全 文 ：园艺学报，2015，42 (7)：1260–1272.
Acta Horticulturae Sinica
1260 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0166；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–03–06；修回日期：2015–06–11
基金项目：国家自然科学基金项目（31370251）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yaox@wbgcas.cn）
基于microRNA深度测序的猕猴桃性别分化初探
闫明科 1,2，徐 强 3，刘春燕 1，张 琼 1，姚小洪 1,*
（1 中国科学院武汉植物园，中国科学院种质创新与特色农业重点实验室，武汉 430074；2 中国科学院大学，北京
100049；3上饶职业技术学院，江西上饶 334109）
摘 要：利用新一代高通量测序技术，对猕猴桃雌花和雄花中表达的小 RNA 进行了测序，分别得到
雌花 18 408 610 条序列和雄花 11 191 469 条序列。通过生物信息学分析，共鉴定和预测得到 39 个保守
miRNA 家族和 400 个新的 miRNA 家族，其中有 170 个 miRNA 家族在雌、雄花样品间显著差异表达。对
差异表达 miRNA 进行靶基因的预测及注释，结果显示，靶基因产物具有包含核苷三磷酸水解酶的磷酸环
结构域的 miRNA 数量最多。在猕猴桃 25 号连锁群（Chr25）上共预测得到 3 个 miRNA，其中
novel-ach-miR362 的靶基因 Achn298021 可能与猕猴桃花的性别发育有关。
关键词：猕猴桃；microRNA；深度测序；性别分化
中图分类号：S 663.4 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）07-1260-13

Preliminary Investigation on Sex Differentiation of Actinidia chinensis by
High-throughput microRNAs Sequencing
YAN Ming-ke1,2，XU Qiang3，LIU Chun-yan1，ZHANG Qiong1，and YAO Xiao-hong1,*
（1Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Specialty Agriculture，Wuhan Botanical Garden，Chinese
Academy of Sciences，Wuhan 430074，China；2University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；
3Shangrao Vocational & Technical College，Shangrao，Jiangxi 334109，China）
Abstract：The miRNAs in female and male flowers of kiwifruit were sequenced by next-generation
sequencing，and received 18 408 610 and 11 191 469 reads，respectively. Using bioinformatics methods，
39 conserved and 400 novel miRNA families including 170 miRNA families that were differently
expressed between the two samples were identified. Targets prediction and annotation of identified
miRNAs revealed the most enrichment of P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolase domain in
InterPro terms. Three miRNAs were predicted to be located on the kiwifruit sex chromosome（Chr25），
among which，target gene Achn298021 of novel-ach-miR362 was predicted to be related to flower
development，and should be drawn special attention in future study.
Key words：kiwifruit；microRNA；high-throughput sequencing；sex determination

猕猴桃是功能性雌雄异株植物，其花芽在发育初期是双性的，但在发育过程中雌、雄株各所对
应的另一种性别的花器官败育，形成单性植株：雌株的雄蕊败育不产生有生活力的花粉，而雄株的
雌蕊败育不形成胚珠（Ferguson，1984）。由于猕猴桃雌、雄株的幼苗外形相似，对其性别分化的分

闫明科，徐 强，刘春燕，张 琼，姚小洪.
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子机理进行研究，有助于在植株发育早期鉴定性别，节省土地和人力物力，提高种植效益。
性二态性是植物生活史中后期发育阶段决定的性状，主要局限于花器官发生和生殖器官分化之
时（Vyskot et al.，2001）。不同植物的性别分化可能受多种不同因素影响（Tanurdzic & Banks，2004；
胡冬南 等，2013；Aryal & Ming，2014；Zhang et al.，2014），而这些因素的作用结果最终在被子植
物中表现在以花为主的生殖器官表型上（Charlesworth，2013）。初始两性花中的一种性器官的发育
受抑制，其细胞进入程序化细胞死亡从而使该种性别特征逐渐消失（Wu & Cheung，2000）。因此，
一系列参与植物花器官发育的基因都可能与植物的性别分化有关。对植物花发育相关基因（主要是
ABC 模型基因）的研究证实了这一观点（Vyskot et al.，2001）。然而，当人们试图将 ABC 模型（或
改进的 ABCDE 模型）基因与植物性染色体直接联系起来时却出现了困难：花器官决定基因更多的
是分散于常染色体上（Hardenack et al.，1994；Matsunaga & Kawano，2001；Vyskot et al.，2001；
Matsunaga et al.，2004）。因此，可进一步推测这些花发育相关基因是受上游转录因子、调控元件及
多种表观遗传因子（包括小 RNA）等的调控，而这些调控基因或与其相关联的基因很可能就位于植
物性染色体或性别决定位点处。不过，目前尚未有经过试验验证的雌雄异株植物性别决定基因的报
道。对猕猴桃杂交后代群体的遗传学分析认为，猕猴桃的性别分化符合 XY 型性染色体性别决定系
统（McNeilage，1995）；进一步的核型观察（Huang et al.，2002）和多基因连锁图谱的构建（Fraser
et al.，2009），发现中华猕猴桃 XY 染色体在长度和外观形态上是相似的，但 Y 染色体上的亚端粒
部位存在不能与 X 染色体自由重组的性别决定位点，并由此推断猕猴桃性染色体尚处于进化的早期
阶段（可能是第二到第三阶段，Ming et al.，2011）。已有研究表明，在猕猴桃雄性不育和可育植株
中同时存在多个控制花器官决定的基因（Varkonyi-Gasic et al.，2011），但在雄性不育植株的早期小孢
子阶段这些基因受到了涉及程序性细胞死亡的抑制作用，致使花药发育异常（Coimbra et al.，2004）。
因此，可以通过研究不同性别猕猴桃花中差异表达的基因及其调控网络来分析其性别决定的机理。
植物体中的微 RNA（microRNA，miRNA）长约 21 nt，通过转录后基因调控的方式参与调节多
种植物发育和内外应答反应，其中即包括花器官发育和花的性别分化（Luo et al.，2013；Taylor et al.，
2014）。目前，运用 miRNA 研究基因功能已应用于多种植物之中，并且取得了一系列重要进展（Zhou
& Luo，2013；Taylor et al.，2014）。玉米中存在一类 ts4 基因，其编码的 zma-miR172e 作用于同源
异型转录因子 APETALA2，ts4 突变株的雄穗发育异常（Chuck et al.，2007）。将新一代高通量测序
技术运用于植物miRNA分析，鉴定了一批在木瓜和杨树中性别差异表达的miRNA（Song et al.，2013；
Aryal et al.，2014），以及其他植物中参与花器官分化、发育的 miRNA（Gao et al.，2012；Wang et al.，
2012；Jiang et al.，2014）。对于猕猴桃的研究表明，miR172 以一种进化上保守的方式作用于一类 A
类花器官同源异型基因 AP2 并控制其表达，缺少 miR172 作用时将导致花发育异常（Varkonyi-Gasic
et al.，2012）。但目前尚没有对于猕猴桃雌、雄花中 miRNA 整体表达谱的研究报道。
本研究中利用第二代高通量测序技术对猕猴桃雌、雄花中表达的小 RNA（sRNA）进行了测序，
运用生物信息学分析，鉴定了其中进化上保守的 miRNA，预测了雌、雄花特异的新 miRNA；筛选了
一批差异表达的 miRNA 并预测了靶基因，为从遗传学角度研究猕猴桃雌、雄株的性别分化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
由于猕猴桃全基因组序列信息来源于中华猕猴桃品种‘红阳’（雌株），为尽量消除遗传背景差
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异并兼顾与基因组数据的吻合性，选用的雌株为‘红阳’，雄株为‘红阳’开放性授粉所获得的子代
雄株。供试植株材料均来源于中国科学院武汉植物园国家猕猴桃种质资源圃。于 2013 年 4 月 1 日取
花蕾期（未开放）的全花，取材后立即置于液氮中并转移至–70 ℃保存备用。
1.2 RNA 提取、文库构建与测序
取 100 mg 组织样本经液氮研磨成粉末后，用 Trizol（Invitrogen）法抽提得到总 RNA。总 RNA
经 15%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，参照 TrackItTM 10 bp DNA Ladder（Invitrogen）在胶中所处
的位置，切胶回收并纯化 15 ~ 40 nt 范围内的 RNA，得到 sRNA。sRNA 文库参照 TruseqTM Small RNA
Sample Preparation Kit（Illumina）的说明进行。得到的 sRNA cDNA 文库用 TruSeq PE Cluster Kit
（Illumina）进行扩增，最后利用 Illumina Hiseq 2000 平台进行测序。
原始序列经 Cutadapt（version 1.3）去接头、Fastx_toolkit（version 0.0.14）过滤低质量、包含 N
和 polyA的序列后，余下 18 ~ 30 nt的干净序列使用 bowtie（version 1.0.0）比对到猕猴桃基因组（Huang
et al.，2013）并去除未匹配序列。比对到基因组的序列又进一步比对到 Rfam 和 NCBI 中的相关
ncRNA，以去除 snRNA、snoRNA、scRNA、rRNA 和 tRNA，比对到 Repbase 中的植物序列以去除
重复元件。余下序列进入后续 miRNA 的鉴定和预测。
保守 miRNA 的鉴定是运用 Blastn（version 2.2.29+）比对到 miRBase（Release 20）完成的，比
对要求完全匹配（只保留至少在 1 个样品中序列数不少于 5 的序列）。新 miRNA（novel miRNA）
预测使用 mireap 进行，仍然舍弃在两个样品中表达量都小于 5 的序列，预测结果使用 cd-hit 利用序
列相似性聚类成家族。保守和新 miRNA 通过 TPM（每百万条序列中目标 miRNA 序列数）校准后
（校准到干净序列总数后，如果两个样品中某个 miRNA 的表达量为 0，则修改为 0.01；如果两个样
品中某个 miRNA 的表达量都小于 1，由于其表达量过低，不参与差异表达分析），利用 IDEG6 完成
差异表达分析，p 值（样品间差异由抽样误差所致的概率）通过 Audic 和 Claverie 途径（Audic &
Claverie，1997）计算得到。本研究中选取了在两个样品间显著差异表达（log2 fold-change 大于 1
或小于–1，p 值小于 0.05）的 miRNA，使用 psRNATarget 进行了靶基因的预测（默认参数）。预测
得到的靶基因基于猕猴桃基因组的注释数据进行了注释，统计了根据 InterPro 中超家族、家族和结
构域的结构和功能预测、分类，并进一步通过 InterPro 中的 interpro2go 转化为 GO 注释，使用 WEGO
进行了 GO 术语的富集分析。
1.3 miRNA 表达的 qRT-PCR 定量验证
为了验证使用深度测序技术分析 miRNA 表达的可靠性，随机选取 11 个显著差异表达的 miRNA
（MIR160、MIR169_1、MIR172、MIR394、MIR397、MIR827_4、MIR1509、novel-ach-miR18、
novel-ach-miR40、novel-ach-miR123 和 novel-ach-miR267）进行 qRT-PCR 的定量验证。
猕猴桃雌、雄花花蕾经–70 ℃保存直至 RNA 提取。总 RNA 使用 EASYspin Plus 植物 RNA 快
速提取试剂盒（艾德莱生物）提取获得，并直接用于 miRNA 的逆转录。逆转录使用 PrimeScriptTM RT
reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）进行，使用的 stem-loop 引物根据 Chen
等（2005）的报道设计合成；将引物混合后按 Tang 等（2006）介绍的混合逆转录法进行温度设置。
逆转录产物经稀释 10 倍后，使用 SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）进
行荧光定量检测。试验操作按照试剂盒说明书进行，最后使用 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System
进行荧光定量，采用两步法 PCR 进行温度设置：95 ℃ 30 s，1 个循环；95 ℃ 3 s，62 ℃ 30 s，40
个循环。每个 miRNA 都设计至少 3 个生物学重复及 3 个技术重复，并同时使用经测试在猕猴桃花
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发育不同时期相对较稳定表达的 5.8S 和 U6 作为内参进行校准。所得数据使用∆∆Ct 法进行了 miRNA
表达的相对定量分析。
2 结果与分析
2.1 测序结果统计
因为猕猴桃花的性别分化在花发育早期就已决定（Brundell，1975；Polito & Grant，1984；White，
1990；Scoccianti et al.，1999；Vyskot et al.，2001；Coimbra et al.，2004；杨妙贤 等，2011；Falasca
et al.，2013），故为研究其雌、雄花中的 miRNA 表达情况，选取了中华猕猴桃品种‘红阳’（雌株）
及其子代雄株的花蕾全花提取分离 miRNA 进行了测序。测序分别得到 18 408 610（雌花，F）和
11 191 469（雄花，M）条序列。原始序列经去接头、质量控制后，雌、雄样品分别得到 10 808 482
和 10 052 964 条长度为 18 ~ 30 nt 的干净序列。对这些干净序列的长度进行统计，结果显示大部分
序列分布于 21 ~ 24 nt 之间，其中长度为 24 nt 的序列占比最多，21 nt 次之（图 1），这与其他众多
植物中的测序结果（Zhao et al.，2010；Khraiwesh et al.，2013；Aryal et al.，2014）类似。从样品间
分析可以发现，雌花中的 sRNA 在 21 ~ 24 nt 间的集中度更为明显，占样本 sRNA 总数的 84.93%，
特别是数量最多的 24 nt 和 21 nt 长度的序列，占到了 70.04%；而雄花中的 sRNA 分布则相对更为均
匀，分别为 67.86%（21 ~ 24 nt）和 54.14%（21 nt + 24 nt）。将干净序列比对到猕猴桃基因组序列，
分别有 8 496 009（78.61%）和 7 748 498（77.08%）条完全匹配结果。进一步比对到 Rfam 和 NCBI
的相关序列以去除 snRNA、snoRNA、scRNA、rRNA 和 tRNA，比对到 Repbase 去除重复元件后，
余下 8 481 708 和 7 721 618 条序列（表 1），分别代表 2 088 976 和 1 362 085 条单一序列（非冗余）
进入后续 miRNA 的鉴定和预测分析。
图 1 猕猴桃雌花和雄花 sRNA 长度分布
Fig. 1 Length distribution of sRNA of female and male flowers of kiwifruit

表 1 测序数据处理统计
Table 1 Statistical analysis of sequencing reads for the two sRNAs libraries
样品
Sample
原始序列
Raw reads
干净序列
Clean reads
比对到参考
基因组序列
Mapped to
genome
比对到 snRNA
等的序列
Mapped to other
ncRNAs
比对到 Repbase
的序列
Mapped to
Repbase
候选 miRNA
总序列
Candidate miRNA
total reads
候选 miRNA
单一序列
Candidate miRNA
unique reads
雌花 Female 18 408 610 10 808 482 8 496 009 11 862 2 439 8 481 708 2 088 976
雄花 Male 11 191 469 10 052 964 7 748 498 20 479 6 401 7 721 618 1 362 085
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2.2 保守 miRNA 鉴定
通过与 miRBase 数据库进行比对，雌花样品有 953 条单一序列得到精确匹配结果，涉及到 39
个保守 miRNA 家族；雄花样品则有 1 040 条匹配序列共 37 个保守 miRNA 家族。在鉴定得到的保
守 miRNA 家族中，有 37 个家族是雌雄共有的，有两个家族（MIR827_4 和 MIR827_5）为雌花特有。
2.3 新 miRNA 预测与分析
对于在 miRBase 中没有精确匹配结果的 sRNA 序列，采用 mireap 软件比对到猕猴桃参考基因
组，以预测和发掘猕猴桃（花）中特异表达的 miRNA。将预测结果进行整理分析，在雌、雄花中分
别预测得到 293 和 187 条新的 miRNA 序列；其中，有 80 条新 miRNA 为雌、雄花共有，213 条为
雌花特有，而 107 条为雄花特有。
2.4 miRNA 差异表达分析
对雌、雄花样品间差异表达的 miRNA 进行了分析。设定变化倍数大于 2 倍，且 p 值小于 0.05
的标准作为显著差异表达的认定依据。从总共 439 个 miRNA 家族（保守 39 个，新的 400 个）中鉴
定得到 170 个显著差异表达的 miRNA 家族。其中，相对于雌花样品，雄花样品中的保守 miRNA 家
族有 6 个上调表达和 7 个下调表达，而新 miRNA 家族则有 43 个上调表达和 114 个下调表达（表 2）。

表 2 猕猴桃雌、雄花显著差异表达 miRNA 家族
Table 2 Significantly differently expressed miRNA families of male and female flowers
校准后序列数
Normalized count
miRNA 家族
miRNA family
序列
Sequence
F M
Log2(M/F) p
表达模式
Expression mode
MIR160 TGCCTGGCTCCCTGTATGCCA 2.50 6.47 1.37 3.00E-06 上调 Up
MIR169_1 TAGCCAAGAATGACTTGCCTG 0.65 2.09 1.69 1.26E-03 上调 Up
MIR172 AGAATCTTGATGATGCTGCAG 1.76 0.60 –1.56 4.01E-03 下调 Down
MIR394 TTGGCATTCTGTCCACCTCC 1.67 12.43 2.90 0 上调 Up
MIR397 TCATTGAGTGCAGCGTTGATG 2.50 1.19 –1.07 5.75E-03 下调 Down
MIR398_2 TGTGTTCTCAGGTCGCCCC 0.19 1.39 2.91 5.65E-04 上调 Up
MIR529 TTGACAGAAGAGAGAGAGCAC 2.78 0.10 –4.80 0 下调 Down
MIR827 TTAGATGACCATCAGCAAACA 3.24 0.70 –2.22 8.00E-06 下调 Down
MIR827_4 TTTTGTTGATGGTCATCTAATC 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
MIR827_5 TTTTGTTGATGGTCATCTAATC 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
MIR1509 TTATACAGAGAAATCACGGTCG 59.12 26.26 –1.17 0 下调 Down
MIR3630 TTGGGAATCTCTCTGATGCAT 2.78 7.36 1.41 1.00E-06 上调 Up
MIR4376 TACGCAGGAGAGATGATGCTG 1.57 4.68 1.57 1.20E-05 上调 Up
novel-ach-miR3 ATGCATTGATGGTTCTGAGCAAT 3.61 1.19 –1.60 8.70E-05 下调 Down
novel-ach-miR10 CAACCGCGAAACCGTCGACCCG 44.59 16.51 –1.43 0 下调 Down
novel-ach-miR15 TTAAGGATTGCTGCCGTGTGTA 5.37 0.60 –3.17 0 下调 Down
novel-ach-miR18 GAGCGATTTGTCTGGTTAATTC 6.29 28.75 2.19 0 上调 Up
novel-ach-miR19 CAAAATCCAGAGATCGCACTTT 3.98 1.39 –1.51 7.10E-05 下调 Down
novel-ach-miR21 TTCCTTAGGCTAGTCGAATTGA 2.31 1.09 –1.08 6.83E-03 下调 Down
novel-ach-miR22 CGGGCATCATCCTTGGCTTGCC 0.74 2.09 1.50 2.36E-03 上调 Up
novel-ach-miR24 TTGTCGTAGGAGAGATGGCACC 3.52 13.73 1.97 0 上调 Up
novel-ach-miR25 TTGGTACTGCATACATTTGGTG 6.11 1.69 –1.85 0 下调 Down
novel-ach-miR29 TAGAATACGGAATGAAAACGCC 1.30 0.50 –1.38 1.46E-02 下调 Down
novel-ach-miR30 TCTGATACCAATTGTTGTGCCT 2.78 1.29 –1.10 3.61E-03 下调 Down
novel-ach-miR32 CAACTCCTTGTGGAATCGACCT 1.57 0.70 –1.18 1.41E-02 下调 Down
novel-ach-miR34 ATGAAGTCTTGTTCAACTGCCT 7.59 1.39 –2.45 0 下调 Down
novel-ach-miR39 TTTTGAAATTCTGATGGGGCAT 24.06 5.77 –2.06 0 下调 Down
novel-ach-miR40 TTAAAATGAAAATCTTTGGGAT 20.91 4.58 –2.19 0 下调 Down
novel-ach-miR44 GTGTTTTCTATCGTTGTCATA 1.11 0.20 –2.48 3.81E-03 下调 Down
novel-ach-miR45 TCCATGATCCAAATACAGCCT 1.02 0.40 –1.35 2.56E-02 下调 Down
novel-ach-miR47 TTTGGTGAGGGAAAAGGGAAA 9.81 3.58 –1.45 0 下调 Down
novel-ach-miR53 ATTGACAGACTGAGAGCTCTT 17.12 41.28 1.27 0 上调 Up
novel-ach-miR55 CTTTCGTTCTTGATTAATGAA 0.74 1.99 1.43 3.55E-03 上调 Up
novel-ach-miR56 TCGGATCCTCTGAAGTGCGCC 1.67 0.80 –1.07 1.58E-02 下调 Down
novel-ach-miR57 TGCTGGTATGATCGCACCCGA 7.12 3.08 –1.21 8.00E-06 下调 Down

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续表 2
校准后序列数
Normalized count
miRNA 家族
miRNA family
序列
Sequence
F M
Log2(M/F) p
表达模式
Expression mode
novel-ach-miR58 ATGGATCCGGAACGCCGAGAA 2.04 0.60 –1.77 1.19E-03 下调 Down
novel-ach-miR60 TAGTGGATGTAGCAACGAGAA 126.66 48.74 –1.38 0 下调 Down
novel-ach-miR61 TTTGGCTGGCGGATATGAGAG 2.31 0.80 –1.54 1.41E-03 下调 Down
novel-ach-miR62 TCACAAAATAAGTAGGACCCG 3.79 0.40 –3.25 0 下调 Down
novel-ach-miR65 CCACTGCCTCCTCGTCAAGCG 0.46 1.99 2.10 4.36E-04 上调 Up
novel-ach-miR66 TTGCACACGCACCTGAATCGG 2.78 6.76 1.29 5.00E-06 上调 Up
novel-ach-miR71 TTTGATCTCTGATTCATGCCT 1.02 0.50 –1.03 3.95E-02 下调 Down
novel-ach-miR73 TTGAATTCTGTGAACTTTTCT 1.11 0.30 –1.90 9.18E-03 下调 Down
novel-ach-miR76 ATGGTGAGGCTTTGGGAAGAA 1.57 0.70 –1.18 1.41E-02 下调 Down
novel-ach-miR77 ATTTCTCTGTATGCTTCATCC 0.74 2.88 1.96 6.20E-05 上调 Up
novel-ach-miR78 TTTAGGATTCGTTGGGTTGAG 7.22 0.50 –3.86 0 下调 Down
novel-ach-miR83 AAATCCTTTGACTTCGTCGTGAGT 0.01 4.28 8.74 0 上调 Up
novel-ach-miR84 TTGTCGAGTATTAGGAATGGAGCC 0.01 17.31 10.76 0 上调 Up
novel-ach-miR96 TTCGGGTATGAACTGGGCTGACC 0.01 4.38 8.77 0 上调 Up
novel-ach-miR103 ATTCGTTGTCGGACTACTTGGCC 0.01 4.28 8.74 0 上调 Up
novel-ach-miR106 GGGATATGATGATAGTCGTTGTC 0.01 1.59 7.31 4.00E-06 上调 Up
novel-ach-miR110 TTGCCATTAAGGACTCCTCTAG 0.01 1.29 7.01 3.60E-05 上调 Up
novel-ach-miR112 CTAATGAGTATCAGTTGGGCCT 0.01 5.37 9.07 0 上调 Up
novel-ach-miR113 CAAGAATGGGGGCTGTATGAGC 0.01 1.09 6.77 1.57E-04 上调 Up
novel-ach-miR115 TTGTGACTAGATGCCCGAGGAA 0.01 2.19 7.77 0 上调 Up
novel-ach-miR118 CTTGGGCCGAGCTGGATGGACC 0.01 1.09 6.77 1.57E-04 上调 Up
novel-ach-miR120 TTCCGTAATCCGCGTGTTTGGC 0.01 1.59 7.31 4.00E-06 上调 Up
novel-ach-miR121 AAAGGCTAAGGAGACAAGTGAG 0.01 1.29 7.01 3.60E-05 上调 Up
novel-ach-miR123 TTTGGCTGGAGGATATGGGAAG 0.01 3.88 8.60 0 上调 Up
novel-ach-miR128 TTAGGACACAAGCACTTCGGGG 0.01 3.98 8.64 0 上调 Up
novel-ach-miR132 TGAAAACGAAGTGGTCTGACTT 0.01 11.24 10.13 0 上调 Up
novel-ach-miR134 ATTCCTTGATTTTCTTTGACTT 0.01 3.98 8.64 0 上调 Up
novel-ach-miR138 ACATTCCTTATGATCTTCTAAC 0.01 1.49 7.22 8.00E-06 上调 Up
novel-ach-miR141 TTGAGGCGGAGCATGGCGAGGA 0.01 6.86 9.42 0 上调 Up
novel-ach-miR146 TGTAGGTCGACCTTTATGTTCC 0.01 1.29 7.01 3.60E-05 上调 Up
novel-ach-miR148 TACGGTGTACATCGACTTGGTC 0.01 1.39 7.12 1.80E-05 上调 Up
novel-ach-miR151 ATCTGGACCATTCATTTTGAA 0.01 2.59 8.01 0 上调 Up
novel-ach-miR154 ATCTTAGAGTATGGAGCGCCT 0.01 1.19 6.90 7.60E-05 上调 Up
novel-ach-miR156 TCTGGACCATTCATTTAAAAA 0.01 1.79 7.48 1.00E-06 上调 Up
novel-ach-miR157 AATAAGTGAGATCCGTCCTAA 0.01 3.28 8.36 0 上调 Up
novel-ach-miR158 ACTTGGCATGACCGTTGGGCA 0.01 2.19 7.77 0 上调 Up
novel-ach-miR160 TGCATTTGCACCTGCACCTGA 0.01 2.69 8.07 0 上调 Up
novel-ach-miR161 AATTTGGTCAATGAAAGGGGC 0.01 1.49 7.22 8.00E-06 上调 Up
novel-ach-miR162 TCACAATTGAATACGGGCTCC 0.01 3.68 8.52 0 上调 Up
novel-ach-miR163 TGCACTCCTGTACTTTCGCCT 0.01 1.79 7.48 1.00E-06 上调 Up
novel-ach-miR165 CAAAATAAGTGGGACCCGCCT 0.01 2.19 7.77 0 上调 Up
novel-ach-miR168 ACATTGGTTGCTGTGAGGGCC 0.01 3.18 8.31 0 上调 Up
novel-ach-miR169 CCGGGTGTGCTCGTGTTGCCC 0.01 1.39 7.12 1.80E-05 上调 Up
novel-ach-miR172 TAGAGATCCGAGGTTTGTGTC 0.01 1.59 7.31 4.00E-06 上调 Up
novel-ach-miR178 TCGACTTGAGAAAATTGGGCC 0.01 1.09 6.77 1.57E-04 上调 Up
novel-ach-miR187 GTGGGGAGTTTGGCTGGGGC 0.01 38.70 11.92 0 上调 Up
novel-ach-miR188 AGCCGGTGATGAGGAATTTTTGGGC 1.39 0.01 –7.12 2.50E-05 下调 Down
novel-ach-miR189 AGAGTTGAGTTTGGGTTTTTGAGC 2.50 0.01 –7.96 0 下调 Down
novel-ach-miR190 AAGAATGGAGGCATGAATGAGCTC 1.94 0.01 –7.60 0 下调 Down
novel-ach-miR194 ATTGGCTGAATCGATCTCTAAGAT 5.09 0.01 –8.99 0 下调 Down
novel-ach-miR196 ATTCCATGAAGAACCGTCGGGCA 2.50 0.01 –7.96 0 下调 Down
novel-ach-miR203 TAACCAAGTGAATCTGAACCATT 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR204 ATTAGTTGACTGGGACAGGGCCT 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR208 AAGGCTCTAACACTCTATGATGT 1.02 0.01 –6.67 3.48E-04 下调 Down
novel-ach-miR214 TGTGGAATAAAAAATTTATCGTT 1.94 0.01 –7.60 0 下调 Down
novel-ach-miR217 AAAAGAGTTATGCTGACCGGAGG 2.04 0.01 –7.67 0 下调 Down
novel-ach-miR224 TTGGTGGCCGTTGATTATGTTTC 1.20 0.01 –6.91 9.30E-05 下调 Down
novel-ach-miR234 TATATGAGGATACGGAGGACAAC 1.48 0.01 –7.21 1.30E-05 下调 Down
novel-ach-miR236 GAGACGATCAGGACTGTGGCGCC 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR239 TAATGTTAAGACGGGCTCGAGCC 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
novel-ach-miR240 TTCTGACTTTTTAATTTTGGCCC 2.31 0.01 –7.85 0 下调 Down
novel-ach-miR243 TCCGGCGTGGCGATAGAATCATC 5.18 0.01 –9.02 0 下调 Down
novel-ach-miR244 TGAATGGTGGACTATATATGGT 1.02 0.01 –6.67 3.48E-04 下调 Down
novel-ach-miR245 CATCTTCTCTGCTCTGTGGCCT 6.66 0.01 –9.38 0 下调 Down
novel-ach-miR246 CAGGATAAAATGGCTAGAACCA 3.24 0.01 –8.34 0 下调 Down
novel-ach-miR250 TTTGTTGTGTTATCATGAGACT 1.39 0.01 –7.12 2.50E-05 下调 Down
novel-ach-miR251 TTCAATAGTCTAAGTGTAAACT 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down

Yan Ming-ke，Xu Qiang，Liu Chun-yan，Zhang Qiong，Yao Xiao-hong.
Preliminary investigation on sex differentiation of Actinidia chinensis by high-throughput microRNAs sequencing.
1266 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1260–1272.
续表 2
校准后序列数
Normalized count miRNA 家族
miRNA family
序列
Sequence
F M
Log2(M/F) p 表达模式 Expression mode
novel-ach-miR252 TTAAGGGTTAGGATTTTGTGTC 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR254 CATTCTGCAACGCCCTTGGCAC 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
novel-ach-miR255 CCAAAATGCTAATCTGAGGCTT 1.39 0.01 –7.12 2.50E-05 下调 Down
novel-ach-miR256 TGAGGATCTTAGTGTGAACTAG 3.05 0.01 –8.25 0 下调 Down
novel-ach-miR257 TACGTGAGAGAGAGTATGAGCC 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR263 TTTGGAATATGGATTTTAGGTC 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR264 CGTGATATTGGTCTGGCTCATC 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR267 CATTCCATGCTGGTTGTCGGTG 33.31 0.01 –11.70 0 下调 Down
novel-ach-miR271 TTTTGGGATCAGATTAAAAGAC 1.57 0.01 –7.30 7.00E-06 下调 Down
novel-ach-miR272 AATTGGAGAGGACAATTGGTCT 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
novel-ach-miR277 GCCCGTCTAGCTCAGTTGGTAG 1.20 0.01 –6.91 9.30E-05 下调 Down
novel-ach-miR280 TAAACTAAGTGTAGATATGGCT 2.59 0.01 –8.02 0 下调 Down
novel-ach-miR283 CGGACCAATGACCATCAAGTTG 17.67 0.01 –10.79 0 下调 Down
novel-ach-miR284 TCTTCCAAGAGATTCTAGAACC 1.85 0.01 –7.53 1.00E-06 下调 Down
novel-ach-miR285 CATTTGGATCTTGGGCTTCTCC 4.81 0.01 –8.91 0 下调 Down
novel-ach-miR288 GAGCTGTGATGACATCTGCGCT 6.66 0.01 –9.38 0 下调 Down
novel-ach-miR290 CTTTGAGTATTGGATTATTGAT 1.02 0.01 –6.67 3.48E-04 下调 Down
novel-ach-miR296 TGGTCTGGACTGATATGAAGTC 4.72 0.01 –8.88 0 下调 Down
novel-ach-miR299 TTTTCACACTCGTTGTCACGTG 2.04 0.01 –7.67 0 下调 Down
novel-ach-miR302 TATGCTAATGCTGTTGGTGCCT 9.34 0.01 –9.87 0 下调 Down
novel-ach-miR307 CCGGGTAGGCTTTGGCGATAAT 1.67 0.01 –7.38 3.00E-06 下调 Down
novel-ach-miR308 ATAGAGAGAGAGCACTGATGTG 1.20 0.01 –6.91 9.30E-05 下调 Down
novel-ach-miR310 TAAGTGTAAATTATATTGGGCT 1.39 0.01 –7.12 2.50E-05 下调 Down
novel-ach-miR313 TGTACCCGGCCTGATTCCTTCT 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
novel-ach-miR314 ACAAGGATGTTGATTGAATGAC 1.57 0.01 –7.30 7.00E-06 下调 Down
novel-ach-miR315 TAAATAAATATATAAACTGGGC 1.76 0.01 –7.46 2.00E-06 下调 Down
novel-ach-miR317 TAAAAGAGAGAGAGGAAAGGCT 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR321 TGACTAGTTTCGATGTAATCCT 1.02 0.01 –6.67 3.48E-04 下调 Down
novel-ach-miR322 TGAGATGAGGGACTTCAAGAAC 9.25 0.01 –9.85 0 下调 Down
novel-ach-miR323 CTTCTTTATTCGTGTGTACCCG 1.20 0.01 –6.91 9.30E-05 下调 Down
novel-ach-miR324 CTAGATCCTGAAGTATATGACT 1.67 0.01 –7.38 3.00E-06 下调 Down
novel-ach-miR326 TCGAAGGTCAACGGTGGCGCC 3.70 0.01 –8.53 0 下调 Down
novel-ach-miR329 AGAGGTCGTAGGGAGTAAGCC 1.39 0.01 –7.12 2.50E-05 下调 Down
novel-ach-miR330 CATCGGTCAGGAGTCGTCTCC 54.86 0.01 –12.42 0 下调 Down
novel-ach-miR331 AGACGACTCCTGACCGATGTG 1.20 0.01 –6.91 9.30E-05 下调 Down
novel-ach-miR332 TATTGGAGGCGGCGTCAGGTT 2.04 0.01 –7.67 0 下调 Down
novel-ach-miR333 TTATAGACAGCATAGAGGGGC 1.02 0.01 –6.67 3.48E-04 下调 Down
novel-ach-miR334 CGATTCCCACAGACGGCGCCA 5.18 0.01 –9.02 0 下调 Down
novel-ach-miR335 TCCGGAATCCAAACACAGCCT 3.24 0.01 –8.34 0 下调 Down
novel-ach-miR339 TTACGTATCGGAATTTTGGCC 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR347 GCAACATGATGAATTCTGAAC 1.94 0.01 –7.60 0 下调 Down
novel-ach-miR349 TTGACGTACTGGGGTTAAACC 4.35 0.01 –8.76 0 下调 Down
novel-ach-miR350 ATTTTGGGTTTGGACTTAGCC 2.13 0.01 –7.73 0 下调 Down
novel-ach-miR355 TCCTTGATCCAAAGACAGCCT 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR356 TGTGAGTATGCATTGTACATG 1.39 0.01 –7.12 2.50E-05 下调 Down
novel-ach-miR358 ACAAAATAAGTAGGACCCGTC 1.02 0.01 –6.67 3.48E-04 下调 Down
novel-ach-miR362 ATTCAGGCTCTGTTTGGCACC 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
novel-ach-miR364 TCTTTGATCCAAACACAGCCT 1.48 0.01 –7.21 1.30E-05 下调 Down
novel-ach-miR367 TTCAAAGTTGAGTGTATGCCT 1.57 0.01 –7.30 7.00E-06 下调 Down
novel-ach-miR369 TTGACTAGAGCCGTTGACCGA 1.57 0.01 –7.30 7.00E-06 下调 Down
novel-ach-miR372 ATATAGTTTGGCTGGGCACTT 35.16 0.01 –11.78 0 下调 Down
novel-ach-miR373 TTTTCAAACACACTTGGACCC 1.02 0.01 –6.67 3.48E-04 下调 Down
novel-ach-miR375 CTCGAGATTGATTGTGAAGAT 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
novel-ach-miR376 TCCAGATCTGATGACCCATTA 1.30 0.01 –7.02 4.80E-05 下调 Down
novel-ach-miR377 TGGGTCATCAGATCTGGACCT 1.48 0.01 –7.21 1.30E-05 下调 Down
novel-ach-miR379 TTTTAGGATGAACCCAGAGAA 2.22 0.01 –7.79 0 下调 Down
novel-ach-miR380 CGCAGTAGATCTGAGCGGCCT 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
novel-ach-miR382 TTTTGGACCAAGAAAAATTCT 1.20 0.01 –6.91 9.30E-05 下调 Down
novel-ach-miR383 TGATGAATGATGGATGCCCAT 1.67 0.01 –7.38 3.00E-06 下调 Down
novel-ach-miR384 TTCCAAGCAGTTTTTGATGAC 1.02 0.01 –6.67 3.48E-04 下调 Down
novel-ach-miR389 ATTCAGCGGATCCTTGGGCCC 1.11 0.01 –6.79 1.80E-04 下调 Down
novel-ach-miR390 CGGAGGTTGGTTTGGATTCTC 1.94 0.01 –7.60 0 下调 Down
novel-ach-miR392 TACATTAGGAGTGGCTTGACC 2.04 0.01 –7.67 0 下调 Down
novel-ach-miR394 TTCGAGAACCAAATGCAGCCT 2.50 0.01 –7.96 0 下调 Down
novel-ach-miR396 AATTGACGGAAGGGCACCACC 263.96 0.01 –14.69 0 下调 Down
novel-ach-miR397 TTCATCTGTAGCCTTTGCCC 2.87 0.01 –8.16 0 下调 Down
novel-ach-miR398 GAGTAATGATTAACAGGGAC 18.13 0.01 –10.82 0 下调 Down
novel-ach-miR399 GGTACAGAGAAGAGAAGATG 1.85 0.01 –7.53 1.00E-06 下调 Down
闫明科，徐 强，刘春燕，张 琼，姚小洪.
基于 microRNA 深度测序的猕猴桃性别分化初探.
园艺学报，2015，42 (7)：1260–1272. 1267

2.5 显著差异表达 miRNA 靶基因预测分析
选取表达差异显著的 170 个 miRNA 家族，使用在线 sRNA 靶基因预测工具 psRNATarget，将
miRNA 比对到猕猴桃基因组 CDS 序列（http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi）进行靶
基因的预测。经分析，共有 144 个 miRNA 家族预测得到了 608 个（非冗余）靶基因序列。
对预测得到的靶基因注释进行分析，其高频 InterPro 义项分布如表 3。其中，调控 IPR027417
和 IPR011009 的 miRNA 数量显著高于其他条目，意味着具有包含核苷三磷酸水解酶的磷酸环和蛋
白激酶类似结构域这两种结构的蛋白（基因）在猕猴桃性别决定过程中具有重要作用。

表 3 显著差异表达 miRNA 预测靶基因的高频 InterPro 义项分布
Table 3 Enriched InterPro terms of targets of differentially expressed miRNAs
InterPro 登录号
InterPro accession
number
相关 miRNA 家族数
Related miRNA
families count
InterPro 注释
InterPro annotation
IPR027417 44 包含核苷三磷酸水解酶的磷酸环 P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolase
IPR011009 32 蛋白激酶类似结构域 Protein kinase-like domain
IPR018289 19 MULE 转座酶 MULE transposase domain
IPR013320 18 伴刀豆球蛋白A 类似的凝集素/葡聚糖酶结构域 Concanavalin A-like lectin/glucanase domain
IPR004333 14 转录因子，SBP 盒 Transcription factor，SBP-box
IPR002885 13 三角状五肽重复 Pentatricopeptide repeat
IPR017761 13 漆酶 Laccase
IPR001810 12 F–盒结构域 F-box domain
IPR009057 12 同源域类似结构 Homeodomain-like
IPR016177 11 DNA 结合结构域 DNA-binding domain
IPR011990 11 类似三角状四肽的螺旋结构域 Tetratricopeptide-like helical domain
IPR016024 10 犰狳型折叠 Armadillo-type fold
IPR013083 9 锌指结构，RING/FYVE/PHD 型 Zinc finger，RING/FYVE/PHD-type
IPR012677 9 结合核苷酸的 alpha-beta 辫状结构域 Nucleotide-binding alpha-beta plait domain
IPR005225 8 小 GTP 结合蛋白结构域 Small GTP-binding protein domain
IPR016040 8 NAD（P）结合结构域 NAD(P)-binding domain
IPR001650 7 解旋酶，C 端 Helicase，C-terminal
IPR015943 7 包含类似 WD40/YVTN 重复的结构域 WD40/YVTN repeat-like-containing domain
IPR021109 7 天门冬氨酸肽酶结构域 Aspartic peptidase domain
IPR023214 7 HAD 类似结构域 HAD-like domain
IPR010525 6 生长素响应因子 Auxin response factor
IPR001461 6 天门冬氨酸肽酶 Aspartic peptidase
IPR015300 6 DNA 结合伪管结构域 DNA-binding pseudobarrel domain
IPR002041 5 Ran GTP 酶 Ran GTPase
IPR002902 5 Gnk2 同源结构域 Gnk2-homologous domain
IPR001806 5 小 GTP 酶超家族 Small GTPase superfamily
IPR007527 5 锌指结构，SWIM 型 Zinc finger，SWIM-type
IPR015500 5 肽酶 S8，枯草杆菌蛋白酶相关 Peptidase S8，subtilisin-related
IPR008972 5 杯蛋白 Cupredoxin
IPR001611 5 亮氨酸富集重复区 Leucine-rich repeat
IPR001757 5 P 型 ATP 酶 P-type ATPase
IPR011598 5 Myc 型，碱性螺旋–环–螺旋结构域 Myc-type，basic helix-loop-helix (bHLH) domain
IPR011043 5 半乳糖氧化酶/kelch，beta 促进因子 Galactose oxidase/kelch，beta-propeller
IPR017451 5 F 盒联合互作结构域 F-box associated interaction domain
IPR023828 5 肽酶 S8，枯草杆菌蛋白酶，丝氨酸激活位点 Peptidase S8，subtilisin，Ser-active site
Yan Ming-ke，Xu Qiang，Liu Chun-yan，Zhang Qiong，Yao Xiao-hong.
Preliminary investigation on sex differentiation of Actinidia chinensis by high-throughput microRNAs sequencing.
1268 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1260–1272.
进一步对靶基因进行 Gene Ontology 注释得到表 4 所示结果。在细胞组分分支中，细胞和细胞
部件这两个条目涉及到的基因显著多于其他条目，意味着在猕猴桃花的性别分化过程中有很多参与
决定细胞和细胞结构的基因参与；在分子功能分支中，结合和催化这两个条目涉及到更多的基因，
说明分子间结合和催化反应在猕猴桃花性别分化中有重要作用；在生物学过程分支中则是代谢过程
和细胞过程涉及的基因占最大比例，则表明在性别分化反应中发生了重要的代谢反应和胞间通讯。

表 4 显著差异表达 miRNA 预测靶基因 Gene Ontology 注释分析
Table 4 Gene Ontology classification of target gene of significantly differentially expressed miRNAs
GO 类别
GO domains
GO 登录号
GO accession number
相关基因数
Related genes number
相关基因比例
Related genes percent
GO 术语
GO term
GO：0005576 13 1.4 胞外区域 Extracellular region
GO：0005623 118 12.5 细胞 Cell
GO：0031974 4 0.4 膜内腔 Membrane-enclosed lumen
GO：0031975 7 0.7 外壳 Envelope
GO：0032991 26 2.8 大分子复合物 Macromolecular complex
GO：0043226 59 6.3 细胞器 Organelle
GO：0044422 18 1.9 细胞器组分 Organelle part
细胞组分
Cellular
component
GO：0044464 118 12.5 细胞部件 Cell part
GO：0016209 5 0.5 抗氧化剂活性 Antioxidant activity
GO：0060089 3 0.3 分子转导蛋白活性 Molecular transducer activity
GO：0030528 5 0.5 转录调节因子活性 Transcription regulator activity
GO：0045182 1 0.1 翻译调控因子活性 Translation regulator activity
GO：0030234 3 0.3 酶调节因子活性 Enzyme regulator activity
GO：0005198 2 0.2 结构分子活性 Structural molecule activity
GO：0003824 165 17.5 催化活性 Catalytic activity
GO：0005488 266 28.2 结合 Binding
分子功能
Molecular
function
GO：0005215 17 1.8 转运体活性 Transporter activity
GO：0044085 8 0.8 细胞组分产生 Cellular component biogenesis
GO：0000003 4 0.4 生殖 Reproduction
生物过程
Biological
process GO：0016043 11 1.2 细胞组分组织 Cellular component organization
GO：0008152 168 17.8 代谢过程 Metabolic process
GO：0022414 4 0.4 生殖过程 Reproductive process

GO：0043473 49 5.2 着色 Pigmentation
GO：0051179 40 4.2 定位 Localization
GO：0050896 16 1.7 响应刺激 Response to stimulus

GO：0009987 154 16.3 细胞过程 Cellular process
GO：0040007 1 0.1 生长 Growth
GO：0032501 1 0.1 多细胞生物过程 Multicellular organismal process

GO：0010926 5 0.5 组织结构形成 Anatomical structure formation
GO：0051704 4 0.4 多生物体过程 Multi\-organism process
GO：0065007 50 5.3 生物调节 Biological regulation
GO：0051234 40 4.2 定位的确立 Establishment of localization


从猕猴桃基因组可知，第 25 连锁群（Chr25）为猕猴桃性染色体，故对位于 Chr25 上的 miRNA
进行了重点分析。共有 78 个 miRNA 能完全比对到 Chr25 上，其中有 26 个表达差异显著，只有 3
个（novel-ach-miR60、novel-ach-miR283 和 novel-ach-miR362）能形成 miRNA 前体茎环结构。这 3
个 miRNA 靶基因注释如表 5。进一步分析发现，novel-ach-miR60 为 Chr25 特有，而 novel-ach-miR283
和 novel-ach-miR362 是雌花特异表达的，Chr25 上没有预测到雄花特异表达的 miRNA。

闫明科，徐 强，刘春燕，张 琼，姚小洪.
基于 microRNA 深度测序的猕猴桃性别分化初探.
园艺学报，2015，42 (7)：1260–1272. 1269

表 5 Chr25 上差异表达的 miRNA 及其靶基因注释
Table 5 Differentially expressed miRNAs on Chr25 and their targets
miRNA
表达（雄花/雌花）
Expression mode
（male/female）
靶基因
Target gene
靶基因注释*
Annotation of target gene
novel-ach-miR60 下调
Down
Achn202541 多萜长醇–二磷酸寡糖蛋白糖基转移酶亚基；包含 IPR007676（核糖体结合蛋
白 I）和 IPR010326（Exocyst 复合体组分 Sec6）
Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit；Contains
IPR007676（Ribophorin I），IPR010326（Exocyst complex component Sec6）
novel-ach-miR283 下调
Down
Achn389831 核孔膜糖蛋白 210，包含 IPR008964（侵袭素/紧密黏附素的细胞粘附）
Nuclear pore membrane glycoprotein 210；Contains IPR008964（Invasin/intimin
cell-adhesion）
novel-ach-miR362 下调
Down
Achn204981 FAR1 蛋白相关序列 I；包含 IPR001878（锌指，CCHC 型），IPR004330（MULE
转座酶结构域）
Protein FAR1-related sequence 1；contains IPR001878（Zinc finger，CCHC-type），
IPR004330（FAR1 DNA binding domain），IPR007527（Zinc finger，SWIM-type），
IPR018289（MULE transposase domain）
Achn298021 Squamosa 启动子结合蛋白；包含 IPR004333（转录因子，SBP 盒）
Squamosa promoter-binding protein；Contains IPR004333（Transcription factor，
SBP-box）
* http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi.

2.6 miRNA 表达的实时荧光定量验证分析
为了验证经测序所得 miRNA 表达谱的可靠性，随机选取了 11 个显著差异表达的 miRNA，使
用 stem-loop 的逆转录引物进行逆转录，并采用 SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行 Real Time PCR 相对
定量检测。定量的结果如图 2 所示。大部分 miRNA 经 qRT-PCR 和深度测序定量后，其在猕猴桃雌、
雄花间的相对表达模式是一致的，这证明经深度测序得到的 miRNA 表达结果是可靠的。但也有几
个 miRNA 经 Real Time PCR 和测序得到了不同的相对表达模式，如 MIR172，MIR397 及
novel-ach-miR18；特别是 MIR397 甚至呈现出相反的相对表达趋势。不一致的表达模式可能是由于
两种技术在进行 miRNA 扩增时的效率差异所致，也可能是由于测序技术得到的 miRNA 表达量是综
合了该 miRNA 家族所有成员的表达量，而 stem-loop qPCR 技术只是特异性地检测了该 miRNA 家族
中的一种 miRNA 所致。

图 2 miRNA qRT-PCR 与高通量测序相对定量结果比较
Fig. 2 miRNA expression validation by qRT-PCR
Yan Ming-ke，Xu Qiang，Liu Chun-yan，Zhang Qiong，Yao Xiao-hong.
Preliminary investigation on sex differentiation of Actinidia chinensis by high-throughput microRNAs sequencing.
1270 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1260–1272.
3 讨论
在雌雄异株植物中，性染色体间的序列差异使得图位克隆技术难以应用，目前尚未有经过试验
验证的性别决定基因的报道（Zhang et al.，2014）。尽管已有研究表明，miRNA 在植物性别决定和
花发育过程中具有重要作用，但还没有 miRNA 参与雌雄异株植物性别决定的直接证据（Chuck et al.，
2007；Sun et al.，2010；Tuskan et al.，2012；Luo et al.，2013）。本研究试图利用第二代测序技术，
对雌雄异株植物猕猴桃的雌、雄花进行测序，以揭示可能参与猕猴桃性别决定的 miRNA 及蛋白质
基因。测序所得序列经质量控制、比对到猕猴桃基因组后，雌、雄花分别鉴定得到 39 和 37 个保守
miRNA 家族，以及 293 和 187 个新 miRNA 家族。miRNA 的保守性不仅体现在猕猴桃与其他物种之
间，在猕猴桃雌、雄株之间也非常明显（雌、雄花有 37 个共有的保守 miRNA 家族，但却只共有 80
个新 miRNA 家族），这与杨树雌、雄花的情况（Song et al.，2013）非常类似。相对于雄花，雌花中
鉴定得到更多的 miRNA，这可能是由于雌花中合成了更多的 miRNA 参与基因表达调控，但也可能
是由于在将 miRNA 比对到参考基因组时采用了较为严谨的参数（不允许错配），在只拥有猕猴桃雌
株基因组（只有 X 染色体）的情况下，很多因为雌、雄株之间单核苷酸多态性（SNP）的存在而导
致的匹配失败。这种结果也发生在同样只拥有雌株基因组的杨树中，而在同时拥有雌、雄、两性 3
种基因组序列的木瓜中表现并不明显（Aryal et al.，2014），这支持了雌、雄株基因组差异对比对结
果影响更大的推断。因此，对于猕猴桃雄株基因组或其 Y 染色体的测序将可能极大地方便和促进猕
猴桃性别分化的研究。
对预测得到的显著差异表达 miRNA 靶基因进行功能注释和分析发现，在 InterPro 中 IPR027417
和 IPR011009 的富集程度远高于其他义项。从 InterPro 注释可知，IPR027417 为包含核苷三磷酸水
解酶的磷酸环结构域（P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolase），该类蛋白主要通过水解
结合态核苷三磷酸的 beta-gamma 磷酸键释放能量，用于引导其他生物分子构象的改变。这意味着有
很多新蛋白或其他生物学分子合成和参与到了猕猴桃花的性别分化。IPR011009 是蛋白激酶类结构
域，而蛋白激酶在细胞信号转导和调控过程中具有重要作用。这则说明在猕猴桃花分化过程中伴随
着一些信息传递和生理生化过程。GO 注释中的生物学过程的富集分布也印证了这一结果。
对猕猴桃性染色体上的 miRNA 进行重点分析，共预测得到 3 个具有较高可信度的 miRNA。值
得注意的是，这 3 个 miRNA 都表现出雌花特异或上调表达。通常认为，植物 Y 染色体的进化伴随
着与 X 染色体的重组抑制及基因丢失（Ming et al.，2011），这可能是导致只有雌花特异或上调表达
的 miRNA（基因）的原因；不过，也可能是由于使用了只包含 X 染色体序列的参考基因组（因存
在 SNP 而导致 miRNA 与 Y 染色体对应序列匹配失败）、测序深度不够或使用了较为严格的 miRNA
筛选标准等原因所致。进一步对这 3 个 miRNA 预测得到的 4 个靶基因（Achn202541、Achn389831、
Achn204981 和 Achn298021）在 Swiss-Prot 中进行查询分析，发现其中有 3 个与基因表达与蛋白质
合成相关（Achn202541、Achn204981 和 Achn298021），而 Achn389831 为核孔蛋白组分，参与 mRNA
及蛋白质的转运。令人感兴趣的是 novel-ach-miR362 的靶基因 Achn298021，其编码的 Squamosa 启
动子结合蛋白为植物特有的转录因子，参与开花时间的调节、时期转换，更为重要的是，该基因可
能参与植物花药、花粉的发育，例如拟南芥突变株的花粉活力明显下降（Unte et al.，2003；Xing et
al.，2010）；通常认为 miRNA 对 mRNA 的表达是起负调控作用的（Bartel，2004），由于本研究中没
有在猕猴桃雄花中检测到 novel-ach-miR362 的表达，可能意味着其靶基因 Achn298021 在雄花中相
对较高的表达量即能更好地保证雄蕊发育。因此，novel-ach-miR362 及 Achn298021 基因的表达与其
闫明科，徐 强，刘春燕，张 琼，姚小洪.
基于 microRNA 深度测序的猕猴桃性别分化初探.
园艺学报，2015，42 (7)：1260–1272. 1271

功能验证可作为下一步猕猴桃花性别分化研究的一个方向。
总之，本研究中得到了一系列在猕猴桃雌、雄花中差异表达的 miRNA，但由于猕猴桃基因组数
据有限，及缺乏猕猴桃雌、雄花的转录组、蛋白组数据，对这些 miRNA 功能的鉴定和分析还非常
有限，今后在这些方面数据的积累将能更快速地推进猕猴桃性别分化机理的研究。

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