全 文 ：园艺学报，2016，43 (2)：329–336.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0879；http：//www. ahs. ac. cn 329
收稿日期：2015–11–23；修回日期：2016–02–02
基金项目：新疆维吾尔自治区科技计划项目（201130102-3）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yangsenxj@126.com）
库尔勒香梨果萼黑斑病病原鉴定及其 ITS、GPD
和 EF-1α序列分析
宋 博，朱晓锋，徐兵强，阿布都克尤木·卡德尔，杨 森*
（新疆农业科学院植物保护研究所，特色林果产业国家地方联合工程研究中心；农业部西北荒漠作物有害生物综合
治理重点实验室，乌鲁木齐 830091）
摘 要：采用常规组织分离法对库尔勒香梨果萼黑斑病病样进行病原菌分离，依据科赫氏法则进行
病原菌田间致病性测定，并利用分子生物学手段结合形态学鉴定确定病原菌及其分类学地位。田间致病
性测定结果表明链格孢属菌株为致病菌株，利用真菌通用引物进行致病菌株保守基因（ITS、GPD 和 EF-1α）
PCR 扩增及测序，获得序列 GenBank 数据库登录号为 KU145269、KU145271、KU145273。根据田间致
病性、形态学观察以及保守基因遗传进化分析结果确定库尔勒香梨果萼黑斑病病原为链格孢属链格孢
（Alternaria alternata）。
关键词：梨；黑斑病；鉴定；链格孢；保守基因
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）02-0329-08

Identification of Kolra Fragrant Pear Calyx-end Black Spot Pathogen and
Its Sequence Analysis of ITS，GPD and EF-1α
SONG Bo，ZHU Xiao-feng，XU Bing-qiang，Abudu Keyimu · Kader，and YANG Sen*
（Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，National Local Joint Engineering Research
Center of Special Forestry and Fruit Industry；Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northwestern
Oasis Ministry of Agriculture，Urumqi 830091，China）
Abstract：A study was conducted to definitude the disease pathogen and its taxonomic status. The
pathogen was isolated from disease tissue samples of Kolra Fragrant pear calyx-end black spot with
conventional tissue isolation. The pathogenicity test was conducted and confirmed by Koch’s postulates.
The pathogen was identified based on morphology and molecular identification. Determination of
pathogenic field confirmed that the Alternaria sp. as the pathogen，and meanwhile，the general primer of
fungal conserved genes（ITS，GPD and EF-1α）was taken advantage of for PCR amplification. After that，
it was cloned and sequenced，and got the GenBank accession number：KU145269，KU145271，KU145273.
Confirmed Alternaria alternata as the causative agent of Kolra Fragrant pear calyx-end black spot disease
using morphological analysis，pathogenicity test and phylogenetic analysis of conserved genes.
Key words：pear；black spot；identification；Alternaria alternata；conserved genes

Song Bo，Zhu Xiao-feng，Xu Bing-qiang，Abudu Keyimu · Kader，Yang Sen.
Identification of Kolra Fragrant pear calyx-end black spot pathogen and its sequence analysis of ITS，GPD and EF-1α.
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库尔勒香梨的果萼黑斑病俗称“黑头病”、“萼端黑斑病”，是香梨产区一直存在的果实病害，
2011 年新疆巴州沙依东园艺场部分果园突现大规模的黑斑病情，调查果园平均发病率为 14.7%，最
高者达到 34.8%，损失巨大。
有关新疆库尔勒香梨黑斑病果实上的链格孢属真菌种类的研究报道中，确定了存在链格孢
（Alternaria alternata）、细极链格孢（Alternaria tenuissima）两个种（刘新伟 等，2009）；唐文娟等
（2011）通过对其“黑头病”病原菌分离纯化和形态学初步鉴定，并通过致病性试验确定了暗色孢
科（Dematiaceae）枝孢属（Cladosporium）真菌为致病菌；马晶（2012）通过对香梨黑斑病病原 26S
rDNA 区序列分析结合形态学鉴定，认为链格孢为该病病原；贾晓辉等（2010）则认为分离得到的
枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）和链格孢（Alternaria alternata）为非致病菌，初步认为
香梨萼端黑斑病是一种由于果实品质下降和 N/Ca、K/Ca 失调及缺钙引起的生理性病害。
本研究中结合库尔勒香梨果萼黑斑病菌形态学和田间致病性鉴定，利用分子生物学手段对病原
菌进行鉴定，最终明确病原菌为链格孢，为防治工作提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 病原菌的分离和纯化
库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü‘Kolra Fragrant Pear’）果萼黑斑病样品采于新疆巴州沙依
东园艺场果园。病原分离采用方中达（1998）的常规组织分离方法，用 PDA 培养基（马铃薯 200 g，
葡萄糖 20 g，琼脂粉 17 g，补齐水至 1 000 mL）进行分离培养，长出的菌落挑取单孢纯化。纯培养
物于 28 ℃恒温条件下培养，定时观察记录，根据菌落形态及其繁殖体特征等初步分类，并将纯化的
菌株置于 4 ℃冰箱中保存备用。
1.2 病原菌的形态学鉴定
根据分离菌株的初步分类结果，选 5 株代表性链格孢属菌株（编号为 LI1、LI3、LI5、LI9、LI10）
分别接种在 PDA 和 PCA 培养基（马铃薯 20 g，胡萝卜 20 g，琼脂粉 17 g，补齐水至 1 000 mL）上，
前者置于 28 ℃下，用于培养形状、基质颜色等菌落形态观察；后者置于（26 ± 1）℃，12 h 光照（日
光灯 + 近紫外）/12 h 黑暗条件下培养 5 ~ 7 d，在光学显微镜下观察产孢结构和孢子形态特征，并
对孢子形状、大小及横/纵膈膜、喙有无及长短进行观察和记录。
1.3 分离菌株致病性测定
根据分离菌株的形态学鉴定结果，选择链格孢代表菌株 LI1、LI3、LI5 和镰刀菌属代表菌株 FU2
进行田间接种，代表菌株的田间致病性测定采用菌饼接种方法，分为针刺接种和无伤口接种，接种
前均用 75%的无水乙醇进行梨果表面消毒。接种处用浸水棉球保湿处理，果实套袋并标记，对照处
理接空白 PDA 培养基。接种后每 2 d 观察记录 1 次。
针刺接种：生长 5 ~ 7 d 的菌落平板，用直径 4 mm 的打孔器打好菌饼，用镊子夹菌饼正面紧贴
于梨果刺伤处。
无伤口接种：处理方法与针刺接种的唯一区别是：不刺伤梨果，其他操作完全相同。
田间接种试验在新疆巴州沙依东园艺场分场果园进行。上述每处理至少接种 27 个果实，均重
复 3 次。
宋 博，朱晓锋，徐兵强，阿布都克尤木 · 卡德尔，杨 森.
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1.4 病原菌的分子生物学鉴定
将分离得到的菌株在 PDA 平板上培养 10 d 左右，刮取收集菌丝，利用 CTAB 法提取菌株基因
组 DNA，置–20 ℃冰箱保存备用。
采用的真菌保守基因通用引物： ITS1 （ 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ ）和 ITS4
（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、GPD-1（5′-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3′）和 GPD-2
（5′-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3′）、EF-1F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和 EF-1R
（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）（White et al.，1990；Berbee et al.，1999；Carbone et al.，1999），
均由华大基因公司（北京）合成。PCR 反应均采用 25 L 体系：2× Es Taq MasterMix（北京康为世
纪生物科技有限公司）12.5L，菌株总 DNA 模板 1L，正反向引物各 1L（10 μmol · L-1），ddH2O
9.5L。ITS1/ITS4 反应条件为：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸
45 s，30 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min；GPD-1/GPD-2 反应条件为：96 ℃预变性 2 min，96 ℃变
性 1 min，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 45 s，28 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min；EF-1F/EF-1R 反
应条件为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 45 s，58 ℃退火 55 s，72 ℃延伸 40 s，31 个循环，最后
72 ℃延伸 10 min。
PCR 扩增产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，DNA 片段经凝胶回收试剂盒回收，回收产物进行
测序。测序结果与 GenBank 登录的链格孢属种及相近属的序列进行同源性比对分析，利用软件 Mega
6 中邻接法（neighbor-joining methods，NJ）构建聚类分析树状图，分析该菌与其他菌株的亲缘关系，
以确定其分类地位。
2 结果与分析
2.1 病害田间症状与病原菌分离
库尔勒香梨果萼黑斑病常在果实萼端发病，初始症状表现为水浸状暗褐色凹陷斑块，进而变色
发黑，病部果肉呈褐腐，果肉内部病健交界明显，后期病斑可扩展至整个果实，果实霉变，干缩，
果肉成絮状，味发苦，致果实完全丧失商品性（图 1，A）。
对典型病样组织进行分离纯化，共得到 186 个菌株，针对这些分离菌株的菌落形态、产孢结构
及分生孢子特征进行初步鉴定，其中链格孢属菌株 174 株，占分离菌株总数的 93.5%；镰刀菌属 4
株，占 2.1%；青霉 3 株，占 1.6%；根霉 2 株，占 1.0%；其他 3 株，占 1.6%。
2.2 病原菌的形态学鉴定
链格孢属真菌形态特征明显易区别，但不易鉴定区分到种。为了进一步准确鉴定，选择 5 株代
表性菌株，根据《中国真菌志 · 链格孢属》（张天宇 等，2003）记载的鉴定方法，选择营养相对缺
乏的 PCA 培养基，PCA 上菌落特征为气生菌丝较发达，菌落圆形，边缘整齐，初期菌落白色至灰
白色，后期菌落颜色逐渐变深至深灰色，褐色黑色，边缘灰白色（图 1，B1），菌落背面深褐色，边
缘深灰色（图 1，B2）。显微镜下观察产孢表型，表现为孢子链多，具有特征性的短分枝孢子链，孢
子链一般 1 ~ 5 个孢子，其分生孢子形倒梨形，倒棒形，近椭圆形，孢身大小 19.0 ~ 34.1 μm × 9.2 ~
16.0 μm，平均 24.9 ~ 13.1 μm，短喙柱状或锥状，4.5 ~ 3.5 μm，主横隔膜 2 ~ 5 个，纵（斜）隔膜
0 ~ 3 个，分生孢子分隔处略缢缩或不缢缩（图 1）。根据这些生物学形态特征，鉴定这 5 个菌株均
为链格孢（Alternaria alternata）。
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图 1 库尔勒香梨果萼黑斑病症状和病原菌形态学观察
A：库尔勒香梨果萼黑斑病田间症状；B：病原菌菌落的形态学观察；C：病原菌产孢结构和分生孢子特征。
Fig. 1 The field symptoms and the morphological characteristics of Kolra Fragrant pear calyx-end black spot
A：The field symptoms of Kolra fragrant pear calyx-end black spot；B：Morphological characteristics of fungal colonies；
C：The sporogenous structure and spore morphology of pathogen.
2.3 病原菌的致病性检测
链格孢和镰刀菌代表菌株在无伤口情况下接种病原菌，几乎不发病。在刺伤条件下链格孢接种
3 d 后即发病，形成 3 ~ 5 mm 的黑色圆形病斑。病斑扩展很快；而镰刀菌属真菌接种 5 d 后发病。
两者发病症状与田间自然发病症状比对见图 2，两种真菌接种后梨果发病症状不同之处在于镰刀菌
接种后病斑普遍呈十分规则的轮纹圆形，且发病部位一般不凹陷，而链格孢接种发病后病斑呈无规
则形状，发病部位凹陷。对发病梨果进行病原菌再分离，均获得与接种菌株相同的菌株。田间回接
试验结果证明链格孢属菌株为果萼黑斑病病原菌。链格孢各菌株在致病力上没有表现出差异，针刺
接种链格孢发病率均保持在 100%（表 1）。

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图 2 库尔勒香梨接种 10 d 后的发病情况
Fig. 2 The symptoms of Kolra Fragrant pear 10 days after inoculation fruit


表 1 分离菌株接种发病情况统计
Table 1 Morbidity statistics of inoculation by isolation strains %
菌株 Strain
处理 Treatment
对照 Control LI1 LI3 LI5 FU2
无伤口接种
No wound inoculation
0 a 0 a 1.10 ± 1.90 a 0 a 0 a
针刺接种
Stab inoculation
3.30 ± 3.11 c 100.00 ± 0.00 a 100.00 ± 0.00 a 100.00 ± 0.00 a 82.60 ± 6.14 b
注：数据为 3 次重复测定的平均值，同一行内相同字母表示差异不显著（P﹤0.05，LSD 检验）。
Note：The data are means of three replicates. The different letters in the same column are significantly at P﹤0.05 by LSD.

2.4 菌株保守基因序列扩增及分析
以供试菌株 LI1 的 DNA 为模板进行保守基因序列扩增及测序，运用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4、
GPD1 和 GPD2、EF-1F 和 EF-1R 进行 PCR 反应分别获得 537、586 和 246 bp 的片段，测序结果提
交至 GenBank 获得登录号为 KU145269、KU145271、KU145273。
将样品 ITS 序列与在 GenBank 数据库中记录的 Alternaria 属 17 种利用软件 Mega 6 中邻接法
（neighbour-joining methods，NJ）构建聚类分析树状图（图 3），可将链格属分为 4 个聚类组，样
品序列（KU145269）与 A. alternata、A. brassicae、A. gossypina、A. metachromatica、A. tenuissima
的同源性最高，聚为 1 个分支。将样品 GPD 序列（KU145271）与链格孢属 16 个种，利用 Mega 6
中邻接法构建聚类分析树状图（图 4），可将链格孢属分为 4 个聚类组，样品序列与 A. alternata、
A. citrimacularis、A. tenuissima 的同源性最高，聚为 1 个分支。将样品 EF-1α序列（KU145273）与
链格孢属 15 个种，利用软件 Mega 6 中邻接法构建聚类分析树状图（图 5），可分为两个聚类组，
样品序列与 A. citrimacularis、A. tomato、A. tenuissima、A. alternata 的同源性最高，聚为 1 个分支。
综合上述分析，样品菌株只与 A. alternata、A. tenuissima 在 ITS、GPD 和 EF-1α 均能分为 1 个
聚类分支，表明与这两个种同源性很高。结合形态学鉴定中发现该菌的分生孢子分隔处略缢缩或不
缢缩，且具有特征性的短分生孢子链，所以进一步鉴定该病原菌为链格孢属链格孢（A. alternata）。

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图 3 样品菌株 LI1 的 ITS 序列（KU145269）与链格孢属 17 种真菌的 ITS 序列聚类分析树状图
Fig. 3 The clustering analysis tree of the ITS sequences（KU145269）of sample strains LI1 and
17 kinds of Alternaria ITS sequences

















图 4 样品菌株 LI1 的 GPD 序列（KU145271）与链格孢属 16 种真菌的 GPD 序列聚类分析树状图
Fig. 4 The clustering analysis tree of the GPD sequences（KU145271）of sample strains LI1 and
16 kinds of Alternaria GPD sequences
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图 5 样品菌株 LI1 的 EF-1α序列（KU145273）与链格孢属 15 种真菌的 EF-1α序列聚类分析树状图
Fig. 5 The clustering analysis tree of the EF-1α sequences（KU145273）of sample strains LI1 and
15 kinds of Alternaria EF-1α sequences
3 讨论
有关梨黑斑病的研究报道较为全面，张志铭等（2003）报道河北鸭梨黑斑病的病原菌为链格孢
菌（A. alternata），王宏等（2006）报道梨黑斑病病原菌为半知菌亚门链格孢菌（A. kikuchiana Tanaka），
周求根等（2013）的研究表明贡梨果实黑斑病病原链格孢菌为 A. alternata。作者研究病样特征皆为
库尔勒香梨萼端发生，其病原和部分报道的梨黑斑病病原一致，病原皆为是 A. alternata。在病原属
种鉴定上，王洪凯等（2001）利用 5.8S rDNA 及其两侧的 ITS1 区和 ITS2 区序列分析，及利用 PAPD
来分析 Alternaria 小孢子种的亲缘关系，结果表明形态差别明显的链格孢种彼此以及与小孢子种分
开，而 9 个小孢子种则不能据此加以区分。本试验中对病原 3 种保守基因 ITS、GPD 和 EF-1α 的序
列进行扩增，通过软件 Mega 6 进行遗传进化分析，确定了病原的分类地位，结合严格的形态学鉴
定，确保了病原属种的准确性。作者还通过田间回接试验研究发现，针刺创伤后，链格孢接种发病
率达到了 100%，而对照无伤口接种发病率仅为 1.1%，说明该菌在自然条件下，不能通过皮孔等自
然孔口进行侵染致病。病原的侵染方式、途径以及侵染时间还有待近一步的研究。

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