全 文 ：园艺学报，2016，43 (1)：38–46.
Acta Horticulturae Sinica
38 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0582；http：//www. ahs. ac. cn
脐橙晚熟突变体及其野生型果实柠檬酸代谢基
因表达分析
付莉莉，吴巨勋，伊华林*
（华中农业大学园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）
摘 要：‘奉节晚橙’（Citrus sinensis L. Osbeck）是来源于‘奉节 72-1’脐橙的晚熟芽变。采用 qRT-PCR
方法测定了‘奉节 72-1’与其晚熟突变体果实 4 个发育时期柠檬酸代谢相关基因的表达。结果表明，糖
酵解途径中‘奉节 72-1’脐橙基因的表达高于‘奉节晚橙’；但是柠檬酸合成相关基因 CsCS4、CsPEPC1、
CsPEPC2、CsPEPC4、CsME1、CsME4 的表达水平低于‘奉节晚橙’。果实发育后期，‘奉节 72-1’脐橙
中 CsACO1、CsGAD4、CsGS1 等柠檬酸降解相关基因表达水平逐渐升高，且表达量高于‘奉节晚橙’。两
者间柠檬酸含量的差异是代谢途径中多种基因共同作用的结果。通过相关性分析，推断 CsME1、CsME4
可能是影响柠檬酸含量差异的关键基因。
关键词：脐橙；晚熟芽变；柠檬酸；实时定量 PCR；糖酵解；TCA 循环
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）01-0038-09

Expression Analysis of Citrate Metabolic Related Genes in Late-ripening
Mutant of Navel Orange and Its Wild Type
FU Li-li，WU Ju-xun，and YI Hua-lin*
（College of Horticulture and Forestry Science，Huazhong Agricultural University，the Education Ministry Key Laboratory
of Horticultural Plant Biology，Wuhan 430070，China）
Abstract：‘Fengwan’orange（Citrus sinensis L. Osbeck）is the spontaneous late-ripening mutant of
‘Fengjie 72-1’. The expression of citrate metabolic related genes during fruit four developmental stages
of Fengwan and its wild type Fengjie 72-1 orange was analyzed by qRT-PCR and the results revealed that
key genes of glycolysis metabolism in Fengjie 72-1 expressed higher than that in Fengwan. However，
citrate biosynthesis genes，such as CsCS4，CsPEPC1，CsPEPC2，CsPEPC4，CsME1 and CsME4 expressed
lower than that in Fengwan. Moreover，transcript levels of genes，such as CsACO1，CsGAD4 and CsGS1
involved in citrate degradation pathways were increased gradually during fruit late development，and the
expression levels in Fengjie 72-1 were higer than that in Fengwan orange. Genes involved in synthesis and
degradation metabolic pathways coordinately contribute to the different content of citric acid. Correlation
analysis revealed that CsME1 and CsME4 may be key genes affecting the different content of citric acid
between Fengwan orange and its wild type.

收稿日期：2015–11–02；修回日期：2016–01–06
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-27）；国家科技支撑计划课题（2013BAD021302）；教育部创新团队
发展计划项目（IRT13065）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yihualin@mail.hzau.edu.cn）
付莉莉，吴巨勋，伊华林.
脐橙晚熟突变体及其野生型果实柠檬酸代谢基因表达分析.
园艺学报，2016，43 (1)：38–46. 39
Key words：navel orange；late-ripening bud mutant；citric acid；quantitative real-time PCR；glycolysis
metabolism；TCA cycle

柑橘果实中的有机酸以柠檬酸为主（Sadka et al.，2000；Shimada et al.，2006），其含量取决于
早期的合成及后期的降解（Terol et al.，2010）。Haffker 和 Wallace（1959）提出果实柠檬酸的合成
途径，认为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化下，固定 CO2 形成
草酰乙酸（OAA），后者在柠檬酸合成酶（CS）作用下结合乙酰辅酶 A 生成柠檬酸。柠檬酸合成途
径还涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、苹果酸合酶（ME）等关键酶，如磷酸烯醇式丙酮酸
羧激酶（PEPCK）与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）功能相反，催化草酰乙酸（OAA）向磷酸
烯醇式丙酮酸（PEP）的转化（Sweetman et al.，2009）；苹果酸合酶（ME）通过参与苹果酸的合成
影响柠檬酸代谢（Bogin & Wallace，1966）。研究表明，柑橘果实发育后期促进蔗糖向有机酸代谢的
转变，导致糖酵解及三羧酸循环途径不断增强（Lin et al.，2015）。糖酵解作为糖分解的重要途径，
其代谢产生的丙酮酸通过氧化脱羧后形成乙酰辅酶 A 进而参与柠檬酸的合成（Schwender &
Ohlrogge，2002）；己糖激酶（HXK）、磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PKP）为糖酵解途径的
关键酶（Sheen et al.，1999；Weber，2004）。柠檬酸在线粒体中合成后被运输到细胞质，并通过 H+
泵主动运输到液泡中储存起来。当积累过高时，液泡中的柠檬酸通过主动或被动运输至细胞质，在
Fe 离子作用下由胞质顺乌头酸酶（ACO）催化为异柠檬酸（Sadka et al.，2000），之后经异柠檬酸
脱氢酶（IDH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）降解为谷氨酸。谷氨酸一方面在谷氨酰胺合成酶（GS）作
用下生成谷氨酰胺，一方面在谷氨酸脱羧酶（GAD）作用下进入 GABA 途径（Cercos et al.，2006）。
目前相关研究主要是针对不同柑橘种类及品种、不同环境（龚荣高 等，2006；Chen et al.，2013）
及柑橘果实贮藏期柠檬酸含量及相关基因的表达（熊晶晶，2007；Sun et al.，2013），但是对熟期
突变品种柠檬酸代谢方面的研究报道较少。研究发现‘奉节 72-1’及其晚熟芽变‘奉节晚橙’果实
柠檬酸差异极大，主要表现为‘奉节 72-1’中柠檬酸含量自花后 150 d 逐渐下降，而‘奉节晚橙’
柠檬酸含量下降较晚，并且柠檬酸含量明显高于‘奉节 72-1’，170 ~ 210 d 差异达极显著（Wu et al.，
2014b）。为了探究晚熟脐橙突变体柠檬酸差异产生的原因，比较分析了‘奉节晚橙’及其野生型‘奉
节 72-1’在脐橙果实发育过程中糖酵解、三羧酸循环及柠檬酸降解途径中相关基因的表达，为脐橙
晚熟芽变柠檬酸生理代谢研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试材及其取样
‘奉节晚橙’（Citrus sinensis L. Osbeck）是来源于‘奉节 72-1’脐橙的晚熟芽变。‘奉节 72-1’
及其晚熟芽变材料均于 2011 年采自重庆奉节县同一果园，采样时间为花后 150、170、190、210 和
240 d。样品采自树势一致的果树，每个品种各选 3 株作为生物学重复。每株树每次随机采取 12 个
具有代表性的果实，将果肉与果皮分离，分别切碎，液氮速冻。所有样品均保存于–80 ℃冰箱。
1.2 果肉RNA的提取及实时定量PCR
分别取‘奉节 72-1’及‘奉节晚橙’花后 150、170、190 及 210 d的果肉，参照（刘永忠，2006）
的方法提取RNA。采用TaKaRa PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Syntnesis Kit进行RNA反转录，严格

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按照试剂盒的使用说明进行操作。采用Primer Express 3.0 软件（Applied Biosystems，Foster City，
CA，USA）设计基因特异性引物，Real-time PCR反应采用ABI公司的Power SYBR Green PCR Master
Mix在ViiATM 7 Real-time PCR System上进行。反应体系（10 μL）：0.5 μL稀释的cDNA，0.5 μL上游
引物，0.5 μL下游引物，Mix为 5 μL，灭菌双蒸水 3.5 μL。每个样品 4 个技术重复，热循环反应程序
如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；40 个循环，95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s。柑橘内参基
因GAPDH（Wu et al.，2014a）及柠檬酸代谢相关基因Real-time PCR的引物序列见表 1。定量结果采
用SAS软件（SAS System Release 8.1）进行差异显著性分析。柠檬酸含量与相关基因的关联性采用R
语言包WGCNA进行分析。

表 1 柠檬酸代谢相关基因及其 Real-time PCR 引物
Table 1 Citrate metabolic related genes and primer sequences for quantitative Real-time PCR


基因名
Gene
abbreviation
拟南芥同源基因
A. thaliana
ortholog locus
甜橙数据库 ID
Genome code of
Citrus sinensis
正向引物 5′至 3′
Forward primer 5′ to 3′
反向引物 5′至 3′
Reverse primer 5′ to 3′
CsHXK1 AT4G29130 Cs4g15520 TCTTTGTCCTGATTATCTTCTCTCATG TTGGAGGGCAAAGGCATTTA
CsHXK3 AT1G47840 Cs3g26050 GGCAGTGACGGAGCTTCTG CAAGAGAGCAGCACCAATGC
CsPFK3 AT4G26270 Cs4g13070 CGAGTTCGTGTTCCGATTTTC TCGCTGTGAGTTTCCATTGTTG
CsPFK5 AT2G22480 Cs1g20200 CAAAGCCTTCTAAATTATCCCAAATAG AGCCTAGCCTACAAGGAGAAAGC
CsPFK6 AT4G32840 Cs4g18980 CGCTTGTCGCTTCGGTTAA CATCCCTTCCTCCCTTCACTCT
CsENO1 AT1G74030 Cs7g26180 TCCCACACTTCCTCACCAACT TGACTGAAGAGCGTGTTTGGA
CsENO2 AT2G36530 Cs6g15540 AGTTCCGTGCCCCTGTTG TAAACCTCCATTGCTCAAATCCA
CsPKP1 AT3G22960 Cs9g07880 GTTTCAGCACTTCCCCAATAGC GACTACCTGCTGTTTGCTTCGA
CsPKP2 AT5G52920 Cs9g18710 AGCCTTCTAGCTTCGCTTCGA GATTTTAGTGCTTTTGCGAACAAGT
CsPKP3 AT1G32440 Cs7g22750 GCTGTCTAGCAACTGTATATTTTTCCA AGCTTTATCAGTTCACCAATCCTTTC
CsCS2 AT3G58750 orange1.1t01588 GCGCCAAGCGTAGAATCATC TGAGCCTGCCTTGATTTGACT
CsCS4 AT2G44350 Cs7g01170 TAGAATTGGAAAGGGTGGGTGTA ACACAAACTCTCCATCCATCACTAAT
CsPEPC1 AT1G53310 Cs8g09580 GCCGATGAGCTGGTGAAACT TCTGCAAGCCAGCAGCAATA
CsPEPC2 AT2G42600 Cs2g15520 ACTCGTGAGTCGTCTAAAATCTTCTG TCCCCCGCCTCCTTCTT
CsPEPC4 AT1G68750 Cs7g12630 GATTGAGACAGGATGATGATAACCA GTGTTCCTCATACCAGCAGCTATTC
CsPEPCK AT4G37870 Cs1g20920 TTACAAGGAGACACTGCTGAAGCT TGTCCTTGCCAATCTTGTAGTTTG
CsME1 AT2G19900 Cs4g15270 TTTGGTGTGTTATGGTGGCTTT GTGGTCCAACACCTTCATTTGA
CsME4 AT1G79750 Cs1g15720 TCTCTTCTTTCTCTTTCTCCGATTTTC TCTTCCCTCTTTCCCTTTTTCTC
CsACO1 AT4G35830 Cs1g26040 TGATTCCGCAAGAACCAACTG ACGTCGGCTGAATCTGCTAAA
CsACO2 AT4G26970 Cs4g10280 TGTTTCGTCAACTTCTTCCAATAGG GCCAAAAGAAAAATGAAGTGAAAAT
CsACO3 AT2G05710 Cs2g21430 CGTTTTGTGTGAATGCGTGAT AGCTGCTGAGGTGGAGGTTGT
CscICDH AT1G65930 orange1.1t04187 ACCTCCGCTCTGACCCTATTATC CCATTTTCTTCTTTGTTCAGTTTCG
CsIDH3 AT5G14590 Cs2g27720 AGGCCGTCTCTTTCTTTCCAA TAATACGCCGTGACTCTGCTTTC
CsGDH1 AT5G18170 Cs5g26650 CCAGCGGCATGGAAGTG CAGGACAAGATAATGACCAAAGCA
CsGDH2 AT5G07440 Cs5g07820 AGAAGAGCAATAAAAGCCTGAATGAT CGCATTCATGGACAAGTAAGTCA
CsGAD4 AT2G02010 orange1.1t01622 GCCGCTTCAACATTGTGTCA TTCATCGTGGCGTTTGTTGT
CsGAD5 AT3G17760 Cs5g16440 GGAAAGACTCATCTCACACATCGA GGGCAGTTTTCGTGGATACAC
CsGS1 AT5G37600 Cs6g17430 TTCACGAGTTCACGACAGAATTG GGGCAGAGATTGAAACAAGACAA
CsGS2 AT5G35630 Cs9g05680 TGGTTTCAGGTTTACGCATGTT GCGATAGCATTGATGAACTGGTAT
GAPDH AT3G04120 Cs5g06870 TGTGTTTCTATGTAGAGGGTCTGAGTTT TCTAAGCACAACCCTGCATGAG
2 结果与分析
2.1 糖酵解途径相关基因的表达
从图 1 中可以看到，糖酵解途径中多数基因在‘奉节 72-1’及其晚熟芽变之间的表达模式基本
一致，如 CsPFK3、CsPFK5、CsENO1、CsENO2 及 CsPKP1 等，其中 CsPFK5、CsENO2、CsPKP1
基因在花后 150 ~ 190 d 表达水平逐渐下降，之后迅速增加。CsPKP2 基因在花后 150 ~ 170 d 两个材
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料中表达基本一致，但花后 190 ~ 210 d‘奉节 72-1’远高于晚熟芽变。己糖激酶（HXK）是糖酵解
途径的关键酶并调节着糖酵解的入口。分析发现，芽变材料中 CsHXK1、CsHXK3 表达模式及转录
水平基本一致，而在‘奉节 72-1’中两者差异较大，表现为 CsHXK3 在果实发育 4 个时期表达十分
稳定，而 CsHXK1 基因则呈逐渐上升的趋势。分析基因转录水平发现，多数基因在‘奉节 72-1’中
的表达水平明显高于芽变，花后 210 d 尤为突出，如 CsPFK3、CsENO1 表达量约为芽变的 4 倍。此
外还发现，同一家族成员中基因表达模式不尽相同，如 CsPFK6 与 CsPFK3、CsPFK5 存在明显差异。






























图 1 脐橙果实发育过程中糖酵解途径相关基因表达分析
误差线表示标准差（n = 3），* 表示显著差异（P < 0.05）。下同。
Fig. 1 Expression analysis of glycolysis metabolism related genes during orange fruit development
Bars represent the standard error（n = 3），* represent statistically significant differences（P < 0.05）. The same below.

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2.2 柠檬酸合成关键基因的表达
从图 2 中发现，柠檬酸合成相关基因在晚熟芽变中表达模式基本一致，呈现上升—下降—上升
的趋势，而‘奉节 72-1’中多数基因（CsPEPCK 除外）在花后 150 ~ 190 d 表达量逐渐下降，花后
190 ~ 210 d 表达量明显升高。CsPEPCK 作为与 CsPEPC 功能相反的酶，其在‘奉节 72-1’中表达
趋势与 CsPEPC1、CsPEPC2、CsPEPC4 截然相反，但是在芽变中表达趋势与 CsPEPC1、CsPEPC2、
CsPEPC4 相对一致。通过比较相关基因在两者间的表达水平，发现‘奉节 72-1’中仅柠檬酸合酶基
因 CsCS2 在脐橙果实发育 3 个时期表达量高于芽变，而 CsCS4、CsME1、CsME4、CsPEPC1、CsPEPC2
等基因在芽变中表达水平在花后 170 ~ 210 d 均高于‘奉节 72-1’，花后 170 ~ 190 d 差异最为明显，
如 CsPEPC 的 3 个成员，花后 170 ~ 190 d 芽变中表达量明显高于‘奉节 72-1’，晚熟芽变 CsPEPC1
的表达量约为‘奉节 72-1’的 2 倍，CsPEPC2 为 3 倍。结合柠檬酸含量发现，CsME1、CsME4 与
柠檬酸变化趋势较吻合，在‘奉节 72-1’与晚熟芽变中表达量分别于花后 150 d 和 170 d 达到最高值。


































图 2 脐橙果实发育过程柠檬酸合成途径关键基因表达分析
Fig. 2 Expression analysis of citric acid biosynthesis genes during orange fruit development
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2.3 柠檬酸降解相关基因的表达分析
如图 3 所示，柠檬酸降解相关基因在二者中表达模式差异较大，其中 CsACO1、CsGAD4、CsGS1
表达较一致，而 CsACO2、CsACO3、CscICDH、CsIDH3、CsGDH1 等基因差异很大。顺乌头酸酶















































图 3 脐橙果实发育过程柠檬酸降解关键基因表达分析
Fig. 3 Expression analysis of citric acid degradation genes during orange fruit development

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（ACO）催化柠檬酸为异柠檬酸，是柠檬酸降解的第一步。果实发育过程中 3 个 CsACO 基因的表
达模式各异。CsACO2 基因在芽变中仅花后 170 d 表达水平高于‘奉节 72-1’，其余 3 个时期没有显
著差异，而 CsACO1、CsACO3 基因在花后 150 、190 及 210 d，‘奉节 72-1’中表达水平均高于芽
变。柠檬酸在顺乌头酸酶（ACO）作用下降解为异柠檬酸，之后异柠檬酸依次经异柠檬酸脱氢酶
（IDH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）降解为谷氨酸。
如图 3 所示，花后 170 d，CscICDH、CsIDH3 两基因在芽变中表达水平高于‘奉节 72-1’，其
余 3 个时期表达水平均低于‘奉节 72-1’；而 CsGDH1、CsGDH2 两基因在二者间表达模式不同。
随着果实发育 GABA 途径中 CsGAD4 基因在两者间变化趋势一致且表达水平逐渐升高，但是
CsGAD5 在两者间差异较大且在‘奉节 72-1’中表达量逐渐下降。另一方面，在 GS 降解途径中，
CsGS1、CsGS2 两基因在‘奉节 72-1’果实发育 4 个时期表达量逐渐升高；在芽变中，CsGS1 基因
表达水平呈上升趋势，而 CsGS2 基因从花后 170 d 开始表达水平趋于稳定。
2.4 柠檬酸含量与代谢相关基因的相关性
将柠檬酸含量与代谢相关基因进行相关性
分析发现，CsME1、CsME4 与柠檬酸含量存在
较高的正相关性（R = 0.75，P = 0.03）；（R =
0.78，P = 0.02），而CsHXK1、CsENO2、CsACO1、
CsGAD4、CsGS1 等基因与柠檬酸含量相关性
不显著（图 4）。





























图 4 柠檬酸与相关基因的关联性分析
红色表示正相关，绿色表示负相关，数值分别表示
相关系数 R 和 P 值（括号）。
Fig. 4 Correlation analysis of citric acid and related genes
Red indicate positive correlation，green indicate negative correlation.
The numbers in each cell indicate correlation coefficient
R and P value，respectively.
3 讨论
柑橘果实柠檬酸代谢是一个错综复杂的过
程，其含量的高低是内在遗传特性、外在自然
环境和栽培措施共同作用的结果（陈发兴 等，
2005）。由于‘奉节晚橙’及其野生型‘奉节
72-1’均采自同一果园，排除了环境差异对脐
橙果实品质的影响，所以两者的差异源于其内
在的遗传特性。
柠檬酸含量是决定柑橘果实成熟的重要指
标，‘奉节晚橙’作为‘奉节 72-1’的晚熟芽
变表现为成熟的整体延迟，导致其柠檬酸含量
下降较晚并且高于‘奉节 72-1’。本研究中发
现，花后 150 ~ 170 d，CsCS4、CsME1、CsME4、
CsPEPC1 等基因在‘奉节晚橙’中上调表达，
而在‘奉节 72-1’中均下调表达，这与该时期
柠檬酸含量的变化趋势一致，说明 CsCS4、
CsME1、CsME4、CsPEPC1 等是影响柠檬酸合
成的关键基因。当果实发育至花后 190 ~ 210 d，
‘奉节 72-1’及‘奉节晚橙’中柠檬酸合成相关
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基因 CsME4、CsPEPC1、CsPEPC2 上调表达，但其降解基因 CsACO1、CsGAD4、CsGS1 在该时期表达
量升高，并且明显高于花后 150 ~ 190 d，导致果实发育后期柠檬酸含量逐渐降低，揭示了 CsACO1、
CsGAD4、CsGS1 在柠檬酸降解过程中发挥重要作用。
陈明（2013）比较了普通椪柑及其早熟芽变，发现柠檬酸含量差异明显，导致柠檬酸含量的差
异与CS、PEPC等合成关键基因无直接关系，而与降解途径中一系列基因（CitAco3、CitIDH1、CitIDH3、
CitGAD4、CitGAD5、CitGS2）高丰度表达相关。而本研究中发现‘奉节晚橙’柠檬酸含量高于‘奉
节 72-1’与CsCS4、CsME1、CsME4、CsPEPC1 等基因高表达及CsACO1、CsGAD4、CsGS1 降解基
因表达水平低相关，相关性分析进一步说明CsME1、CsME4 可能是影响柠檬酸含量差异的关键基因。
有研究表明，柑橘不同品种的柠檬酸含量与CS、PEPC、NAD-IDH、ACO和PEPC/NAP-IDH比值相
关，并且其差异可能是上述代谢酶一种或几种综合作用的结果（罗安才 等，2003）。与前人研究的
差异可能是由于柑橘不同品种所导致的。此外，本研究中还发现同一家族不同成员的表达存在差异，
说明其具有不同的表达调控模式。
糖酵解与柠檬酸合成存在密切关系。首先，糖酵解产生的丙酮酸通过氧化脱羧形成的乙酰CoA
是连接三羧酸循环的中心环节（王金胜，2003）。其次，PEPCK、PEPC通过调节PEP与OAA之间
的转化、苹果酸合酶（ME）通过参与苹果酸的合成来共同影响柠檬酸的代谢（Coursol et al.，2000）。
结合本研究，发现糖酵解途径多数基因在‘奉节 72-1’中表达量显著高于‘奉节晚橙’，而柠檬酸
合成基因CsCs4、CsME1、CsME4、CsPEPC1 等在‘奉节 72-1’中表达量显著低于‘奉节晚橙’。
说明糖酵解途径的增强促进了乙酰CoA的产生，但是从另一方面却降低了草酰乙酸及苹果酸的含量，
从而使得‘奉节 72-1’中柠檬酸的合成减少。此外，研究表明，PEPCK在果实成熟过程中参与糖异
生作用，间接地将苹果酸转化为糖（Bahrami et al.，2001；Walker et al.，2011）。Sweetman等 （2009）
同样发现，PEPCK催化OAA为PEP在有机酸向糖的转化方面发挥作用，并且在分流苹果酸进入有机
酸代谢也起着非常重要的作用。本试验中CsPEPCK基因在‘奉节晚橙’与‘奉节 72-1’果实发育 4
个时期差异均较显著，但是其关键作用还需进一步探讨。
分析发现，花后 190 ~ 210 d，糖酵解途径关键基因CsHXK1、CsPFK3、CsPFK5 等均上调表达，
揭示了果实发育后期糖酵解代谢不断增强，这与Lin等（2015）的结果一致。而这同时又影响了柠檬
酸的合成，导致果实成熟后期柠檬酸含量不断减少。结合以上分析，说明糖酵解途径参与果实成熟
的多种代谢途径并且与柠檬酸合成相关基因存在复杂的调控机制。
本研究中以特定的柑橘晚熟芽变材料展开，由于柑橘不同品种及相关基因存在差异，因此柑橘
果实柠檬酸生理代谢及关键基因的作用还需进一步探讨和验证。

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