全 文 ：园艺学报，2015，42 (2)：214–220.
Acta Horticulturae Sinica
214 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0871；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2014–11–13；修回日期：2015–01–26
基金项目：国家自然科学基金项目（31372049）；山东省科技厅山东省良种工程——资源创新利用项目（2011-2014）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chwang@qau.edu.cn）
通过 HRM 技术筛查与梨矮生性状决定位点
PcDw 紧密连锁的 SNP 标记
李 炜，田义轲，王彩虹*，白牡丹，侯董亮
（青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109）
摘 要：在果树的基因组中存在大量的 SNP（single nucleotide polymorphism）位点，筛查与目标性状
紧密连锁的 SNP 标记，对目标基因的精细定位具有重要意义。以‘矮生梨’（Pyrus communis L.‘Aishengli’）
与‘茌梨’（Pyrus bretschneideri Rehd.‘Chili’）的 F1 杂交分离群体共 215 个单株为试材，参考苹果基因
组的序列设计 26 对适合 HRM 分析的引物，依据分离群体分组分析（bulked segregant analysis，BSA）原
理，通过高通量熔解曲线（high resolution melting，HRM）分析，筛选到两个与决定梨矮生性状的 PcDw
基因连锁的标记 CNqau012 和 CNqau039，二者与目标位点的连锁距离分别是 13.3 cM 和 2.3 cM。对
CNqau012 和 CNqau039 的扩增子测序分析表明，在矮生型与普通型中都存在一处单核苷酸变化（分别是
G/A 和 C/T）。这些标记的获得对 PcDw 基因的精细定位及克隆具有重要意义。
关键词：梨；矮生；性状决定位点 PcDw；SNP 标记；HRM
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）02-0214-07

Screening of SNP Markers Tightly Linked to PcDw Locus Determining
Pear Dwarf Trait Using HRM Technology
LI Wei，TIAN Yi-ke，WANG Cai-hong*，BAI Mu-dan，and HOU Dong-liang
（College of Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China）
Abstract：Screening of SNP markers tightly linked to objective traits is critical for fine mapping of
objective gene due to abundant SNP loci exist in the genome of fruits. In this research，26 primer pairs
which are suit for high resolution melting（HRM）analysis were designed according to the sequences from
apple genome. Based on the principle of the bulked segregant analysis（BSA），these primer pairs were
tested in the F1 population with 215 individuals derived from the cross of Pyrus communis L.‘Aishengli’×
Pyrus bretschneideri Rehd.‘Chili’by HRM，and two markers（CNqau012 and CNqau039）linked to PcDw
locus at the distance of 13.3 cM and 2.33 cM，respectively，were identified. Furthermore，the amplicons of
the two markers（CNqau012 and CNqau039）were sequenced and one single nucleotide changes（G/A and
C/T，respectively）between the dwarf and standard phenotypes were detected. These SNP markers are of
great significance to the following fine mapping and cloning of the PcDw gene.
Key words：pear；dwarf；PcDw；SNP marker；HRM

李 炜，田义轲，王彩虹，白牡丹，侯董亮.
通过 HRM 技术筛查与梨矮生性状决定位点 PcDw 紧密连锁的 SNP 标记.
园艺学报，2015，42 (2)：214–220. 215

矮化密植栽培具有结果早、产量高、效益好、品种更新快、管理方便等优点，已发展成为果树
生产的重要模式。目前，在梨的栽培生产上，优良的矮化砧木及矮生型品种均十分缺乏，因此，研
究挖掘利用优良的矮化基因资源，对相关育种工作的开展具有重要意义。
1991 年青岛农业大学从英国东茂林实验站（East Malling Research Station）引入西洋梨矮生型实
生变异品种‘Le Nain Vert’的杂交种子，播种后获得了具有母本矮生性状的实生后代，并将其命名
为‘矮生梨’。意大利 Rivalta 等（2002）的研究表明，该矮生性状是一个受显性基因控制的质量性
状。Wang 等（2011）将该基因定名为 PcDw。
在果树上，SNP（single nucleotide polymorphism）标记已成为基因组作图和分子检测的重要工
具。在苹果、梨基因组中均已定位了大量的 SNP 标记（Velasco et al.，2010；田义轲 等，2012；
Montanari et al.，2013；Wu et al.，2013）。最近 Terakami 等（2014）构建了含 1 536 个 SNP 的 SNP
微阵列，其中有 609 个定位于丰水梨的遗传图谱上。
Wang 等（2011）在前期工作中已经获得了与 PcDw 连锁的两个 SCAR 标记（S1212-SCAR318、
S1172-SCAR930）和两个 SSR 标记（KA14、TsuENH022），并且通过 KA14 和 TsuEHN022 将该基
因定位于梨基因组第 16 连锁群上。本研究中根据苹果与梨基因组间高度的保守性和共线性关系
（Celton et al.，2009），以苹果基因组序列为参考，进一步开发与梨矮生基因 PcDw 紧密连锁的 SNP
标记，为实现该基因的精细定位及克隆奠定基础。
1 材料与方法
1.1 基因组 DNA 的提取与对比基因池的构建
以‘矮生梨’（矮生型）和‘茌梨’（普通型）及其 F1 杂交群体共 215 株为试材，其中矮生型
107 株，普通型 108 株。试材取自青岛农业大学莱阳果树实验站。
2013 年 4 月初取梨树萌动的腋芽作为材料，参考田义轲等（2003）的方法提取并纯化基因组
DNA，并将 DNA 浓度稀释到 10 ng · L-1。
将供试群体材料按树体表型划分为矮生型与普通型两组，根据分离群体分组分析（bulked
segregant analysis，BSA）原理（Michelmore et al.，1991），从两组中各随机选取 10 份材料，将其
DNA 等量混合，分别组成矮生型基因池（B1）和普通型基因池（B2）。
1.2 SNP 引物的开发设计
根据前期对 PcDw 基因的定位结果（Wang et al.，2011），从 NCBI 网站搜索下载苹果 chr 16
序列，选取上端 150 000 bp 的序列，利用 Primer 3 设计适合 HRM 分析的引物。引物设计的主要参
数：产物大小为 60 ~ 150 bp；引物退火温度（Tm）在 55 ~ 65 ℃之间，且上、下游引物 Tm相差不大
于 2 ℃；引物 GC（%）含量 45% ~ 55%。引物序列见表 1。所有引物由生工生物工程（上海）股份
有限公司合成。
1.3 高分辨率熔解曲线分析
PCR 扩增和高通量熔解曲线分析在 LightCycler®480Ⅱ荧光定量 PCR 仪（Roche）上进行。反应
试剂来自 LightCycler®480 High Resolution Melting Master 试剂盒。反应体系为 10 µL，内含 10 ng 基
因组 DNA，1× Master Mix，2.0 mmol · L-1 MgCl2，引物为 0.2 µmol · L-1。
Li Wei，Tian Yi-ke，Wang Cai-hong，Bai Mu-dan，Hou Dong-liang.
Screening of SNP markers tightly linked to PcDw locus determining pear dwarf trait using HRM technology.
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PCR 扩增程序为 95 ℃预变 10 min，然后按 95 ℃变性 10 min、55 ℃退火 15 s、72 ℃延伸 10 s
的程序进行 45 个循环。在 PCR 循环结束后，立即对扩增产物进行 HRM 检测，程序为：95 ℃ 1 min、
40 ℃ 1 min、65 ℃ 1 s；在 65 ℃升温至 95 ℃的过程中，以 25 次 · ℃-1 的频率收集荧光信息，最后
降温至 40 ℃。
高分辨率熔解曲线分析用 LightCycler®480 的 Gene Scanning 软件（1.5 version）进行。

表 1 本研究设计的 HRM 引物
Table 1 HRM primes designed in this study
SNP 位点
SNP loci
正向引物序列
Forward primer sequence（5′–3′）
反向引物序列
Reverse primer sequence（5′–3′）
产物预期大小/bp
Expected product size
在 LG16 上的区间位置
Position on LG16
CNqau002 GCCCCTCTGAATGTGATGTT CACAAGTTTATTGCGCCTCA 113 74 559 ~ 74 671
CNqau004 CAGAGGACCGGAGGACATTA CTGAGATTTCCGACGATTCC 124 78 484 ~ 78 607
CNqau006 GTAACGAAAGCGGGAAACAA CACCGAAGCTTGACAAATCA 112 82 667 ~ 82 773
CNqau008 ACTCCTCAGACGGAACATGG CTGCCTAACGTTGCATTGAG 120 86 317 ~ 86 436
CNqau010 CAAAGAACAAGGGCAAGAGC TCGTGCTTTGAGTCAGTGCT 120 89 942 ~ 90 061
CNqau012 GCCATTTTACAAGGCTTCCA TCGTTTACTGCAGCACCAAG 122 94 299 ~ 94 420
CNqau014 CAGCATATCCCCAAGCATCT TCTGCACTGTTAGGCTTCCA 109 98 300 ~ 98 408
CNqau016 AAGGCACCAGCTGACAAGTT CGTGTGTTTCCCAGTCTCCT 115 101 952 ~ 102 066
CNqau018 AAATCAAGGCACCTGCTGAG CAAGCCATGAGTTTCCCAGT 121 106 401 ~ 106 521
CNqau020 GCTCATCCCTTTGTGTGCTT GCAACGCAAGACAGAAAACA 123 110 760 ~ 110 882
CNqau021 GGTGGTTTGAGTTGGAGGAA GTCTTTGTCGAAAGCCAAGG 122 112 707 ~ 112 828
CNqau023 AGGAAACCAGGCACACTCAC TCAAGGTTTTGCTGCAAGTG 121 116 259 ~ 116 379
CNqau026 CATGGATTTGCCAGAAGGAA CAAAGAACAAGGCACGGTCT 110 122 937 ~ 123 046
CNqau029 TGTGCTGCTGTGCATGATAA GAGTCGATCATGGTGCCTTT 128 127 893 ~ 128 020
CNqau030 TCGACAGTCGCAAGTGAGAG GTGGGTTCGACGTTTCAATC 121 130 386 ~ 130 506
CNqau032 AAACTCAGCTTTTGGCCTGA AGTGAAGAAGCGCGGATAAA 123 133 984 ~ 134 106
CNqau033 AGCACGGACCAACCAAATAG TCCTCCTCTTGTCTGCAGGT 124 135 109 ~ 135 232
CNqau034 TTCGCCCCTTTGTTTACTTG GTTCGGCTATTTGGCTCATC 122 138 710 ~ 138 831
CNqau036 TGATTTCTGACCGCACGATA AGAGGGAAAAGGATCCGAAA 115 140 345 ~ 140 459
CNqau037 CCAACCTGTGCATGATGAAG AGCCTTCTGTCCAAAGTTCG 122 134 909 ~ 135 030
CNqau039 GAGGGTTGCTGCTGGAAATA AACCCTCCACTTCCAGGACT 114 136 270 ~ 136 383
CNqau041 CCGGGCGAAGTAGAGAGATT CAGCCCAATGTCTGACAAAA 125 137 804 ~ 137 928
CNqau042 ACGAAACCAAGCCCAACATA CTTGATTTCAGGCCACTGGT 103 138 007 ~ 138 109
CNqau043 GGGGATTCTAGGGATCAACG TCGTACGGCCACAAATTTTC 139 139 392 ~ 139 530
CNqau044 CCTCCAAAGGCATGTTCCTA GCGCTAACCTGTGACGATTT 122 140 089 ~ 140 210
CNqau046 ATTACGGGATCCTCCGGATT TGCAACTCCCCTCACTTTCT 117 141 288 ~ 141 404

1.4 SNP 标记的 BSA 筛选及标记间的连锁分析
用 SNP 引物在亲本和对比基因池中筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，以确
定该标记是否与目的基因连锁。统计连锁标记在群体中的分离情况，计算重组率，并用 Kosambi 函
数估算遗传距离（莫惠栋，1996）。用 Joinmap 4.0 软件进行 PcDw 位点及标记间的连锁分析。
1.5 SNP 标记的测序分析
将筛选到的与 PcDw 位点连锁的标记，在两个对比基因池（B1 和 B2）以及矮生型和普通型杂
种（各选 1 株）上进行 PCR 扩增，用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver4.0
（TaKaRa）试剂盒从琼脂糖凝胶上回收产物。将回收产物连接到 pMD®-18T Simple Vector 载体，用
热激法将其转化到大肠杆菌（E. coli DH5α）进行扩繁。将经菌液 PCR 检测为阳性的克隆送生工生
物工程（上海）股份有限公司测序。每个样抽取 3 个单菌落作为测序重复。测序结果用 DNAMAN
软件进行比对分析。
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图 2 DNA 标记与 PcDw 位点的连锁关系图
Fig. 2 Map indicating genetic linkage relationship of DNA
markers and the PcDw locus
2 结果与分析
2.1 SNP 标记的筛选
通过对 26 对 HRM 引物的 BSA 筛选分析，获得了两个与 PcDw 连锁的标记 CNqau012 和
CNqau039。根据这两个标记扩增子的熔解曲线形状差异，可明显地区分矮生型和普通型表型（图 1）。
由 Kosambi 函数估算显示，这两个标记与 PcDw 位点的连锁距离分别是 13.3 cM 和 2.3 cM。

图 1 CNqau012 和 CNqau039 在‘矮生梨’ב茌梨’群体上的 HRM 分析结果
Fig. 1 Results of HRM analysis for CNqau012 and CNqau039 in the population produced by Aishengli × Chili hybrids

2.2 标记间的连锁分析
选取之前筛选的两个 SCAR 标记（S1212-
SCAR318、S1172-SCAR930）、两个 SSR 标记
（KA14、TsuENH022）（Wang et al.，2011）
和本研究中筛选的两个 SNP 标记，用 Join map
4.0 软件分析标记与 PcDw 位点间的连锁关系。
结果（图2）显示，PcDw基因被定位在TsuENH022
和 CNqau039 之间的位置。至此，已获得了覆
盖 PcDw 位点的双侧标记。
2.3 SNP 标记的测序分析
选取与 PcDw 基因连锁的标记 CNqau012
和 CNqau039，对其在两个基因池和两个杂种
后代上的 PCR 扩增产物（图 3）进行回收、克
隆和测序。结果表明，扩增片段分别为 122 bp
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Screening of SNP markers tightly linked to PcDw locus determining pear dwarf trait using HRM technology.
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和 114 bp，与预测大小完全相符。通过在蔷薇科基因组数据库（GDR）（http：//www. rosaceae. org）
中与苹果基因组序列比对，发现标记 CNqau039 位于基因 MDP0000322245（编码腺苷酸环化酶）中，
其序列跨 1 个内含子和 1 个外显子。

图 3 CNqau012 和 CNqau039 在对比基因池和 F1 杂种上的 PCR 扩增结果
1：矮生型基因池；2：普通型基因池；3：矮生型杂种；4：普通型杂种；M：DL2000 DNA marker。
Fig. 3 The result of PCR amplification of CNqau012 and CNqau039 in the contrast bulks and hybrids
1：Dwarf bulk；2：Standard bulk；3：Dwarf hybrid；4：Standard hybrid；M：DL2000 DNA marker.

用 DNAMAN 软件对 CNqau012 和 CNqau039 的扩增序列进行比对，发现在矮生型与普通型间
分别存在一处“转换”型位点差异，即 G/A 和 C/T 碱基变化（图 4）。

图 4 CNqau012（上）和 CNqau039（下）扩增子的序列比对
B1：矮生型基因池；B2：普通型基因池。
Fig. 4 Alignment of amplicons sequence of CNqau012（up）and CNqau039（down）
B1：Dwarf bulk；B2：Standard bulk.
3 讨论
SNP 是植物基因组广泛分布的遗传标记。在果树上，随着基因组测序工作的深入，相继开发鉴
定出大量的 SNP 位点，已在遗传多样性评价、遗传图谱的构建、基因定位以及功能研究等方面发挥
了重要作用（Ahmad et al.，2011；Alencar et al.，2011；Antanaviciute et al.，2012；Cabrera et al.，
2012）。
以往关于 SNP 检测方法主要有扩增片段酶切多态性检测（Cleaved amplified polymorphic
sequences，CAPS）、单链构象多态性检测（Single strand conformation polymorphism，SSCP）（Glavač
& Dean，2005）、变性高效液相色谱技术（Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）
（Nickerson et al.，2000）、基因芯片技术（Syvänen，2005）等。但是这些方法存在准确度不高、分
辨率较低或周期长等缺点。HRM 分析具有闭管操作、快速、高通量等特点，可作为一种高效的 SNP
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筛查技术。目前利用 HRM 技术检测 SNP 已成为果树的种质鉴别及基因分型的重要手段（殷豪 等，
2011；吴波 等，2012；Distefano et al.，2013；Ganopoulos et al.，2013；杨润婷 等，2013），但 HRM
的检测结果不能提供有关序列变化的详细信息，只能作为判断是否存在 SNP 的初步依据，所以需要
结合测序技术进一步确认 SNP 位点的存在形式。
苹果与梨亲缘关系较近，研究表明，二者的基因组具有高度的相似性，且染色体呈现良好的共
线性关系（陈慧 等，2012；Wu et al.，2013）。因此，可借助于苹果基因组的测序组装信息来进行
梨重要性状的分子标记以及相关基因的定位研究。本研究中基于这一策略，参考苹果基因组序列，
设计 HRM 引物，成功地筛查到 1 个与梨矮生性状决定基因 PcDw 紧密连锁的 SNP 标记。在前期研
究已获得的两个 SCAR 标记和两个 SSR 标记均位于 PcDw 位点同侧位置（Wang et al.，2011）。本
研究中新的 SNP 标记的鉴定，获得了 PcDw 位点的双侧标记，据此可以较好地锚定 PcDw 位点在基
因组中定位区间，这对该基因的分离鉴定具有十分重要的意义。

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