全 文 ：园艺学报，2015，42 (6)：1049–1056.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1094；http：//www. ahs. ac. cn 1049
收稿日期：2015–02–03；修回日期：2015–05–20
基金项目：国家自然科学基金项目（31200502）
* 同等贡献作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhongrenguo@cnbg.net）
薄壳山核桃 MADS-box 基因 CiMADS9 的克隆
与功能分析
张计育 1,*，莫正海 1,*，李永荣 2，王 刚 1，宣继萍 1，贾晓东 1，郭忠仁 1,**
（1 江苏省中国科学院植物研究所，南京 210014；2 南京绿宙薄壳山核桃科技有限公司，南京 210007）
摘 要：以薄壳山核桃（Carya illinoinensis）‘马罕’雄花为材料，利用获得的 MADS-box 基因保守
片段设计特异引物，通过 RACE 技术克隆 MADS-box 家族基因的 cDNA 序列，命名为 CiMADS9。该基因
长为 1 077 bp，开放阅读框（ORF）768 bp，编码 255 个氨基酸残基。生物信息学分析表明该基因具有典
型的 MADS-box 结构域和半保守的 K 区，是 MIKC 型 MADS-box 基因。聚类分析分析表明该基因属于
AGL15 亚家族。实时荧光定量 PCR 结果表明，CiMADS9 在生殖器官（雄花、雌花、幼果）中的表达量
高于营养器官（叶、枝条）中的，并且在雄花中的表达量最大。将目的基因通过农杆菌介导法转化拟南
芥，获得了转基因植株。与对照相比，转基因拟南芥中过量表达该基因使植株开花延期，基生叶增加。
关键词：薄壳山核桃；花器官发育；CiMADS9；基因表达；功能分析
中图分类号：S 664.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）06-1049-08

Cloning and Functional Analysis of MADS-box CiMADS9 Gene from Carya
illinoinensis
ZHANG Ji-yu1,*，MO Zheng-hai1,*，LI Yong-rong2，WANG Gang1，XUAN Ji-ping1，JIA Xiao-dong1，
and GUO Zhong-ren1,**
（1Institute of Botany，Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China；2Nanjing Green
Universe Pecan Science & Technology Co. Ltd.，Nanjing 210007，China）
Abstract：A MADS-box gene，named CiMADS9，was isolated from the male flowers of Carya
illinoinensis using the gene specific primers obtained according to a MADS conserved fragment sequence
by the method of RACE technology. The gene was 1 077 bp which has an ORF of 768 bp coding 255
amino acids．Multiple sequence comparison revealed that CiMADS9 was the typical MIKC-type
MADS-box genes with the MADS-box domain and K semi-conservative region. Phylogenetic analysis
indicated that CiMADS9 belonged to the AGL15 group of MADS-box gene family. qRT-PCR indicated that
the expression level of reproductive organs（male flower，female flower，and young fruit）were striking
higher than those of vegetative organs（leaf and branch），and the expression level of male flower was the
highest among all the organs. The overexpression vector of CiMADS9 was constructed and transferred into
Arabidopsis thaliana，and then resistant plants were obtained. RT-PCR analysis showed that CiMADS9

Zhang Ji-yu，Mo Zheng-hai，Li Yong-rong，Wang Gang，Xuan Ji-ping，Jia Xiao-dong，Guo Zhong-ren.
Cloning and functional analysis of MADS-box CiMADS9 gene from Carya illinoinensis.
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were expressed in all these lines. Compared with the wide type，transgenic Arabidopsis thaliana
overexpressing CiMADS9 gene delayed flowering time and increased the number of leaf.
Key words：Carya illinoinensis；flower organ development；CiMADS9；gene expression；function
analysis

MADS-box 转录因子是一个庞大的基因家族，已有研究表明，拟南芥（Arabidopsis thaliana）、
水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、黄瓜（Cucumis sativus）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）
和芜菁（Brassica rapa）中分别含有 107、75、75、43、57 和 167 个成员（Duan et al.，2014；Rameneni
et al.，2014；Wei et al.，2014）。MADS-box 转录因子在植物花发育过程中起着非常重要的作用，
典型的 ABCDE 模型中除了 AP2 基因外，其它基因均为 MADS-box 家族基因（Theißen，2001；Roux
et al.，2006）。
薄壳山核桃童期很长，一般 15 年左右，并且雄花发育早，雌花发育晚。另外，薄壳山核桃是雌
雄同株异花植物，存在雌先型、雄先型两种不同的类型，并且雄花主要着生在前一年生枝条中下部
的雄花序上，而雌花为总状花序，着生在结果枝的顶端。关于薄壳山核桃分子生物学方面的研究甚
少，MADS-box 基因在薄壳山核桃花发育方面的研究未见报道。
本研究中利用先前克隆的保守片段（莫正海 等，2013），通过 RACE 技术克隆了一个 MADS-box
基因，分析了该基因在薄壳山核桃 3 个品种不同器官的表达情况，并将该基因转入拟南芥对其功能
进行了分析。
1 材料与方法
1.1 植物材料与试验试剂
薄壳山核桃（Carya illinoinensis）品种‘马罕’、‘波尼’和‘绍兴’的雄花、雌花（雌花全部）、
枝条顶端叶片、花后 20 d 幼果、当年生嫩枝顶部于 2012 年 5—7 月采自南京市六合区山北村南京绿
宙薄壳山核桃科技有限公司薄壳山核桃基地，经液氮速冻后放在–70 ℃冰箱中保存备用。
rTaq DNA 聚合酶、Olig（dT）18、PrimeScript RTase 反转录酶、RNA 抑制剂、PCR 产物纯化
试剂盒、dNTP Mixture、PMD19-T 载体购于宝生物工程（大连）有限公司；BioTeke 通用植物总 RNA
提取试剂盒（离心柱型）购于南京普华生物技术有限公司。
1.2 总 RNA 提取与 cDNA 第一链的合成
RNA 提取参照 BioTeke 通用植物总 RNA 提取试剂盒（离心柱型）。取总 RNA 1 μg，cDNA 合
成采用宝生物工程有限公司（TaKaRa）的 PrimeScript RTase 反转录酶，以带接头的 Oligo dT 引物
AP：5-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3为反转录引物，参考说明书进行反
转录。
1.3 CiMADS9 cDNA 的扩增
根据本实验室（莫正海 等，2013）已经克隆得到的 MADS-box 基因保守片段的序列（编号 4，
含有 MADS 结构域），设计两条特异引物 GSP1（5′-ATGCAAATAGCAGGCAAGTCACATTCTC-3′）
和 GSP2（5′-CGCTGTTCTCTGTGATGCTGAGGTCG-3′）进行 3′RACE 巢式 PCR 扩增，与其搭配的
张计育，莫正海，李永荣，王 刚，宣继萍，贾晓东，郭忠仁.
薄壳山核桃 MADS-box 基因 CiMADS9 的克隆与功能分析.
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下游引物为接头引物，均为 AUAP（5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′）。
以薄壳山核桃‘马罕’雄花第一链 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 的反应体系为：稀释 10
倍后的全长 cDNA 1 μL，PCR 缓冲溶液 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL（2.5 mmol · L-1），MgCl 1.5 μL（25
mmol · L-1），上下游引物各 1 μL（10 μmol · L-1），rTaq 酶 0.125 μL（5 U · μL-1），用 dd H2O 补足至
25 μL。第一轮 PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min 热变性；94 ℃ 45 s，68 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共
35 个循环；72 ℃ 延伸 10 min。将第一轮 PCR 溶液稀释 10 倍，以此作为 cDNA 模板，进行第二轮
PCR，反应体系同上。反应条件为：94 ℃ 5 min 热变性；94 ℃ 45 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，
共 35 个循环；72 ℃ 延伸 10 min。
将第二轮 PCR 产物用胶回收试剂盒（Genscript）回收后，与 pMD19-T 载体（TaKaRa，Japan）
连接，然后转化大肠菌 DH5α，挑选阳性克隆，送上海美吉生物公司测序。
编码区（ORF）的扩增：根据 3′RACE 及保守片段克隆的序列，设计基因特异性引物，VvMADS9-F：
5′-ATGGGGAGAGGGAGGATAG-3′，VvMADS9-R：5′-CCATCAGCCAAACCTTCT-3′。PCR 反应条
件为 94 ℃ 5 min 热变性；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃延伸 10 min，
4 ℃保存，将 PCR 产物回收，克隆，测序。
1.4 CiMADS9 生物信息学分析
将测序得到序列在 NCBI 进行 Blastp 分析，用 Clustal W 进行多重序列比对，用 MEGA5.0 软件
将其氨基酸序列与拟南芥 MADS 各亚类中有代表性的转录因子进行聚类分析。
1.5 实时荧光定量 PCR 分析
分别提取薄壳山核桃 3 个品种（绍兴、波尼、马罕）不同器官（叶片、当年生枝条、雌花、雄
花、幼果）的总 RNA，cDNA 合成利用能消除 RNA 中残留 DNA 的试剂盒 PrimeScriopt RT reagent kit
with gDNA Eraser（TaKaRa，Japan），具体操作参照说明书进行。
内参参照山核桃 Actin 基因（周秦，2010），引物序列为 ACTIN-F：5′-GCTGAACGGGAA
ATTGTC-3′，ACTIN-R：5′-AGAGATGGCTGGAAGAGG-3′。根据 CiMADS9 基因序列设计表达引物
QTMADS9-F：5′-GGTACAACGAGTGTGTAGATTCTCC-3′，QTMADS9-R：5′-TCCTCTCCTTCACAG
ACAATAACCC-3′。实时荧光定量 PCR 参考张计育等（2011）的方法。数据分析采用 7300 system 软
件和 2-∆∆Ct 的方法，ΔΔCt =（Ct 靶基因–Ct 内参）处理组–（Ct 靶基因–Ct 内参）对照组（Livak & Schmittgen，2001）。
1.6 CiMADS9 植物表达载体的构建
根据 CiMADS9 基因序列，设计上游引物 MADS9-F：5′-CCGGTACCATGGGGAGAGGGAGGATA
G-3′（含有 KpnⅠ酶切位点）；下游引物为 MADS9-R：5′-CCGAGCTCAGGAATAACGAGATCAG-3′
（含有SacⅠ酶切位点）。按照Zhang等（2012）的方法将CiMADS9插入植物表达载体pCAMBIA1301。
将含有 CiMADS9 的 pCAMBIA130 重组质粒用冻融法转入农杆菌 EHA105 感受态细胞，菌液 PCR
鉴定阳性克隆。
1.7 转基因拟南芥的获得及其功能分析
拟南芥转化参考已有方法（Hopkins et al.，2009）进行。连续筛选 2 代后获得转基因拟南芥纯
合体。取 hyg 抗性植株和对照的叶片，提取总 RNA，反转录 cDNA。利用载体构建引物 MADS9-F、
MADS9-R 进行 RT-PCR 检测鉴定。
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将鉴定出的转基因拟南芥 T2 代种子和野生型种子同时播到 MS 培养基中，培养 10 d 后移栽到
基质中进行培养。培养条件为：相对湿度 80%，光照强度 80 ~ 200 μmol · m-2 · s-1，温光周期为 16 h
光照，22 ℃；8 h 黑暗，17 ℃。对野生型和转基因拟南芥阳性植株从播种到开花时间和基生叶位进
行观察，观察了 3 个株系，每个株系观察 3 株。
2 结果与分析
2.1 CiMADS9 基因的克隆
用特异引物 GSP2 和 AUAP 进行 3′RACE PCR 扩增，得到 1 条约 1 000 bp 的条带（图 1）。测序
结果显示该序列长度为 973 bp，包含 Poly A 结构。将 3′RACE 所得的序列与保守片段用 ContigExpress
软件进行拼接，得到的序列长度为 1 077 bp。
根据拼接序列，在最大开放阅读框两端设计引物进行 RT-PCR 扩增，得到 1 条约 750 bp 的特异
条带（图 2）。测序结果表明，该序列长度为 768 bp，与拼接的序列完全相同。因此，本研究克隆得
到的基因长度为 1 077 bp，最大开放阅读框为 768 bp，编码 255 个氨基酸。






2.2 CiMADS9 基因的序列分析
将推导的氨基酸序列在 NCBI 上进行 Blastp 比对，结果显示该序列含有保守的 MADS box 和
K-box 结构域。该序列与甜橙 AGL15 基因、川桑 AGL15 基因和鹰嘴豆 AGL15 基因的同源性分别为
73%、71%和 70%。初步推断该 cDNA 为 MADS-box 基因，定名为 CiMADS9（GenBank 登录号：
KP698118）。
多序列比对（图 3）结果显示，该基因具有植物典型的 MIKC 结构域，包括高度保守的
MADS-box 区（59 个氨基酸）、I 区（31 个氨基酸）、半保守的 K 区（80 个氨基酸）和 C 区（84 个
氨基酸）。
选取拟南芥 MADS-box 家族基因的 12 个主要进化枝中，有代表性的转录因子与 CiMADS9 进行
聚类分析（图 4），结果表明 CiMADS9 基因归为 AGL15 亚族。

图 1 3′RACE 扩增薄壳山核桃 MADS-box 基因
Fig. 1 MADS-box gene amplified
by 3′RACE PCR
图 2 CiMADS9 编码区全长 cDNA 的扩增
Fig. 2 CiMADS9 coding region full length cDNA
amplified by RT-PCR
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图 3 CiMADS9 氨基酸序列与其它其同源序列的比对
Fig. 3 Amino acid alignment of CiMADS9 and its closest homologues

图 4 薄壳山核桃 CiMADS9 蛋白系统发育树分析
Fig. 4 Phylogenic tree of CiMADS9 protein of C. illinoinensis

2.3 CiMADS9 的表达分析
利用实时荧光定量 PCR 技术分析 CiMADS9 在 3 个薄壳山核桃品种不同器官中的表达特性（图
5）。结果表明：CiMADS9 在 3 个品种的不同器官中均有表达，在雄花中的表达量最高。CiMADS9
在生殖器官（雄花、雌花、幼果）中的表达量高于营养器官（叶片、枝条）。
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图 6 转 CiMADS9 基因拟南芥 RT-PCR 检测
M：Marker；WT：野生型；T1 ~ T3：Hyg 抗性株系。
Fig. 6 RT-PCR analysis of the CiMADS9 in Arabidopsis
M：Marker；WT：Wide type；
T1–T3：Hyg-resistance lines.


图 5 CiMADS9 基因的 qRT-PCR 分析
Fig. 5 Expression pattern of CiMADS9 gene revealed by qRT-PCR analysis
2.4 CiMADS9 转基因拟南芥的获得
在转基因植株中扩增出一条约 750 bp 的
条带，与预期的 PCR 产物大小相符，而在对照
中没有扩增产物（图 6），证明 CiMADS9 基因
已成功导入拟南芥中并得到转录。
2.5 CiMADS9 的功能分析
对转基因拟南芥 T2 代和野生型的表型进
行分析，与野生型相比，转基因材料表现为晚
花（图 7），开花时间平均推迟了 8 d 以上（图
8，A），开花时基叶数较野生型平均增加 6 片
以上（图 8，B）。













图 7 转基因拟南芥表型观察
Fig. 7 Phenotype observation
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图 8 转基因拟南芥从播种到开花的时间（A）和总叶数（B）分析
WT：野生型株系；T1 ~ T3：转基因株系。
Fig. 8 The days from seeding to flowering（A）and the total number of leaves（B）of transgenic Arabidopsis
WT：Wide type；T1–T3：Transgenic lines.

3 讨论
本试验通过 RACE 技术从薄壳山核桃雄花中克隆了一个 MADS-box 基因，命名为 CiMADS9，
氨基酸序列比对和系统进化树分析结果表明，CiMADS9 基因属于 MADS-box 基因家族中的 AGL15
亚家族成员。AGL15 在在拟南芥营养器官有低水平表达（Fernandez et al.，2000）。AGL15 类基因主
要在生殖器官幼胚中表达（Heck et al.，1995；Perry et al.，1999；汪潇琳 等，2008），在矮牵牛中
其对雌雄配子及其合子的发育过程中都有着重要的作用（陈璟 等，2011）。CiMADS9 基因在薄壳山
核桃营养器官（叶片、枝条）中有少量表达（这与拟南芥中 AGL15 表达模式一致），主要在生殖器
官（雄花、雌花、幼果）中表达，说明该基因是花发育相关的基因。结合前人研究，说明该基因可
能与雌、雄配子及胚的发育有重要关系。CiMADS9 是在薄壳山核桃雄花中克隆到的，同时在 3 个品
种中的雄花中有较高表达，说明该基因可能对雄配子发育较为重要。
已有研究表明拟南芥 AtAGL15 是开花抑制因子，还能延缓花器官的衰老和花被的脱落（Fang &
Fernandez，2002；Adamczyk et al.，2007）。聚类分析表明薄壳山核桃 CiMADS9 基因属于 AGL15 亚
家族成员，本研究中将 CiMADS9 基因插入到双元表达载体 pCAMBIA1301 中的 35S 启动子下游，
构建成超表达载体，转化拟南芥，获得了转基因株系，而且 RT-PCR 结果呈阳性，对其表型进行分
析，与 WT 相比，转基因材料表现为晚花，开花时间推迟 8 d 以上，开花时基叶数较 WT 增加 6 片
以上，说明 CiMADS9 同样具有延迟开花的功能特性。

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