全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（1）：64–72 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–09–02；修回日期：2011–12–02
基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目（IRT0976）；农业部公益性行业科研专项（201203076）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：sunxianchao@163.com；Tel：023-68250517）
温州蜜柑萎缩病毒小外壳蛋白基因克隆与原核
表达及其抗体制备
武改霞 1，李婷婷 1，孙现超 1,2,*，青 玲 1
（1 西南大学植物保护学院，植物病害生物学重庆市高校级重点实验室，重庆 400716；2 国家柑桔工程技术研究中心，
中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712）
摘 要：用 RT-PCR 方法，从采自重庆奉节的‘宫本’柑橘的 2 个样品中扩增出温州蜜柑萎缩病毒
（Satsuma dwarf virus，SDV）SDV RNA2 的 3′末端，长度为 975 bp，与报道的 SDV S-58 3′末端序列同源
性分别为 98.7%和 98.4%。根据获得的序列设计引物，以含有 SDV FJ 3′末端序列的质粒为模板，PCR 扩
增获得大小为 654 bp 的 SDV-FJ 小外壳蛋白（Small coat protein，CPS）基因产物。构建了 CPS 与 GST
融合表达载体 PGEX-CPS，在 37 ℃、1.0 mmol · L-1 IPTG 条件下诱导表达，SDS-PAGE 电泳分析表明成
功表达出分子量约为 42 kD 的 GST-CP 融合蛋白。以表达的融合蛋白为抗原免疫家兔，制备的抗血清的效
价为 1/12 800。用获得的抗体进行组织印迹分析表明，SDV 在柑橘叶柄基部韧皮部维管束区域含量最高。
关键词：柑橘；温州蜜柑萎缩病毒；小外壳蛋白；原核表达；抗体
中图分类号：S 666；S 436.629 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）01-0064-09

Cloning of the Small Coat Protein Gene，Prokaryotic Expression and
Antiserum Preparation of Satsuma dwarf virus
WU Gai-xia1，LI Ting-ting1，SUN Xian-chao1,2,*，and QING Ling1
（1Chongqing Key Laboratory of Plant Disease Biology，College of Plant Protection，Southwest University，Chongqing
400716，China；2 National Center of Citrus Engineering and Technology Research，Citrus Research Institute，Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712，China）
Abstract：The 3′ terminal of SDV（Satsuma dwarf virus）RNA2 was amplified from two plants of
Miyamoto Satsuma mandarin from Fengjie in Chongqing by RT-PCR. The amplified fragments are 975 bp
in size and share 98.7% and 98.4% nucleotide identities with that of SDV S-58，respectively. The small
coat protein（CPS）gene with a size 654 bp of SDV-FJ was amplified from the plasmid containing the SDV
RNA2 3′ terminal by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector of PGEX-6p-1 to construct a
recombinant vector named PGEX-CPS. The recombinant plasmid was transformed into E. coil BL21 to
express the GST-CPS protein in the optimized condition. GST-CPS protein was purified to immunize
rabbit for preparing anti-CPS antibody. The results showed that the 42 kD GST-CPS protein was
successfully expressed in E. coil BL21 induced with 0.3 mmol · L-1 IPTG at 28 ℃. Anti-CPS antibody
with the title of 1/12 800 was obtained from the rabbit immunized with the purified GST-CPS protein. The


1 期 武改霞等：温州蜜柑萎缩病毒小外壳蛋白基因克隆与原核表达及其抗体制备 65

result of tissue bolt with the anti-CPS antibody showed that the base of petiole contain more SDV than
other tested tissues of infected Miyamoto Satsuma mandarin.
Key words：citrus；Satsuma dwarf virus；small coat protein；prokaryotic expression；antiserum

温州蜜柑萎缩病是 1937 年田中彰一最早在日本静冈县温州蜜柑上发现的一种萎缩性病害（周
常勇 等，1990），此后在土耳其和韩国亦有报道（Zhou，1991），20 世纪 80 年代以后传入中国（Cui
et al.，1991；周常勇 等，1993）。该病由温州蜜柑萎缩病毒（Satsuma dwarf virus，SDV）引起。
SDV 为双分体病毒，直径约 28 nm，包含两条正单链 RNA 分子：RNA1 和 RNA2。Iwanami 等（1999）
确定了日本株系 S-58 的基因组 RNA1 和 RNA2 全长分别为 6 795 bp 和 5 345 bp，每条 RNA 分别含
有一个开放阅读框（open reading frame，ORF）、3′端非编码区（3′Non-coding region，3′NCR）、5′
端非编码区（5′NCR）和 poly（A）尾巴。RNA1 编码蛋白包括了基因组复制所需的依赖 RNA 的 RNA
聚合酶、蛋白酶等。RNA2 编码的蛋白切割后产生运动蛋白和大、小外壳蛋白。经序列比对后建议
将 SDV 定为豇豆花叶病毒科（Comoviridae），豇豆花叶病毒属（Comovirus）和线虫传多面体病毒
属（Nepovirus）近缘的新属中的成员（Iwanami et al.，1999）。国际病毒分类委员会在第八次报告
中又将 SDV 定为新增的温州蜜柑萎缩病毒属（Sadwavirus）代表种（洪健 等，2005）。该病毒寄
主范围相当广，多数寄主植物处于潜症带毒状态，几乎可以危害所有的柑橘属植物和枳属、金柑属、
西非枳属、印度枳属等近缘属植物（Zhou et al.，1993）。病毒主要通过嫁接、汁液和土壤传播，并
通过苗木运输进行远距离传播，此外，有报道该病毒可以通过美丽菜豆种子和中国珊瑚树（Viburnum
odoratissimum）进行传播（Zhou，1991）。
国内外的研究人员对该病害的鉴定、分离、病毒生物学特性及引种后的处理等方面做了大量的
研究，对该病害的控制起到了重要的作用（周常勇 等，1991，1994a，1994b，1996；陈健民 等，
1999；高艳玲 等，2005）。在中国，周常勇等（1993，1996）用生物学及血清学鉴定发现 80 年代
引入重庆奉节温州蜜柑宫本品种带有 SDV，但中国发现的株系与日本报道的株系 S-58 是否相同，
经过长期的环境和寄主适应，其基因序列是否发生了变异，变异情况如何，国内尚未有报道。并且
病毒的分子生物学特性、致病分子机制及其与寄主的互作机制尚不清楚。为了明确这些问题，作者
在对重庆奉节的宫本品种上及阳性对照上 SDV 3′末端克隆分析的基础上，克隆了重庆奉节的宫本品
种 SDV（SDV-FJ）的小外壳蛋白（Small coat protein，CPS），构建原核表达载体，表达并纯化了
外壳蛋白，制备特异性抗血清，并用组织印迹法分析了 SDV 在茎、叶柄和叶片内的分布情况。为进
一步研究病毒致病机制及其与寄主互作机制初步奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
温州蜜柑萎缩病毒保存于中国农业科学院柑橘研究所，将采自重庆奉节的宫本柑橘品种上的 2
个叶片样品标记为 FJ1 和 FJ2；来自日本阳性对照宫川品种上采的 2 个叶片样品标记为 P1 和 P2；
健康柑橘 2 个叶片样品对照标记为 CK1 和 CK2。
大肠杆菌 DH5α、BL21 及表达载体 pGEX-6p-1 由本实验室保存；PCR 产物纯化试剂盒、pGEM-T
Vector 购自 Promega 公司；Taq DNA 聚合酶、逆转录酶、dNTPs、氨苄青霉素、DNA marker、IPTG、
X-gal、Trizol 等购自大连宝生物公司（TaKaRa）。引物根据 NCBI 已发表基因序列设计，由英潍捷
基（上海）贸易有限公司合成。
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1.2 温州蜜柑感病叶片总 RNA 提取
2010 年 10 月，在西南大学植物病毒病害研究室内采用 2010 年 6 月购自成都天泰生物技术有限
公司的 Trizol 试剂盒提取感染 SDV 柑橘叶片总 RNA，具体操作参照说明书。
1.3 温州蜜柑萎缩病毒含 CPS 的 RNA2 3′末端克隆
以提取到的总 RNA 为模板进行反转录。反转录引物为 P2：5′-GGCCATCAGACTTTCACTG-3′。
具体操作步骤为：在反应体系中加入 0.5 μL RNA 酶抑制剂、1 μL 引物 P2、0.5 μL DEPC 处理水、2
μL 总 RNA，快速混匀离心 1 次，72 ℃温育 2 min，冰浴 2 min，快速离心，依次加入 2 μL 5 × 第 1
链缓冲液、2 μL DTT（20 mmol · L-1）、1 μL dNTP 混合物、1 μL 反转录酶，混匀并快速离心 1 次，
42 ℃温育 1 h，冰上终止反应，立即分装放置–20 ℃保存备用。以反转录产物为模板，以 P1：
5′-TCTGGACTGACCACCACG-3′为上游引物，P2 为下游引物进行 PCR 扩增，反应条件为：94 ℃
变性 4 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环，72 ℃ 10 min。PCR 产物经纯化试
剂盒纯化后与 pGEM-T Vector 连接，热激法转化到 DH5α 大肠杆菌中，在 LB/Amp/IPTG/X-gal 平板
上筛选克隆，挑取白色克隆经液体培养后，进行菌液 PCR 鉴定，阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易
有限公司测序，测序结果进行 DNAstar 序列分析。
1.4 CPS 基因原核表达载体的构建
以获得的含有 SDV FJ 3′末端的质粒为模板，用引物 CPS1：5′-GGAATTCTCTGGACTGACCACC
ACG-3′（划线部分为引入的 EcoRⅠ酶切位点）和 CPS2：5′-CGCCTCGAGTTAAGCAGCTGTACGC
AG-3′（划线部分为引入的 XhoⅠ酶切位点）进行 PCR 扩增，条件为 94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，53 ℃
30 s，72 ℃ 45 s，共 30 个循环，最后一轮循环后在 72 ℃延伸 10 min。取 PCR 产物 50 μL，1%琼脂
糖凝胶电泳回收目的片段，经 EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后，与同样酶切处理的 pGEX-6p-1 在 4 ℃条件
下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌 DH5α，在含有 100 mg · L-1 Ampicilin 的 LB 平板培养基选择
培养后，挑取菌落，并提取质粒酶切鉴定，选取 3 个阳性克隆送到北京英骏生物技术公司测序验
证。
1.5 GST-CPS 融合蛋白的诱导条件优化及表达产物的 SDS-PAGE 分析
将含有 pEGX-CPS 质粒的大肠杆菌 BL21 单克隆接种在 3 mL 的液体 LB 培养基中（含有 100
mg · L-1 Ampicilin），37 ℃振荡培养过夜后，按 1%接种量接种到新的 LB 液体培养基（含有 100
mg · L-1 Ampicilin）中，分别在 30 ℃和 37 ℃振荡培养至 OD600 达到 0.6 ~ 0.8 时，分别以终浓度为
0.1、0.5 和 1.0 mmol · L-1 的 IPTG 诱导 3 ~ 4 h，收集菌体。用适量的细胞裂解缓冲液悬浮菌体，超
声波破碎，12 000 r · min-1 离心 10 min，上清液移入另一离心管中，用同样体积的细胞裂解缓冲液悬
浮沉淀。分别取等量的上清和沉淀悬浮液进行 SDS-PAGE 分析，确定合适的 IPTG 诱导终浓度。以
含有空载体的大肠杆菌 BL21 为阴性对照。
1.6 GST-CP 融合蛋白的定量和分离
用优化的 1.0 mmol · L-1 IPTG 诱导终浓度条件扩大培养诱导，收集菌体，按照上述同样方法处
理得到上清和沉淀悬浮液，弃上清，以 PBS 反复洗涤沉淀后，适量的 PBS 溶解，取少量进行倍比
稀释，与标准含量的蛋白共同进行 SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色后，用全自动凝胶成像系统软件分
析 GST-CPS 融合蛋白含量。将沉淀溶解液进行大块胶的 8% SDS-PAGE，电泳完毕用去离子水漂洗
凝胶，再用预冷 250 mmol · L-1 的 KCl 复染至出现目的蛋白条带，切下目的条带，在蛋白透析袋中
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图 1 柑橘 4 个样品中 SDV 3′末端 RT-PCR
M：Marker；CK1、CK2：健康叶片（阴性对照）；FJ1、FJ2：宫
本，重庆；P1、P2：宫川，日本（阳性对照）。
Fig. 1 RT-PCR product of 4 citrus samples
M：Marker；CK1，CK2：Health leaves（Negative control）；
FJ1，FJ2：Miyamoto，Chongqing；
P1，P2：Miyagawa Wase，
Japan（Positive control）.
将蛋白与胶通过电泳透析分离，获得的目的蛋白加入适量 PBS 后，加入等体积的福氏不完全佐剂，
乳化完全后直接用于制备抗血清。
1.7 抗血清的制备、效价测定及田间样品的检测
2010 年 12 月在中国科学院遗传发育研究所动物中心实验室内，以肌肉和皮下多点注射的方式
免疫大白兔，共免疫 6 次，每次免疫剂量约为 0.5 mg 融合蛋白，每隔 7 d 注射 1 次，第 5 次注射 7 d
后静脉少量采血测定效价，再加强免疫 1 次，7 d 后动脉一次性采血，制备抗血清，用 ELISA 法测
定抗血清效价。
2011 年 8 月采集重庆北碚地区类似温州蜜柑萎缩病毒病症状的船形或匙形叶片样品 22 个，以
P1、P2 为阳性对照，脱毒苗健康叶片为阴性对照，应用 RT-PCR（方法步骤同 1.3）及间接 ELISA
方法在本实验室内进行 SDV 检测。制备的抗血清 l︰2 000 稀释后作为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗
兔 IgG（购自 Sigma 公司）l︰6 000 稀释后作为二抗。每孔 100 µL 显色液（5 mL 磷酸盐—柠檬酸缓
冲液中加入 BCIP 16.5 µL，NBT 33 µL），室温避光显色 10 min 后在酶标仪 405 nm 下测 OD 值，记
录结果（每个样品重复 3 次，取平均值）。P–N ≥ 0.5，且 P／N > 2，为阳性（P，样品平均吸光
值；N，阴性对照平均吸光值）。
1.8 组织印迹分析
用单刃刀片横切感染 SDV 的柑橘叶、叶柄和茎，将切口平压印在硝酸纤维素膜（NCM）上。
采用健康柑橘植株的相同材料作为阴性对照。将点好样的 NCM 至于空气中 15 ~ 30 min 晾干，清洗
液 TBST（TBS + 0.05% Tween 20）清洗 3 min，移入封闭液（TBS + 0.05% Tween 20，3%牛血清白
蛋白），水平摇床轻微振荡 60 min，TBST 清洗 3 次，每次 3 ~ 5 min。倾去清洗液，加入 4 000 倍封
闭液稀释的 SDV 抗体，水平摇床轻微振荡 60 min。洗涤同上。倾去洗液，加入 6 000 倍封闭液稀释
的碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG（购自 Sigma 公司），振荡 60 min。洗涤同上。加入底物（5 mL 磷
酸盐－柠檬酸缓冲液中加入 BCIP 16.5 µL，NBT 33 µL），暗处反应 2 ~ 5 min 后蒸馏水漂洗 3 次，晾
干后分析。
2 结果与分析
2.1 样品中 SDV RNA2 3′末端的克隆分析
以总 RNA 为模板，用引物 P1、P2 进行
RT-PCR，扩增产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳
检测，结果表明 4 个样品均获得了大小约 1 000
bp 的特异性条带（图 1）。对扩增产物测序表明，
其长度均为 975 bp。用 DNAStar 软件对来自 4
个样品的 SDV RNA2的 3′末端序列与GenBank
登录的日本报道的 SDV S-58 株系序列
（AB009959）进行对比分析。结果表明，P1
和 P2 与 SDV S-58 株系 3′末端序列的同源性均
为 99.7%，FJ1 和 FJ2 与 S-58 3′末端序列的同
源性分别为 98.7%和 98.4%。P1 和 P2 的序列
完全一致，FJ1 与 FJ2 序列有 3 个碱基的差异。
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图 2 SDV CPS PCR 扩增
Fig. 2 Amplification of SDV CPS by PCR
M：DL2000 marker.
图 3 重组质粒pEGX-CPS（a）及其酶切产物（b）
Fig. 3 Identification of pEGX-CPS by enzyme digesting
M：Marker V；a：pEGX-CPS；
b：pEGX-CPS digested.
扩增产物包含 SDV 的完整 CPS，大小为 654 bp，预测编码 218 个氨基酸。氨基酸序列对比显示，
FJ1 和 FJ2 与 S-58 有 99.5%的同源性，在第 54 残基处有 1 个氨基酸发生突变，由 A 突变为 V。P1
和 P2 与 S-58 有 100%的同源性；FJ1 和 FJ2 在氨基酸水平没有差异。表明 4 个样品中 SDV 序列在
CPS 处的碱基突变多为无意义突变。
2.2 SDV FJ CPS 的克隆及 CPS 原核表达载体的构建
以获得的含有 SDV FJ 3′末端片段的质粒为模板，采用引物 P1 和 P2 进行扩增，获得 654 bp 的
CPS 基因扩增产物（图 2）。
回收扩增产物并克隆至原核表达载体 PGEX-6p-1，经 EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切鉴定及测序，确认
CPS 基因正确插入谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体 pEGX-6p-1 的 GST 下游（图 3）。


2.3 GST-CPS 融合蛋白的诱导条件优化及表达产物的 SDS-PAGE 分析
分别在 30 ℃和 37 ℃培养条件下，含有 pEGX-CPS 融合基因的大肠杆菌 BL21 分别以终浓度
1.0、0.5 和 0.1 mmol · L-1 的 IPTG 诱导表达后，12% SDS-PAGE 分析（图 4）表明：融合蛋白得到了
特异表达，在凝胶上有一条明显的分子量为 49.9 kD 的 GST-CPS 融合蛋白，同预测的 CP 分子量 23.9


图 4 诱导温度和诱导剂浓度对 GST-CPS 原核表达的影响
Fig. 4 The influence of temperature and IPTG concentration on prokaryotic expression of GST-CPS

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kD 与 GST 分子量 26 kD 之和相等；并且在 37 ℃培养条件下终浓度为 1.0 mmol · L-1 的 IPTG 诱导的
表达量明显高于 0.5 和 0.1 mmol · L-1 时诱导的表达量，也高于 30 ℃培养条件下不同浓度 IPTG 诱导
的表达量。而含有空载体的大肠杆菌BL21在终浓度为 1.0 mmol · L-1的 IPTG诱导条件下没有 49.9 kD
的蛋白出现。
2.4 抗血清的制备、效价测定及检测应用
将分离的融合蛋白用等体积的福氏不完全佐剂进行乳化后作为抗原免疫家兔，第 5 次注射 7 d
后，ELISA 测定血清效价为 1/6 400，加强免疫 1 次，7 d 后采血，ELISA 测定血清效价，结果表明
抗血清效价达到 1/12 800。
以稀释 2 000 倍的抗血清作为二抗，用间接 ELISA 对重庆北碚区采集的样品进行检测。阳性对
照测定的 OD 值计算结果均明显呈阳性，P/N 值均在 3.8 以上。但在 22 个样品中均未检测到 SDV
存在，P/N 值均小于 0.6。检测结果与 RT-PCR 检测结果一致。表明制备的抗血清可以用于 SDV 的
检测鉴定。
2.5 组织印迹分析
用获得的 SDV 抗体进行组织印迹分析，结果表明：SDV 侵染的柑橘叶片主脉、叶柄及茎内都
不同程度地变色，表明有病毒存在，而对照则没有明显颜色变化。
同时，在感病组织中，叶柄基部韧皮部维管束区域颜色最深，表明该部位病毒含量相对最高。
感病柑橘茎中韧皮部出现浅紫色，而其它部位颜色不明显，提示在茎中，韧皮部 SDV 含量高于茎内
其它组织。叶片中叶脉韧皮部维管束出现浅紫色，而叶肉组织则没有明显颜色变化，提示叶片的叶
脉部维管束病毒含量相对比叶肉高。

图 5 SDV 在柑橘组织中的印迹分析
A ~ D：SDV 侵染样品（A：叶柄中部；B：叶柄基部；C：茎；D：叶片）；
E、F：健康对照（E：叶柄基部；F：叶片）。
Fig. 5 Analysis of the SDV in citrus tissue by tissue blot
A–D：Samples infected by SDV（A：Middle of petiole；B：Root of petiole；C：Stem；D：Lamina）；
E，F：Healthy control（E：Root of petiole；F：Lamina）.

70 园 艺 学 报 39 卷
3 讨论
本试验中对保存在中国农业科学院柑橘研究所重庆奉节宫本品种上 2 个样品及阳性对照的 2 个
样品进行了 3′末端克隆分析，发现重庆奉节宫本品种上 2 个样品中的 SDV 3′末端与日本的 S-58 相
比有 13 ~ 16 个碱基发生了突变，其中有 10 个碱基的突变发生在其编码的 CPS 区域，而该区域内
CPS 在氨基酸水平只有 1 个发生了突变。来自日本阳性对照的 2 个样品与 S-58 比较有 3 个碱基的突
变，其中有 2 个突变发生在 CPS 区域，但该区域内氨基酸水平没有发生任何变化。表明阳性对照和
S-58 应该是同一病毒株系；FJ1 和 FJ2 也可能与 S-58 是同一株系，但存在 1 个氨基酸的差异，该差
异是引进时就存在，还是在我国环境下引起的变异尚不清楚。
酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法因其快速、灵敏、适合批量
样品检测的优点在植物病毒检测方面长期被广泛应用。制备特异高效价的抗血清是这一方法的前提。
国内外研究者曾用分离纯化的病毒作为抗原免疫动物来获得抗血清。但由于多数果树组织中含有大
量的多糖多酚类物质，使病毒的分离提纯步骤繁琐，耗时长，难度大，并且获得的血清中往往含有
植物组织成分，在检测应用时容易出现假阳性。随着分子生物学技术的发展，利用大肠杆菌表达外
源蛋白来获得抗原已成为一项成熟的实验技术。该技术与前者相比，具有周期短、成本低和抗血清
特异性强的优点。近年来，多种园艺作物病毒的特异性高效价抗血清均是采用原核表达的方法制备
抗原，并且成功的应用于病毒的检测，如：苹果褪绿叶斑病毒（蔡瑜 等，2005）、柑橘衰退病毒（尹
跃艳 等， 2008）、李属坏死环斑病毒（李明福 等，2009）、樱桃病毒 A（郭颂 等，2010）、葡萄卷
叶伴随 3 型病毒和葡萄 A 病毒（王建辉 等，2011）、南瓜上多种病毒（青玲 等，2010）、辣椒脉斑
驳病毒（吴育鹏 等，2010）和花卉上的番茄斑萎病毒（方琦 等，2011）等。本试验中利用该技术
成功地表达了 SDV FJ 的 GST-CPS 融合蛋白，并制备了专化性很强的抗血清。田间检测试验中，虽
然田间采集的船形叶中未检测到 SDV，但在阳性对照中明显检测到 SDV 存在，并且检测结果与
RT-PCR 检测结果一致。研究发现柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）嫁接接种到柑桔上同
样出现船形叶（周常勇 等，1995）。所以，本试验中采集的样品可能是 CTV 所致，而制备的抗血
清只特异的与 SDV 反应，所以不呈现阳性。
组织印迹法（tissue blot）是在酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的
基础上发展起来的植物病毒检测技术，该技术不仅保持了 ELISA 对病毒检测的灵敏度高，特异性强
的特点，而且大大地简化了操作程序，还可以对病毒在植物组织内的分布进行定位（Lin et al.，1990；
李燕宏 等，2006；董晓辉 等，2009）。研究表明不同病毒在植物不同组织内的分布有较大差异（王
乔春，1996）。周常勇等（1994a，1994b）的研究表明 SDV 在嫩组织中冷凉温度下繁殖，且幼嫩叶
和嫩枝皮中的病毒含量比其它部位明显，但并未分析同一叶片和茎内病毒含量相对高的部位。本研
究通过组织免疫印迹检测发现在同一叶片上，叶柄基部的病毒含量相对比叶片的其它部位高，并且
主要分布在叶柄的韧皮部维管束组织。试验结果同时表明组织印迹法可以用于 SDV 的检测，并且组
织印迹分析结果为利用分子生物学技术检测提供了最佳的取样部位，达到更加准确检测 SDV 的目
的。

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