅠ双酶切 pBI121-Cre-GUS 均能得到正确大小的条带（图
5），将测序正确的载体导入农杆菌 LBA4404 中（测序结果见图 6），该载体的目的基因是 β–葡糖
苷酸酶（GUS）基因，该载体上带有 Cre/loxp 重组酶系统，携带有卡那霉素（Kan）抗性的新霉素
磷酸转移酶基因（NPTⅡ）。
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图 5 无标记基因植物表达载体构建酶切验证
A：pBI121-35S-loxp-NPTⅡ-GUS 双酶切验证；B：pMM23-hsp-Cre-loxp-GUS 双酶切验证；
C：pBI121-Cre-GUS 双酶切验证。
Fig. 5 Validated the marker-free vector construction by enzyme digestion
A：Validated vector of pBI121-35S-loxp-NPTⅡ-GUS by double enzyme digestion；
B：Validated vector of pMM23-hsp-Cre-loxp-GUS by double enzyme digestion；
C：Validated vector of pBI121-Cre-GUS by double enzyme digestion.
tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtactt caccagctcc gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccc 120
cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcat gaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc agcagggcga ggatcgtggc 240
atcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag agtttcagca ggccgcccag gcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcc 360
cgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc gacaggctca tgccggccgc cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg cagtacacct tgataggtgg 480
gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc ttgccctcat ctgttacgcc ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaata 600
agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccgg ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtata 720
tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggtta tgcagcggaa aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 840
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 960
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1080
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgccaga aggccgccag agaggccgag cgcggccgtg 1200
aggcttggac gctagggcag ggcatgaaaa agcccgtagc gggctgctac gggcgtctga cgcggtggaa agggggaggg gatgttgtct acatggctct gctgtagtga gtgggttgcg 1320
ctccggcagc ggtcctgatc aatcgtcacc ctttctcggt ccttcaacgt tcctgacaac gagcctcctt ttcgccaatc catcgacaat caccgcgagt ccctgctcga acgctgcgtc 1440
cggaccggct tcgtcgaagg cgtctatcgc ggcccgcaac agcggcgaga gcggagcctg ttcaacggtg ccgccgcgct cgccggcatc gctgtcgccg gcctgctcct caagcacggc 1560
cccaacagtg aagtagctga ttgtcatcag cgcattgacg gcgtccccgg ccgaaaaacc cgcctcgcag aggaagcgaa gctgcgcgtc ggccgtttcc atctgcggtg cgcccggtcg 1680
cgtgccggca tggatgcgcg cgccatcgcg gtaggcgagc agcgcctgcc tgaagctgcg ggcattcccg atcagaaatg agcgccagtc gtcgtcggct ctcggcaccg aatgcgtatg 1800
attctccgcc agcatggctt cggccagtgc gtcgagcagc gcccgcttgt tcctgaagtg ccagtaaagc gccggctgct gaacccccaa ccgttccgcc agtttgcgtg tcgtcagacc 1920
gtctacgccg acctcgttca acaggtccag ggcggcacgg atcactgtat tcggctgcaa ctttgtcatg cttgacactt tatcactgat aaacataata tgtccaccaa cttatcagtg 2040
ataaagaatc cgcgcgttca atcggaccag cggaggctgg tccggaggcc agacgtgaaa cccaacatac ccctgatcgt aattctgagc actgtcgcgc tcgacgctgt cggcatcggc 2160
ctgattatgc cggtgctgcc gggcctcctg cgcgatctgg ttcactcgaa cgacgtcacc gcccactatg gcattctgct ggcgctgtat gcgttggtgc aatttgcctg cgcacctgtg 2280
ctgggcgcgc tgtcggatcg tttcgggcgg cggccaatct tgctcgtctc gctggccggc gccagatctg gggaaccctg tggttggcat gcacatacaa atggacgaac ggataaacct 2400
tttcacgccc ttttaaatat ccgattattc taataaacgc tcttttctct taggtttacc cgccaatata tcctgtcaaa cactgatagt ttaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga 2520
tcatgagcgg agaattaagg gagtcacgtt atgacccccg ccgatgacgc gggacaagcc gttttacgtt tggaactgac agaaccgcaa cgttgaagga gccactcagc cgcgggtttc 2640
tggagtttaa tgagctaagc acatacgtca gaaaccatta ttgcgcgttc aaaagtcgcc taaggtcact atcagctagc aaatatttct tgtcaaaaat gctccactga cgttccataa 2760
attcccctcg gtatccaatt agagtctcat attcactctc aatccaaata atctgcaccg gatctggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 2880
gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 3000
gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 3120
gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 3240
accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 3360
aggcgcgcat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 3480
cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 3600
ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 3720
gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc acgggatctc tgcggaacag gcggtcgaag gtgccgatat 3840
cattacgaca gcaacggccg acaagcacaa cgccacgatc ctgagcgaca atatgatcgg gcccggcgtc cacatcaacg gcgtcggcgg cgactgccca ggcaagaccg agatgcaccg 3960
cgatatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggatgatccc cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 4080
gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 4200
cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcgggcct cctgtcaatg ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg 4320
gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta 4440
ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt 4560
ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt 4680
ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt ttgtctttgg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 4800
cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 4920
caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcaggtc cccagattag ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt acgcagcagg 5040
tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggaa atcaaatacc ttcccaagaa ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag agaaagatat 5160
atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc ttcacaaacc aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat caaaggccat 5280
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Constructed the Cre/loxp recombination inducible excision system and obtained marker-free transgenic apple plants.
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ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg gcgaacagtt catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca tggtggagca 5400
cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 5520
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 5640
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 5760
agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg ggactctaga ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag tttccacttc aattcctcct ctatgtctca 5880
gtgttctgct tgaatttttt tagatatttt tcttaacatt tcaaaaagta ttttttgaaa aacaaaacaa tattctaaaa aatactttcc gtatttattt attctgaaca gtaaaataaa 6000
ataatatttc agagaatgca ttacgaaaat aacgactttg aaacattgtt ataggtacaa agaatttcta tatgataatg aaaaatatag gaaaaaacta ttaatgtatt tatgaatgat 6120
gtccagaagt ggaagaaaaa taaatataat gatgtgtagt aaacaagaac cttcgtacat ggtgtggaga attccagacg tttttatgga atcatctgaa actggtgaat tcaaccaaat 6240
tgcaaaaagt aggatttttc tggaacatac aagatcatcc tttcacttcc tttaaatacc tcgcgtatcc ccttcgtcgt catcaaacga agaaaaaagt tacctgtttg cgatctcact 6360
gcagatgtcc aatttactga ccgtacacca aaatttgcct gcattaccgg tcgatgcaac gagtgatgag gttcgcaaga acctgatgga catgttcagg gatcgccagg cgttttctga 6480
gcatacctgg aaaatgcttc tgtccgtttg ccggtcgtgg gcggcatggt gcaagttgaa taaccggaaa tggtttcccg cagaacctga agatgttcgc gattatcttc tatatcttca 6600
ggcgcgcggt ctggcagtaa aaactatcca gcaacatttg ggccagctaa acatgcttca tcgtcggtcc gggctgccac gaccaagtga cagcaatgct gtttcactgg ttatgcggcg 6720
gatccgaaaa gaaaacgttg atgccggtga acgtgcaaaa caggctctag cgttcgaacg cactgatttc gaccaggttc gttcactcat ggaaaatagc gatcgctgcc aggatatacg 6840
taatctggca tttctgggga ttgcttataa caccctgtta cgtatagccg aaattgccag gatcagggtt aaagatatct cacgtactga cggtgggaga atgttaatcc atattggcag 6960
aacgaaaacg ctggttagca ccgcaggtgt agagaaggca cttagcctgg gggtaactaa actggtcgag cgatggattt ccgtctctgg tgtagctgat gatccgaata actacctgtt 7080
ttgccgggtc agaaaaaatg gtgttgccgc gccatctgcc accagccagc tatcaactcg cgccctggaa ggatttttga agcaactcat cgattgattt acggcgctaa ggatgactct 7200
gtcagagata cctggcctgg tctggacaca gtgcccgtgt cggagccgcg cgagatatgg cccgcgctgg agtttcaata ccggagatca tgcaagctgg tggctggacc aatgtaaata 7320
ttgtcatgaa ctatatccgt aacctggata gtgaaacagg ggcaatggtg cgcctgctgg ggatccccgg gtggtcagtc ccttatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc 7440
attagccatt aacgcgtaaa tgagtactat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattgatcag 7560
cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa 7680
gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg 7800
ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg tatcaccgtt tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa 7920
aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat 8040
gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg 8160
actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg 8280
tcagtggcag tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg 8400
cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact 8520
gctgctgtcg gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt 8640
aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg 8760
cgtaaactcg acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat 8880
gtccaaagcg gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg caggagaaac tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac gttagccggg 9000
ctgcactcaa tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg tatcaccgcg tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc 9120
gattttgcga cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatcttcact cgcgaccgca aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac 9240
ttcggtgaaa aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca tcgtcggcta cagcctcggg aattgctacc gagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat 9360
ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat 9480
gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg 9600
ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 9720
ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct 9840
ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc 9960
acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaaa caggattttc 10080
gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccacccca gtacattaaa 10200
aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat 10320
acaggcagcc catcagtccg ggacggcgtc agcgggagag ccgttgtaag gcggcagact ttgctcatgt taccgatgct attcggaaga acggcaacta agctgccggg tttgaaacac 10440
ggatgatctc gcggagggta gcatgttgat tgtaacgatg acagagcgtt gctgcctgtg atcaaatatc atctccctcg cagagatccg aattatcagc cttcttattc atttctcgct 10560
taaccgtgac aggctgtcga tcttgagaac tatgccgaca taataggaaa tcgctggata aagccgctga ggaagctgag tggcgctatt tctttagaag tgaacgttga cgatatcaac 10680
tcccctatcc attgctcacc gaatggtaca ggtcggggac ccgaagttcc gactgtcggc ctgatgcatc cccggctgat cgaccccaga tctggggctg agaaagccca gtaaggaaac 10800
aactgtaggt tcgagtcgcg agatcccccg gaaccaaagg aagtaggtta aacccgctcc gatcaggccg agccacgcca ggccgagaac attggttcct gtaggcatcg ggattggcgg 10920
atcaaacact aaagctactg gaacgagcag aagtcctccg gccgccagtt gccaggcggt aaaggtgagc agaggcacgg gaggttgcca cttgcgggtc agcacggttc cgaacgccat 11040
ggaaaccgcc cccgccaggc ccgctgcgac gccgacagga tctagcgctg cgtttggtgt caacaccaac agcgccacgc ccgcagttcc gcaaatagcc cccaggaccg ccatcaatcg 11160
tatcgggcta cctagcagag cggcagagat gaacacgacc atcagcggct gcacagcgcc taccgtcgcc gcgaccccgc ccggcaggcg gtagaccgaa ataaacaaca agctccagaa 11280
tagcgaaata ttaagtgcgc cgaggatgaa gatgcgcatc caccagattc ccgttggaat ctgtcggacg atcatcacga gcaataaacc cgccggcaac gcccgcagca gcataccggc 11400
gacccctcgg cctcgctgtt cgggctccac gaaaacgccg gacagatgcg ccttgtgagc gtccttgggg ccgtcctcct gtttgaagac cgacagccca atgatctcgc cgtcgatgta 11520
ggcgccgaat gccacggcat ctcgcaaccg ttcagcgaac gcctccatgg gctttttctc ctcgtgctcg taaacggacc cgaacatctc tggagctttc ttcagggccg acaatcggat 11640
ctcgcggaaa tcctgcacgt cggccgctcc aagccgtcga atctgagcct taatcacaat tgtcaatttt aatcctctgt ttatcggcag ttcgtagagc gcgccgtgcg tcccgagcga 11760
tactgagcga agcaagtgcg tcgagcagtg cccgcttgtt cctgaaatgc cagtaaagcg ctggctgctg aacccccagc cggaactgac cccacaaggc cctagcgttt gcaatgcacc 11880
aggtcatcat tgacccaggc gtgttccacc aggccgctgc ctcgcaactc ttcgcaggct tcgccgacct gctcgcgcca cttcttcacg cgggtggaat ccgatccgca catgaggcgg 12000
aaggtttcca gcttgagcgg gtacggctcc cggtgcgagc tgaaatagtc gaacatccgt cgggccgtcg gcgacagctt gcggtacttc tcccatatga atttcgtgta gtggtcgcca 12120
gcaaacagca cgacgatttc ctcgtcgatc aggacctggc aacgggacgt tttcttgcca cggtccagga cgcggaagcg gtgcagcagc gacaccgatt ccaggtgccc aacgcggtcg 12240
gacgtgaagc ccatcgccgt cgcctgtagg cgcgacaggc attcctcggc cttcgtgtaa taccggccat tgatcgacca gcccaggtcc tggcaaagct cgtagaacgt gaaggtgatc 12360
ggctcgccga taggggtgcg cttcgcgtac tccaacacct gctgccacac cagttcgtca tcgtcggccc gcagctcgac gccggtgtag gtgatcttca cgtccttgtt gacgtggaaa 12480
atgaccttgt tttgcagcgc ctcgcgcggg attttcttgt tgcgcgtggt gaacagggca gagcgggccg tgtcgtttgg catcgctcgc atcgtgtccg gccacggcgc aatatcgaac 12600
aaggaaagct gcatttcctt gatctgctgc ttcgtgtgtt tcagcaacgc ggcctgcttg gcctcgctga cctgttttgc caggtcctcg ccggcggttt ttcgcttctt ggtcgtcata 12720
gttcctcgcg tgtcgatggt catcgacttc gccaaacctg ccgcctcctg ttcgagacga cgcgaacgct ccacggcggc cgatggcgcg ggcagggcag ggggagccag ttgcacgctg 12840
tcgcgctcga tcttggccgt agcttgctgg accatcgagc cgacggactg gaaggtttcg cggggcgcac gcatgacggt gcggcttgcg atggtttcgg catcctcggc ggaaaacccc 12960
gcgtcgatca gttcttgcct gtatgccttc cggtcaaacg tccgattcat tcaccctcct tgcgggattg ccccgactca cgccggggca atgtgccctt attcctgatt tgacccgcct 13080
ggtgccttgg tgtccagata atccacctta tcggcaatga agtcggtccc gtagaccgtc tggccgtcct tctcgtactt ggtattccga atcttgccct gcacgaatac cagcgacccc 13200
ttgcccaaat acttgccgtg ggcctcggcc tgagagccaa aacacttgat gcggaagaag tcggtgcgct cctgcttgtc gccggcatcg ttgcgccaca tctaggtact aaaacaattc 13320
atccagtaaa atataatatt ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgtt cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc 13440
aatgtcatac cacttgtccg ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc acaaagatgt tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga caagttcctc 13560
ttcgggcttt tccgtcttta aaaaatcata cagctcgcgc ggatctttaa atggagtgtc ttcttcccag ttttcgcaat ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc 13680
ggctaagcgg ctgtctaagc tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat acagctcgat aatcttttca gggctttgtt catcttcata 13800
ctcttccgag caaaggacgc catcggcctc actcatgagc agattgctcc agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacct ttggaacagg cagctttcct tccagccata gcatcatgtc 13920
李茂福，王媛花，王 华，金万梅.
Cre/loxp 系统的构建及无选择标记转基因苹果植株的获得.
园艺学报，2016，43 (2)：205–217. 213
表 1 暗培养对平邑甜茶不定芽产生的影响
Table 1 Effects of duration of initial dark culture on adventitious
shoot regeneration of Malus hupehensis var. pinyiensis
黑暗处理/d
Dark treatment
不定芽再生率/%
Adventitious shoot
regeneration rate
每个外植体产生的
平均芽数
Average number of
shoots per explant
0 0 d 0 d
7 13.4 ± 0.6 c 1.0 ± 0 c
14 98.3 ± 2.3 a 3.5 ± 0.2 a
21 76.0 ± 1.6 b 2.2 ± 0.1 b
注：所得值为共培养 45 d 后的。Tukey’s 检验，P = 0.05。
Note：Values were calculated after 45 d. Tukey’s honestly
significant difference test，P = 0.05.
cttttcccgt tccacatcat aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca tttttaaata taggttttca ttttctccca ccagcttata taccttagca ggagacattc cttccgtatc 14040
ttttacgcag cggtattttt cgatcagttt tttcaattcc ggtgatattc tcattttagc catttattat ttccttcctc ttttctacag tatttaaaga taccccaaga agctaattat 14160
aacaagacga actccaattc actgttcctt gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc aaagttggcg tataacatag tatcgacgga gccgattttg 14280
aaaccacaat tatgggtgat gctgccaact tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga ggtgctccag tggcttctgt gtctatcagc tgtccctcct gttcagctac tgacggggtg 14400
gtgcgtaacg gcaaaagcac cgccggacat cagcgctatc tctgctctca ctgccgtaaa acatggcaac tgcagttcac ttacaccgct tctcaacccg gtacgcacca gaaaatcatt 14520
gatatggcca tgaatggcgt tggatgccgg gcaacagccc gcattatggg cgttggcctc aacacgattt tacgtcactt aaaaaactca ggccgcagtc ggtaacctcg cgcatacagc 14640
cgggcagtga cgtcatcgtc tgcgcggaaa tggacgaaca gtggggctat gtcggggcta aatcgcgcca gcgctggctg ttttacgcgt atgacagtct ccggaagacg gttgttgcgc 14760
acgtattcgg tgaacgcact atggcgacgc tggggcgtct tatgagcctg ctgtcaccct ttgacgtggt gatatggatg acggatggct ggccgctgta tgaatcccgc ctgaagggaa 14880
agctgcacgt aatcagcaag cgatatacgc agcgaattga gcggcataac ctgaatctga ggcagcacct ggcacggctg ggacggaagt cgctgtcgtt ctcaaaatcg gtggagctgc 15000
atgacaaagt catcgggcat tatctgaaca taaaacacta tcaataagtt ggagtcatta cccaattatg atagaattta caagctataa ggttattgtc ctgggtttca agcattagtc 15120
catgcaagtt tttatgcttt gcccattcta tagatatatt gataagcgcg ctgcctatgc cttgccccct gaaatcctta catacggcga tatcttctat ataaaagata tattatctta 15240
tcagtattgt caatatattc aaggcaatct gcctcctcat cctcttcatc ctcttcgtct tggtagcttt ttaaatatgg cgcttcatag agtaattctg taaaggtcca attctcgttt 15360
tcatacctcg gtataatctt acctatcacc tcaaatggtt cgctgggttt atcgcacccc cgaacacgag cacggcaccc gcgaccacta tgccaagaat gcccaaggta aaaattgccg 15480
gccccgccat gaagtccgtg aatgccccga cggccgaagt gaagggcagg ccgccaccca ggccgccgcc ctcactgccc ggcacctggt cgctgaatgt cgatgccagc acctgcggca 15600
cgtcaatgct tccgggcgtc gcgctcgggc tgatcgccca tcccgttact gccccgatcc cggcaatggc aaggactgcc agcgctgcca tttttggggt gaggccgttc gcggccgagg 15720
ggcgcagccc ctggggggat gggaggcccg cgttagcggg ccgggagggt tcgagaaggg ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgcacaggg cgcagccctg gttaaaaaca 15840
aggtttataa atattggttt aaaagcaggt taaaagacag gttagcggtg gccgaaaaac gggcggaaac ccttgcaaat gctggatttt ctgcctgtgg acagcccctc aaatgtcaat 15960
aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg tcaaggatcg cgcccctcat ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg cacttatccc caggcttgtc 16080
cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt cgccgatttg cgaggctggc cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat ctgtcaacgc cgcgccgggt 16200
gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt cagtgagggc caagttttcc gcgaggtatc cacaacgccg gcggccgcgg tgtctcgcac acggcttcga cggcgtttct 16320
ggcgcgtttg cagggccata gacggccgcc agcccagcgg cgagggcaac cagcccgg 16378
图 6 植物表达载体 pBI121-Cre-GUS 序列
Fig. 6 Sequences of plant expression vecter pBI121-Cre-GUS
2.2 pBI121-Cre-GUS 转基因植株的获得
以平邑甜茶组培苗叶片作为外植体，以
NPTⅡ基因为选择标记，用浓度为 5 mg · L-1 的
Kan 筛选转化株系。转化过程中发现农杆菌和
植物共培养是整个转化过程中非常重要的环
节，因为农杆菌附着，T-DNA 的转移及整合都
在共培养阶段完成。暗培养的时间对转化有着
很大的影响：暗培养时间的确定以不对外植体
造成伤害又最大限度提高再生效率为标准。通
过 0、7、14 和 21 d 的黑暗培养，发现 14 d 的
出芽效果最好（表 1）。因此暗培养时采用 14 d。
此外，抑菌性抗生素浓度的选择也很关键。
适当的抑菌性抗生素既能有效抑制细菌生长，又不影响植物细胞的正常生长发育。转化用叶盘、转
化芽及转基因植株的生长状况照片如图 7。经过抗性筛选，共获得 13 株抗性平邑甜茶和 7 株抗性本
氏烟草植株。
2.3 转基因烟草植株的 GUS 检测及分子鉴定
当抗性烟草苗长约 2 ~ 3 cm 时，取其叶片进行 GUS 染色，结果表明，检测的 7 株烟草中有 5
株为阳性（图 8，A）。对所获得的转基因植株阳性苗经过 37 ℃热激处理后进行 GUS 染色和 PCR
鉴定。通过染色后发现 5 株转基因阳性植株在热激后 GUS 活性更强，植株染色更深（图 8，B）。转
基因烟草热激前后的 PCR 扩增结果（图 9）显示，检测的 5 个株系中，热激前后均能扩增出 GUS
基因，而热激后植株中有 3 株没有扩增出 NPTⅡ基因及 Cre 基因，仍有 2 株扩增出 NPTⅡ及 Cre 基
因，说明这 3 个没有扩增出 NPTⅡ及 Cre 基因的株系在热激后，删除了转化载体 loxp-loxp 之间的部
分，即选择标记基因 NPTⅡ及 Cre 已被删除。
Li Mao-fu，Wang Yuan-hua，Wang Hua，Jin Wan-mei.
Constructed the Cre/loxp recombination inducible excision system and obtained marker-free transgenic apple plants.
214 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (2)：205–217.
图 7 转化用的平邑甜茶叶盘（A）以及获得的抗性芽（B）和抗性苗（C）
Fig. 7 Genetic transformation using leaf discs（A），resistance bud（B）and resistance seeding（C）
图 8 转基因烟草植株热激前后 GUS 染色
A：转基因植株的 GUS 染色（CK，非转基因；1 ~ 7，转基因植株）；
B：转基因植株热激处理前后的 GUS 染色（1 ~ 5 为热激前后的转基因株系）。
Fig. 8 GUS staining of transgenic Nicotiana tabacum before and after heat shocked treatment
A：GUS staining of transgenic line（CK：Non-transgenic，1–7：Transgenic plant）.
B：GUS staining analysis of transgenic plants before and after heat shock
treatment（1–5：Transgenic line before heat shock treatment）.
图 9 转基因烟草植株热激前后 PCR 鉴定
CK+：质粒对照；CK-：非转基因对照；1a ~ 5a：热激前的转基因株系；1b ~ 5b：热激后的转基因株系。
Fig. 9 PCR analysis of transgenic Nicotiana tabacum before and after heat shocked treatment
CK+：Plasmid；CK-：Non-transgenic plant；1a–5a：Transgenic lines before heat shock treatment；
1b–5b：Transgenic lines after heat shock treatment.
2.4 转基因平邑甜茶植株的 GUS 染色及分子检测
当抗性平邑甜茶苗长约 2 ~ 3 cm 时，取其叶片进行 GUS 染色。结果表明，13 株抗性平邑甜茶
李茂福，王媛花，王 华，金万梅.
Cre/loxp 系统的构建及无选择标记转基因苹果植株的获得.
园艺学报，2016，43 (2)：205–217. 215
中有 5 株呈阳性，GUS 部分染色鉴定结果见图 10。与烟草相比较，转基因平邑甜茶热激处理后染色
与处理前没有明显差异。分别从热激后转基因植株 DNA 中扩增 GUS，Cre 和 NPTⅡ基因。PCR 扩
增结果如图 11 所示。检测的 5 个株系均能扩增出 GUS 基因，而与之相对应的，只有 2 株扩增出 NPTⅡ
及 Cre 基因，有 3 株没有扩增出 NPTⅡ及 Cre 基因，说明这 3 个株系在热激后，删除了转化载体中
loxp-loxp 之间的部分，即选择标记基因 NPTⅡ及 Cre 已被删除。
图 10 转基因平邑甜茶植株 GUS 染色
CK：非转基因；1 ~ 5：转基因植株。
Fig. 10 GUS staining of transgenic Malus hupehensis var. pinyiensis
CK：Non-transgenic；1–5：Transgenic plant.
图 11 转基因平邑甜茶植株热激后 PCR 鉴定
CK+：质粒对照；CK-：非转基因对照；1b ~ 5b：热激后的转基因株系。
Fig. 11 PCR analysis the transgenic Malus hupehensis var. pinyiensis after heat shocked treatment
CK+：Plasmid；CK-：Non-transgenic plant；1b–5b：Transgenic line after heat shock treatment.
3 讨论
关于转基因生物的安全性，争论的中心在选择标记和目的基因的安全性上，选择标记基因方便
了遗传转化，但获得转化植株后，标记基因是多余的，甚至是有害的。如抗除草剂基因及抗生素抗
性基因向人或动物肠道寄生菌的横向漂流是转基因生物安全的主要问题（施巧婷 等，2009；范云六
等，2012；储成才，2013）。因此，培育无选择标记基因的转基因植株显得尤为重要。目前，解决转
基因植物安全性的主要措施有：利用传统的抗性标记基因获得转基因植株后再消除标记基因；开发
利用无争议的生物安全标记基因；研究开发无标记基因的转化系统，但多数采用第一种（雷桅和刘
昕，2009）。本研究中利用 Cre-loxp 重组系统，构建热激启动子启动 DNA 序列的删除，通过对获得
Li Mao-fu，Wang Yuan-hua，Wang Hua，Jin Wan-mei.
Constructed the Cre/loxp recombination inducible excision system and obtained marker-free transgenic apple plants.
216 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (2)：205–217.
的转基因植株进行热激而得到无选择标记的转基因植株，避免了二次转化及杂交的问题。
在植物的基因转化过程中，通常使用 GUS 基因作为报告基因。用 GUS 染色剂来鉴定转基因植
株是目前最方便快捷的鉴定方法，但是该方法的准确率不是 100%。在苹果的转化体中，由于其背
景的影响，GUS 的活性并不总是与基因的瞬时表达相一致。在研究‘嘎拉’苹果的遗传转化过程中，
抗性苗中 GUS 阳性率为 80.4%，而 PCR 检测阳性植株只占 GUS 阳性植株的 24%，说明 GUS 检测
存在部分假阳性现象（Schaart et al.，1995）。在本试验中，共获得 13 株抗性苗，通过 GUS 组织化
学染色有 7 株呈阳性，但经过 PCR 检测，只有 5 株表现为 PCR 阳性，可能是在继代过程中外源基
因没有完全整合所导致的。
Chakraborti 等（2008）利用 Cre/loxp 位点特异重组系统，通过 T0 代植株的杂交，获得无选择
标记基因的烟草。而李岩和赵德刚（2011）也利用热激诱导型启动子驱动的 Cre/loxp 删除系统在矮
牵牛中获得删除效率为 43.8%的转基因植株。Cuellar 等（2006）利用果蝇的 hsp70 启动子驱动的
Cre/loxp 删除系统在马铃薯中却只获得了 4.7%的删除效率。Poloniova 等（2015）利用拟南芥花粉和
胚胎特异的 DLL 启动子驱动的 Cre/loxp 删除系统在烟草中获得了高达 96.2%的删除效率。Wang 等
（2005）用热激蛋白启动子启动 Cre 基因并通过它的表达切除 NPTⅡ筛选标记基因时发现在未经过
热激处理的株系中仍有部分标记基因的切除，说明热启动子虽然可以较好地调控 Cre 基因，但是在
转基因植株中仍有部分本底表达。这些研究说明热启动子在不同植物中的启动能力存在较大差异。
由此看出，不同物种，方法不同，所使用的启动子不同所获得的删除效率差异较大。本研究中利用
热激诱导型启动子驱动的 Cre/loxp 删除系统获得的无选择标记转基因的删除效率在烟草中明显好于
平邑甜茶，这可能是由于平邑甜茶的背景比烟草复杂所导致。这与前人的研究结果（Wang et al.，
2005）基本一致。此外，本研究中采用 37 ℃对转基因植株进行热激，经检测获得选择标记基因删
除、表型恢复正常的转基因植株，这为热诱导外源基因删除在苹果等植物转基因中的应用奠定了基
础。但本研究中基因删除所需热激时间较长，删除效率也未达到 100%，不同物种之间差别较大，
这可能是由于所用热激启动子 hsp 在苹果及烟草中启动效率不一样引起的，因此，还需进一步研究。
总之，本研究中通过试验建立了基于 Cre/loxp 系统在热激诱导处理而实现转基因植株选择标记
基因快速删除的方法。这有利于 Cre/loxp 标记基因诱导剪切系统的发展应用，对安全转基因植株的
培育具有重要价值。
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