全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2014 41 11 2342 2352 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–07–18；修回日期：2014–11–03
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201003067，2010-2014）；重庆市自然科学基金项目（cstc2012jjA80025）；重庆市两江学者
项目（2013）
高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立
苏华楠 1,2,3，王雪峰 2，黄爱军 1,2，李中安 2，唐科志 2，周常勇 1,2,*
（1西南大学植物保护学院，重庆 400715；2中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712；3 赣南师范学院，国家脐橙
工程技术研究中心，江西赣州 341000）
摘 要：针对柑橘老熟组织中富含多糖、多酚、色素和其它次生代谢产物的特点，以柑橘老叶老皮
为试材，在传统 CTAB 提取法的基础上通过添加增效剂并优化配方，建立了一种快速、简便的提取植物
老熟组织及其内部病原总核酸的 CTAB-Triton 提取法。新的提取液对细胞的裂解能力更强，且解决了传统
CTAB 溶液因低温析出而致 DNA 得率损失的弊端。比较了该法和微量葡聚糖柱纯化法制备模板时韧皮部
杆菌的检出率，并用该法制备模板，分析了韧皮部杆菌在柚子叶片中的分布情况，及对其它几种柑橘病
原菌进行 PCR/RT-PCR 检测。结果表明，CTAB-Triton 方法能有效提取柑橘老熟叶片的 DNA，所得 DNA
质量高，产量比商品化试剂盒大，提高了韧皮部杆菌的检出率，且可用于柑橘其他病原真菌、细菌，以
及 DNA 或 RNA 病毒病害的 PCR/RT-PCR 检测，也可用于定量 PCR 检测和病原种群多态性分析。
关键词：柑橘；韧皮部杆菌；柑橘黄龙病；DNA 提取；柑橘病害检测
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）11-2342-11

High Quality Total Nucleic Acid Extraction Method from Citrus for Disease
Detection
SU Hua-nan1,2,3，WANG Xue-feng2，HUANG Ai-jun1,2，LI Zhong-an2，TANG Ke-zhi2，and ZHOU
Chang-yong1,2,*
（1College of Plant Protection，Southwest University，Chongqing 400715，China；2Citrus Research Institute，Chinese
Academy of Agricultural Sciences/Southwest University，Chongqing 400712，China；3National Navel Orange Engineering
and Technology Research Center，Gannan Normal University，Ganzhou，Jiangxi 341000，China）
Abstract：The presence of high concentrations of polysaccharides，polyphenols，pigment，and other
secondary metabolites in mature citrus leaves is big challenging to obtain high quality DNA/RNA for
citrus disease research. In this study，a reliable，fast and enhanced total nucleic acid extraction protocol
（CTAB-Triton），modified from the cetyltrimethylammonium bromide（CTAB）method，was established
for DNA extraction of mature citrus tissues. The novel extraction buffer was superior to traditional buffer
in cell lysis，and avoided low yield due to CTAB-DNA co-precipitation when temperature was lower than
15 ℃. Meanwhile，good-quality DNA and higher DNA yield were obtained through this extraction
method，comparing with the commercial DNA isolation kits. The infection rate of‘Candidatus Liberibacter
asiaticus’（CLas）extracted by CTAB-Triton and Sephadex G-50 extraction method was compared，

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhoucy@cric.cn）
11 期 苏华楠等：高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立 2343
CTAB-Triton method significantly improved the detection rate. SYBR Green-based quantitative PCR
（qPCR）assay was performed to compare the concentration of CLas within different parts of pummelo
leaves. This new method was also suitable for the extraction of citrus fungi，bacteria，and DNA/RNA viral
diseases for the pathogen detection and genetic diversity analysis.
Key words：citrus；‘Candidatus Liberibacter asiaticus’；huanglongbing；DNA extraction；citrus
disease detection

中国是柑橘起源地之一，已有 3 000 多年的栽培历史（周开隆和叶萌民，2010），而中国柑橘产
业的发展一直受到一些危险性病害的制约，如柑橘黄龙病（Citrus huanglongbing，HLB）和柑橘溃
疡病（Citrus canker）等细菌性病害，柑橘褐斑病（Citrus brown spot）和柑橘黑斑病（Citrus black spot）
等真菌性病害，以及由柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf
virus，CTLV）、温州蜜柑萎缩病毒（Satsuma dwarf virus，SDV）、柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow
vein clearing virus，CYVCV）等 RNA 病毒和柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf virus，CCDV）
等 DNA 病毒引起的病毒性病害。
柑橘黄龙病是对柑橘产业威胁最大的危险性病害（Da Graca，1991；Bové，2006；范国成 等，
2009）。HLB 病原菌能侵染几乎所有柑橘类植物，典型症状主要表现为叶片斑驳型黄化和“红鼻子”
果。由于病原至今尚不能人工培养，因此科赫氏证病亦未完成。目前，国际上普遍认为该病的病原
为韧皮部杆菌属的 3 个暂定种：亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’，CLas）、非洲种（‘Ca. L.
africanus’，CLaf）和美洲种（‘Ca. L. americanus’，CLam）（Jagoueix et al.，1994；Texeira et al.，2005），
中国的主要为亚洲种（董鹏 等，2011；易龙 等，2012；谭锦 等，2013；黄永辉 等，2014）。目前
检测该病菌主要采用 PCR 等分子检测技术，模板制备的好坏直接影响检测的准确性。
对多种柑橘病害同时进行分子诊断时，不同类型的病原所需要的核酸模板不同。针对柑橘细菌
性、真菌性和 DNA 病毒性病害，往往需要先提取总 DNA 再进行 PCR 检测，而对于 RNA 病毒或类
病毒病害，则需提取总 RNA 后进行检测，因此通常需要制备相应的 DNA 模板或 RNA 模板。而商
品化的试剂盒基本都只是仅针对 DNA 或 RNA 单一提取的试剂盒，尚未有总核酸提取试剂盒。用于
柑橘病害检测的总核酸提取主要为微量过葡聚糖柱纯化的方法（周常勇 等，2001），但在试验过程
中发现，该法针对黄龙病的检测易出现假阴性的情况。本研究旨在建立针对不同来源柑橘样品和各
种组织通用的柑橘总核酸提取方法，实现制备一次模板，满足同时检测各种类型病害的需求，从而
提高柑橘病害的检测效率，并为柑橘黄龙病菌等病原微生物多样性和种群分化研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料、主要试剂和仪器
本试验于 2011 年 10 月开展，所用的柑橘材料、病害阳性对照和阴性对照均由中国农业科学院
柑橘研究所国家柑橘苗木脱毒中心提供。2011—2013 年采集广东、福建、云南、广西和江西等省份
田间感染柑橘黄龙病材料用于抽提方法的优化和大量应用。试验中所用老叶或老皮材料为前一年或
前一次抽发枝条上的叶片或枝皮。
所用十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、月桂酰肌氨酸钠（SLS）、
Tween-20、Triton X-100、Triton X-405、四甲基乙二胺二钠盐（EDTA-Na2）、三羟甲基氨基甲烷（Tris
Base）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、CaCl2 · 2H2O、N,N–二甲基甲酰胺（DMF）、N,N–二甲基乙酰胺

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（DMAC）、二甲基亚砜（DMSO）等购自上海生工；蛋白酶 K 购自 Merck；100 bp DNA Ladder Ⅲ
和 Tris–饱和酚（pH 8.0）购自鼎国；硼酸、醋酸钠、柠檬酸、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、无水乙
醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、甘油等购自重庆钛新化工；100 bp DNA Ladder、DL2000 DNA Ladder、
限制性内切酶和 DNA 聚合酶购自 TaKaRa；EasyPure Plant Genomic DNA Kit 购自北京全式金；溴化
乙锭（EB）和实时荧光定量 PCR 试剂购自 Bio-Rad；NanoVue Plus 超微量分光光度计购自美国 GE
公司；本试验中所有引物均在华大基因生物技术有限公司合成。梯度 PCR 仪、实时荧光定量 PCR
仪和琼脂糖凝胶电泳仪均购自 Bio-Rad。
1.2 总核酸质量检测
取 2 μL DNA，加 10 μL 1× TE 和 3 μL 6× loading buffer 混匀点样，进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳 100 V
40 min，EB 染色 30 min 后于凝胶成像系统拍照。
取 2.5 μL 1× TE（pH 8.0）溶解的 DNA 样品，用 NanoVue Plus 超微量分光光度计测定 230、260、
280 和 320 nm 波长处的紫外吸光度值，1× TE（pH 8.0）校零，计算 A260/A280 和 A260/A230 的比值，
以及 DNA 浓度，换算 DNA 的得率，公式如下：
DNA 得率（μg · mg-1）= DNA 浓度（μg · μL-1）× 溶解 DNA 体积（μL）/柑橘组织取样量（mg）。
结合琼脂糖凝胶电泳结果、A260/A280 和 A260/A230 的比值，以及 DNA 得率总体评估总核酸的质量。
1.3 韧皮部杆菌检测
以提取的田间黄龙病疑似样品老叶总核酸为模板，PCR 检测方法参考文献报道（Jagoueix et al.，
1994，1996；Fujikawa & lwanami，2012）并稍作改进，反应体系为 25 μL：ddH2O 17.85 μL，10× Buffer
（不含 Mg2+）2.5 μL，25 mmol · L-1 MgCl2 2 μL，10 μmol · L-1 OI1/OI2c 引物（表 1）各 0.5 μL，10
mmol · L-1 dNTPs 0.4 μL，5 U · μL-1 Taq 酶 0.25 μL，DNA 模板 1 μL。扩增反应在 C1000 TM Thermal
Cycler（Bio-Rad，USA）上进行，反应程序如下：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 30 s，64 ℃退火
30 s，72 ℃延伸 80 s，38 个循环后 72 ℃延伸 7 min。
PCR 扩增产物与 6× Loading buffer 混匀后在 1.2%琼脂糖凝胶中 100 V 电泳 40 min，凝胶经 EB
染色后，使用 UVI 凝胶成像系统观察结果并拍照。

表 1 本试验所用引物
Table 1 Primer sets used in the experiment
引物名称
Primer set
序列（5′–3′）
Sequence（5′–3′）
退火温度/℃
Annealing
temperature
产物大小/bp
Amplicon size
检测范围
Specificity
参考文献
References
OI1/OI2c GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA/
GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT
64 1 160 韧皮部杆菌亚洲种
‘Ca. L. asiaticus’，
韧皮部杆菌非洲种
‘Ca. L. africanus’
Jagoueix et al.，
1994，1996
f-rplLAs/r-rplLAs CGCCCGTTTCCGTTGT/
AGCCTCTTTAAGCCCTAAATCAG
63 161 韧皮部杆菌亚洲种
‘Ca. L. asiaticus’
Teixeira et al.，
2008
18SF/18SR AATTGTTGGTCTTCAACGAGGAA/
AAAGGGCAGGGACGTAGTCAA
63 74 植物 18S 核糖体
Plant 18S rDNA
Brunner et al.，
2004
PG3/PG2 TACCATGGTTCTTTCCGA/
RCARTCRTCYTGRTT
50 489 交链格孢菌
Alternaria alternata
陈昌胜 等，
2011
xac01/xac02 CGCCATCCCCACCACCACCACGAC/
AACCGCTCAATGCCATCCACTTCA
60 582 黄单胞杆菌柑橘致病变种
Xanthomonas citri
Coletta-Filho
et al.，2006
3202fw/6rev GTTCTGTGTTTCGACCCGTT/
GGGATTCGCATGGATAGCTCATCCAA
55 444 柑橘黄化脉明病毒
Citrus chlorotic dwarf virus
Loconsole et al.，
2012
CP1/CP3 ATGGACGACGAAACAAAG/
TCAACGTGTGTTGAATTT
57 672 柑橘衰退病毒
Citrus tristeza virus
Gillings et al.，
1996

11 期 苏华楠等：高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立 2345
1.4 CTAB-Triton抽提法和微量葡聚糖柱纯化法制备模板韧皮部杆菌检出率比较试验
将采自广东省的叶片斑驳黄化和均匀黄化症状的 112 份样品，分别用本试验 CTAB-Triton 法和
微量葡聚糖柱纯化法（周常勇 等，2001）提取总核酸，采用引物 OI1/OI2c 检测韧皮部杆菌亚洲种，
以明确此两种抽提方法制备模板时黄龙病菌的检出率。
1.5 定量PCR检测韧皮部杆菌在柑橘叶片中的分布
将采集的具有典型斑驳型黄化症状的柚子叶片（图 1，A），用一次性刀片从下至上依次切分为
翼叶叶肉、翼叶中脉、本叶主脉（分上中下三段）、侧脉（分上中下 3 个区域）和本叶叶肉（图 1，
B），每个部位组织用 CTAB-Triton 法提取 DNA。


图 1 柑橘叶片切割示意图
Fig. 1 The leaf cut section

获得的 DNA 通过核酸读数仪测定浓度，将浓度稀释至均一水平后进行实时荧光定量 PCR 检测。
韧皮部杆菌（引物为 f-rplLAs/r-rplLAs，表 1）和植物内参 18S rDNA（引物为 18SF/R，表 1）实时
荧光定量 PCR 检测体系均为 25 μL。反应体系：ddH2O 9.9 μL，iTaqTM Universal SYBR® Green
Supermix（2×）12.5 μL，10 μmol · L-1 上下游引物各 0.8 μL，DNA 模板 1 μL。在 Bio-Rad 实时荧光
定量 PCR 仪上进行反应：95 ℃预变性 1 min；95 ℃变性 10 s，63 ℃退火延伸 20 s（采集荧光），
共 40 个循环；95 ℃预变性 15 s；溶解曲线 66 ℃ 20 s，每个循环升高 0.5 ℃并采集荧光，共 57 个
循环至 94 ℃终止。使用 iQ5 软件进行 Normalized expression（ΔΔCt）相对定量分析。
1.6 其它柑橘病害检测
将本试验建立的总核酸提取方法用于真菌性病害柑橘褐斑病、细菌性病害柑橘溃疡病、DNA 病
毒病害柑橘褪绿矮缩病和 RNA 病毒病害柑橘衰退病的检测。4 种柑橘病害检测所用引物见表 1，检
测体系和程序参照相应文献报道。
2 结果与分析
2.1 CTAB-Triton总核酸提取法的建立
2.1.1 抽提液 CTAB 属于阳离子表面活性剂，因其对植物多糖去除具有一定的优势，一直是植物
样品 DNA 提取的首选裂解成分，然而 CTAB 在温度低于 15 ℃时易从溶液中析出形成固体，尤其是

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在抽提过程中形成 CTAB-DNA 复合物时低温析出，将会导致 DNA 得率大量降低。
本试验通过将不同性质的表面活性剂、抗冻剂和增溶剂等与 CTAB 进行复配和优化，筛选与
CTAB 兼容的增效剂和抗析出溶剂。结果表明，阴离子表面活性剂（SDS、LDS、SLS 等）和 CTAB
复配，易使 CTAB 由于电荷中和而析出，离液剂异硫氰酸胍也易使 CTAB 析出，非离子表面活性剂
Tween-20、Triton X-100 和 Triton X-405 与 CTAB 复配效果较好，Triton X-100 的复配裂解效果最好。
此外，通过加入不同浓度的抗冻剂甘油和增溶剂 DMAC、DMSO、DMF、无水乙醇，观察 CTAB 耐
低温析出的能力，发现甘油、DMAC 和 DMSO 效果甚微，而无水乙醇和 DMF 的加入可一定程度缓
解 CTAB 低温析出，超过 20%无水乙醇的加入可以明显改善 CTAB 低温析出的特性，但也会明显降
低 DNA 得率，因此选用 DMF 来克服 CTAB 在低温时易析出的缺点；同时优化 Triton X-100 和 DMF
的浓度，发现 Triton X-100 对 CTAB 抵抗低温析出具有一定作用，最终确立提取液中含有 10% DMF
和 1% Triton X-100 时可以明显降低抽提液的粘度，更利于样品的分散和细胞裂解。
新建立的总核酸提取液配方如下。
CTAB-Triton 提取液（200 mL）：4 g CTAB，2.14 g Triton X-100，2 g PVP，16.36 g NaCl，20 mL
1 mol · L-1 Tris–硼酸（pH 8.0），8 mL 0.5 mol · L-1 EDTA（pH 8.0），80 mL ddH2O，加热搅拌溶解，
冷却至室温后加 20 mL DMF，ddH2O 定容至 200 mL（终浓度为：2% CTAB，1% Triton X-100，20
mmol · L-1 EDTA，100 mmol · L-1Tris–硼酸（pH 8.0），1.4 mol · L-1 NaCl，1% PVP，10% DMF），不
可高压灭菌，于室温保存。
CTAB-Triton 抽提液在 10 ℃储存 48 h 仍均一透明，该配方克服了传统 2% CTAB 抽提液在室温
低于 15 ℃时易析出的弊端，解决了抽提过程中因温度低于 15 ℃时严重降低 DNA 得率的问题。
2.1.2 蛋白酶 K 为进一步加快水浴时膜蛋白的解体、核小体蛋白的去除和 DNA 的释放，抽提时
加入了一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶——蛋白酶 K，该酶还可消化 DNA 和 RNA 制备中的核酸
酶。配方中的蛋白酶 K 溶液加入了 50%甘油，可使其在–20 ℃时像 Taq 酶一样保持液态，现取现
用，避免了反复冻融对蛋白酶 K 活性的影响，同时加入了维持其 100%活性的 Ca2+，从而延长了其
存储有效期。且蛋白酶 K 在 CTAB 和 Triton X-100 中均较为稳定，55 ~ 65 ℃水浴也不会失活。蛋白
酶 K 溶液（10 mL）配方：100 mg 蛋白酶 K 加 250 μL 1 mol · L-1 Tris-HCl（pH 8.0），1 mL 100 mmol · L-1
CaCl2，3.5 mL ddH2O 轻摇溶解（勿涡旋溶解），加 5 mL 甘油混匀，每管分装 1 mL，–20 ℃保存（有
效期 2 年）。
2.1.3 优化的抽提方法 通过优化各提取步骤和时间，将各步时间缩至最短，优化后的提取步骤如
下：取 0.25 ~ 0.3 g组织置于研钵内，液氮充分研磨，快速转至 65 ℃预热的裂解液（900 μL CTAB-Triton
抽提液、10 μL 蛋白酶 K 溶液和 10 μL 1 mol · L-1 DTT 溶液），65 ℃水浴 30 min（期间轻轻颠倒 2 次），
室温 13 000 r · min-1 离心 1 min；取上清液加等体积 Tris–饱和酚︰氯仿︰异戊醇（25︰24︰1），颠倒
混匀呈乳浊状，室温静置 5 min 分层，13 000 r · min-1 离心 3 min；用去尖枪头取上清液转至新管，
加等体积氯仿︰异戊醇（24︰1）颠倒混匀，静置分层后，13 000 r · min-1 离心 2 min；用去尖枪头取
上清液转至新管，先后加入上清 1/10 体积 3 mol · L-1 醋酸钠（pH 5.2）和上清等体积的异丙醇，颠
倒混匀至絮状沉淀产生，竖直静置 3 min；用去尖枪头将沉淀吸至新管或 1 000 ~ 2 000 r · min-1 低速
离心 30 s 弃上清液，沉淀用 1 mL 75%乙醇悬浮漂洗，每次 8 000 r · min-1 离心 1 min，收集总核酸沉
淀，共漂洗 2 ~ 3 次，最后 12 000 r · min-1 离心 1 min 后弃净上清液；沉淀于 65 ℃干燥至半透明，溶
于 100 ~ 150 μL 1× TE 溶液（可 65 ℃加快溶解），–20 ℃保存。
2.2 DNA质量检测
提取的总核酸电泳检测结果如图 2。老熟柑橘叶片中的 DNA 和 RNA 同时被提取出来，点样孔
11 期 苏华楠等：高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立 2347
干净，没有蛋白和多糖等杂质的污染，且 DNA 和 RNA 均未降解，条带清晰，整齐干净。经 RNase
消化去除 RNA 后，DNA 条带整齐，亮度高，无降解现象，没有拖带和弥散，说明本方法提取的总
核酸具有良好的完整性。
图 2 CTAB-Triton 法提取柑橘总核酸电泳（左）和 RNA 酶消化去除 RNA 后效果（右）
MA：100 bp ladder Ⅲ（NMW005）；1 ~ 3：RNA 酶未消化的总核酸；MB：100 bp DNA ladder；
4 ~ 11：RNA 酶处理后的 DNA。
Fig. 2 Agrose gel analysis of total nucleic acid extract by CTAB-Triton（Left）and the result by RNase treatment（Right）
MA：100 bp ladder Ⅲ（NMW005)；1–3：Citrus total nucleic acid；MB：100 bp DNA ladder；
4–11：Total DNA by RNase treatment.

比较分别用本研究建立的 CTAB-Triton 提取法（表 2 中 9 ~ 16，抽提过程加入 RNase 去除 RNA）
和全式金 EasyPure Plant Genomic DNA Kit 试剂盒（表 2 中 1 ~ 8，按照说明书步骤操作）提取 0.1 g
柑橘老叶样品 DNA 的质量，CTAB-Triton 法提取的 DNA A260/A280 平均为 1.831，A260/A230 平均为
2.146，DNA 浓度平均为 555.813 ng · μL-1，DNA 得率平均为 0.556 μg · mg-1（表 2），而试剂盒提取
的分别为 1.783、0.834、177.625 和 0.178。其中试剂盒提取的 DNA A260/A230 < 2.0，表明试剂盒提取
可能存在盐离子的残留，而 CTAB-Triton 法不存在该问题。通过独立双样本 t 检验进行统计分析，
CTAB-Triton 法与试剂盒提取 DNA 得率相比 P 值为 6.53 × 10-6，远小于 0.01，差异极显著。因此，
采用 CTAB-Triton 法提取的基因组 DNA 不仅质量较高，而且总 DNA 得率更高，说明 CTAB-Triton
法提取的 DNA 在保证质量的同时得率也很高。
表 2 基因组 DNA 的浓度及纯度
Table 2 Concentration and purity of genomic DNA
提取方法
Method
样品
Sample
取样量/g
Weight
A260 A320 A260/A280 A260/A230
DNA 浓度/（ng · μL-1）
Concentration of DNA
体积/μL
Volume
DNA 得率/（μg · mg-1）
Yield of DNA
1 0.1 2.86 0.013 1.845 1.197 136 100 0.136
2 0.1 2.96 0.003 1.790 0.993 150 100 0.150
3 0.1 3.80 0.042 1.744 1.273 170 100 0.170
4 0.1 6.20 0.178 1.699 0.786 220 100 0.220
植物基因组提
取试剂盒
EasyPure plant
genomic DNA
kit 5 0.1 4.90 0.112 1.919 0.167 190 100 0.190
6 0.1 4.80 0.162 1.711 0.941 160 100 0.160
7 0.1 6.70 0.139 1.749 0.663 265 100 0.265
8 0.1 4.20 0.161 1.806 0.650 130 100 0.130
9 0.1 9.11 0.207 1.796 1.956 445 100 0.445
10 0.1 10.44 0.114 1.875 2.212 517 100 0.517
11 0.1 10.90 0.100 1.789 2.160 540 100 0.540
CTAB-Triton 法
CTAB-Triton
DNA extraction
method 12 0.1 14.43 0.129 1.878 2.231 715 100 0.715
13 0.1 14.58 0.119 1.778 2.093 723 100 0.723
14 0.1 11.56 0.037 1.779 2.186 576 100 0.576
15 0.1 9.13 0.029 1.874 2.151 455 100 0.455
16 0.1 9.55 0.003 1.875 2.178 476 100 0.476

2348 园 艺 学 报 41 卷
2.3 韧皮部杆菌检测
用该提取方法制备模板进行大量柑橘黄龙病疑似样品检测，检测结果和 PCR 产物酶切结果如图
3 所示，韧皮部杆菌亚洲种阳性样品和部分黄龙病疑似样品均能检测出一条明亮的 1 160 bp 的清晰
条带，产物经 XbaⅠ酶切后表明所采样品均为韧皮部杆菌亚洲种 CLas（经酶切后产生 640 和 520 bp
两个片段）（Jagoueix et al.，1996；Deng et al.，2008）。酶切结果和测序结果均显示所扩增的片段为
韧皮部杆菌亚洲种。韧皮部杆菌是生存于柑橘体内的一种细菌，表明该总核酸提取方法可以很好地
释放植物内生病原细菌基因组 DNA。


图 3 OI1/OI2c 引物位点检测（A）和 PCR 产物 XbaⅠ酶切鉴定（B）韧皮部杆菌亚洲种和非洲种
M：100 bp 标准分子量；+CK：阳性对照；-CK：阴性对照；H2O：水对照；1 ~ 28：OI1/OI2c 引物检测疑似样品；
a：未酶切对照；b ~ g：PCR 产物 XbaⅠ酶切。
Fig. 3 Decetion of HLB/HLB-like samples using OI1/OI2c primer site and PCR products digested with XbaⅠto identify
‘Candidatus Liberibacter asiaticus’and‘Ca. Liberibacter africanus’
M：100 bp ladder III（NMW005）；+CK：Positive control；-CK：Negetive control；H2O：Water control；
1–28：Suspected samples detection with OI1/OI2c primer site；a：Undigested control；
b–g：PCR products digested with XbaⅠ.

2.4 CTAB-Triton抽提法和微量葡聚糖柱纯化法制备模板韧皮部杆菌检出率比较
对采自广东省 8 个果园的 112 个柑橘黄龙病疑似样品，分别采用微量抽提法和 CTAB-Triton 抽
提法提取 DNA。其中 CTAB-Triton 抽提法 8 个果园黄龙病菌的检测情况分别为 11/13、17/19、5/7、
16/16、19/21、14/16、17/17、3/3，共检测到 102 个样品感染黄龙病菌；而微量葡聚糖柱纯化法黄龙
病菌的检测情况分别为 9/13、9/19、4/8、12/15、17/21、7/16、17/17、1/3，仅检测到 76 个。结果表
明，采用 CTAB-Triton 法提取总核酸比用微量抽提法制备模板 PCR 检出的黄龙病菌比例高。
2.5 韧皮部杆菌在感病柑橘叶片中的分布
为了进一步检测总核酸提取质量，同时明确柑橘黄龙病检测合适的取样部位，以柚子作为供试
材料，通过实时荧光定量 PCR 进行亚洲种韧皮部杆菌的检测，并进行相对定量分析。结果表明，
11 期 苏华楠等：高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立 2349
CTAB-Triton 抽提法制备的模板可以很好地用于定量 PCR 的检测上，扩增曲线平滑，无荧光抑制现
象（图 4）。相对定量分析表明韧皮部杆菌在柚子叶片中的分布不均匀，主要分布于叶脉，而叶肉（含
细小侧脉）含量最低（图 5 和图 6）。因此，黄龙病检测取样应选取老熟叶柄和含有中脉及其附近 2 ~
3 mm 左右的组织，微量提取时可取叶片中下部侧脉。


图 4 CTAB-Triton 法制备模板 qPCR 检测韧皮部柑橘亚洲种效果
Fig. 4 The effect of qPCR detection‘Candidatus Liberibacter asiaticus’by using CTAB-Triton DNA extraction method



图 5 柚子叶片各部位亚洲种韧皮部杆菌的相对含量
1：翼叶叶肉，2：翼叶中脉；3 ~ 5：本叶主脉上、中、下；
6 ~ 8：侧脉上、中、下；9：本叶叶肉。
Fig. 5 The relative concentration of‘Candidatus Liberibacter
asiaticus’in different cut section of pomelo leaf
1：The blade of petiole wing；2：The midrib of petiole wing；
3–5：Top，middle and bottom of midrib；6–8：Top，middle and
bottom of lateral vein；9：Leaf blade.
图 6 HLB 病原在柑橘叶片中的主要分布
及含量示意图
Fig. 6 Distribution of HLB bacterial in citrus leaves


2.6 柑橘其它病害检测
应用该方法制备的总核酸模板，分别对柑橘褐斑病、柑橘溃疡病、柑橘褪绿矮缩病和柑橘衰退
病进行检测，结果（图 7）表明：所提取的总核酸模板可以用于上述柑橘不同病害的检测，扩增的
特异性条带清晰明亮。


2350 园 艺 学 报 41 卷
图 7 柑橘常见病害检测
M：DNA 标准分子量；1、2：柑橘褐斑病样品；3、4：柑橘溃疡病样品；5、6：柑橘褪绿矮缩病样品；
7、8：柑橘衰退病样品；-CK：阴性对照。
Fig. 7 The detection results of different citrus diseases
M：DNA marker；1，2：Citrus Brown Spot；3，4：Citrus Canker；5，6：Citrus chlorotic dwarf virus；
7，8：Citrus tristeza virus；-CK：Negetive control.
3 讨论
本研究中对传统 CTAB 抽提方法进行了改进，通过添加非离子表面活性剂 Triton X-100、蛋白
酶 K 和 DMF，增强了传统 CTAB 的细胞裂解效果，并改善了在低温时的稳定性，PVP 的存在可以
结合大量多酚类物质，而 DTT 的加入避免了酚类物质被氧化，用 Tris–硼酸（pH 8.0）缓冲液替代
Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液后，对 DTT 抗氧化性具有增效作用，使抽提液具有更强的抗氧化能力，
防止多酚被氧化成醌类物质而导致提取核酸的褐化现象。
CTAB 属于阳离子表面活性剂，试验通过对比加入各种阴离子表面活性剂、离液剂、非离子表
面活性剂，以及抗冻剂和增溶剂等发现 DMF 的加入可克服 CTAB 在低温时易析出的缺点，而加入
Triton X-100 进行复配裂解效果最好，且对抗 CTAB 低温抗析出具有增效作用。
将 CTAB-Triton 提取法与商品化柱纯化试剂盒提取的 DNA 进行比较，CTAB-Triton 提取法的纯
度和得率均较高。王春梅等（2009）比较了 Jagoueix 等（1996）的 NaCl 提取法、传统 CTAB 法抽
提法和北京鼎国生物技术有限责任公司的植物基因组 DNA 提取试剂盒，结果表明 Jagoueix 等（1996）
的提取效果最差，传统 CTAB 法比鼎国的试剂盒效果好，其中传统 CTAB 法总 DNA 平均浓度为
178.178 ng · μL-1，A260/A280比值平均为 1.81，而鼎国试剂盒提取的总 DNA 平均浓度为 8.808 ng · μL-1，
A260/A280 比值平均为 1.80，而本研究建立的 CTAB-Triton 法总 DNA 平均浓度为 555.813 ng · μL-1，
总 DNA A260/A280 比值平均为 1.831，优于以上几种方法。此外，王茜等（2013）和 Jagtap 等（2013）
比较了多种国内天根试剂盒和国外 QIAGEN 的植物提取试剂盒，结果表明天根的植物基因组 DNA
提取试剂盒、CTAB 提取法和 QIAGEN DNeasy Plant Mini kit 提取得到的 DNA 质量相对较好，但试
剂盒得到的 DNA 较少，QIAGEN 试剂盒平均为 159.60 ng · μL-1，DNA 平均得率为 0.16 μg · mg-1，
本研究中所用全式金植物提取试剂盒得到的 DNA 平均浓度为 177.625 ng · μL-1，平均得率为 0.178
μg · mg-1，均远小于 CTAB-Triton 法 DNA 提取得率 0.556 μg · mg-1。且 CTAB-Triton 提取法与商品化
的柱纯化试剂盒相比成本低廉，可节省大量费用。操作时间比传统 CTAB 法（Murray & Thompson，
1980）大大节省，1 ~ 2 h 即可完成整个提取过程，比原传统 CTAB 法缩短了至少一半的时间，本方
法提取的不同来源柑橘样品，总核酸纯度高，完整性好，DNA 得率比商品化的试剂盒高，能够满足
后续病原种群多态性等研究中对大量模板 DNA 的需求，也可用于实时荧光定量 PCR 检测分析。
评价一种植物样品总核酸提取方法是否有效，不仅要求提取的DNA和RNA片段完整而未降解，
还需能够有效地去除植物中影响后续试验的多糖、多酚、色素和其它次生代谢产物；另外提取方法
11 期 苏华楠等：高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立 2351
应具广谱性，对植物中大多数微生物的 DNA 和 RNA 也应尽可能地有效提取。本试验建立的
CTAB-Triton 提取方法除用于柑橘黄龙病的病原检测上，提取的总核酸除检测柑橘 DNA 病害外，还
可以检测病原为 RNA 的病毒病害，目前已成功尝试用于柑橘病组织中的真菌性病原物、细菌性病
原物、病毒性病原物的检测，如：柑橘褐斑病、柑橘溃疡病、DNA 病毒柑橘褪绿矮缩病毒、RNA
病毒柑橘衰退病毒等。同时还用该方法提取了长春花、仙人掌、竹、吊兰、桃、泡桐、辣椒、烟草
和黄皮等的总核酸，质量均较为理想，说明该方法具有一定的广谱性。
4 结论
本研究中开发了一种快速、简便提取植物老熟组织总核酸的方法，可满足各种柑橘病原真菌、
细菌，以及 DNA 或 RNA 病毒病害的 PCR 检测，以及实时荧光定量 PCR 检测的需求。该方法能从
0.25 ~ 0.3 g 柑橘老叶中得到超过 100 μg 高纯度 DNA，说明 CTAB-Triton 提取的总核酸可以很好地
满足后续病原多样性和种群分化等研究的需要，此外由于该方法的取样量相对微量葡聚糖柱纯化法
多，可以弥补由于黄龙病菌在叶片中因分布不均而造成检测假阴性的缺点，从而提高了黄龙病菌的
检出率。

References
Bové J M. 2006. Huanglongbing：A destructive，newly-emerging，century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology，88 (1)：7–37.
Brunner A，Yakovlev I，Strauss S. 2004. Validating internal controls for quantitative plant gene expression studies. BMC Plant Biology，4 (1)：14.
Chen Chang-sheng，Huang Feng，Cheng Lan，Feng Chun-gang，Huang Tao-jiang，Li Hong-ye. 2011. Identification of the pathogenic fungus causing
brown spot on tangerine（Citrus reticulata cv. Hongjü）. Acta Phytopathologica Sinica，(5)：449–455. (in Chinese)
陈昌胜，黄 峰，程 兰，冯春刚，黄涛江，李红叶. 2011. 红橘褐斑病病原鉴定. 植物病理学报，(5)：449–455.
Coletta-Filho H D，Takita M A，Souza A A，Neto J R，Destefano S A，Hartung J S，Machado M A. 2006. Primers based on the rpf gene region provide
improved detection of Xanthomonas axonopodis pv. citri in naturally and artificially infected citrus plants. Journal of Applied Microbiology，100
(2)：279–285.
Da Graca J V. 1991. Citrus greening disease. Annual Review of Phytopathology（USA），29：109–136.
Deng X，Chen J，Feng Z，Shan Z，Guo H，Zhu J，Li H，Civerolo E L. 2008. Identification and characterization of the Huanglongbing bacterium
in pummelo from multiple locations in Guangdong，PR China. Plant Disease，92 (4)：513–518.
Dong Peng，Bao Gai-li，Ran Zhi-wei，Chen Hai-ru，Li Fan. 2011. Detection and sequence analysis of the 16S rDNA of citrus Huanglongbing causal
agent in Yunnan. Journal of Yunnan Agricultural University，26 (5)：607–611. (in Chinese)
董 鹏，包改丽，冉志伟，陈海如，李 凡. 2011. 云南柑橘黄龙病病原检测及其 16S rDNA 序列分析. 云南农业大学学报，26 (5)：
607–611.
Fan Guo-cheng，Liu Bo，Wo Ru-jian，Li Tao，Cai Zi-jian，Ke Chong. 2009. Thirty years of research on citrus Huanglongbing in China. Fujian Journal
of Agricultural Sciences，24 (2)：183–190. (in Chinese)
范国成，刘 波，吴如健，李 韬，蔡子坚，柯 冲. 2009. 中国柑橘黄龙病研究 30 年. 福建农业学报，24 (2)：183–190.
Fujikawa T，Iwanami T. 2012. Sensitive and robust detection of citrus greening（Huanglongbing）bacterium“Candidatus Liberibacter asiaticus”
by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Molecular and Cellular Probes，26 (5)：194–197.
Gillings M，Broadbent P，Indsto J. 1996. Restriction analysis of amplified CTV coat protein cDNA is a sensitive and rapid method for monitoring and
controlling CTV infections. RNA（dsRNA），9 (16)：20–24.
Huang Yong-hui，Cheng Bao-ping，Peng Ai-tian. 2014. Genetic diversity of Candidatus Liberibacter isolates from different geographical regions of
Guangdong Province. Plant Protection，40 (1)：60–64. (in Chinese)
黄永辉，程保平，彭埃天. 2014. 广东不同地区柑橘黄龙病菌的遗传多样性分析. 植物保护，40 (1)：60–64.
Jagtap G P，Mahajan M V，Dey U. 2013. Molecular detection of Candidatus liberibacter asiaticus associated with citrus greening（Huanglongbing）

2352 园 艺 学 报 41 卷
of mandarin by DNA template preparation. Scientific Journal of Crop Science，2 (1)：1–7.
Jagoueix S，Bové J M，Garnier M. 1994. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the α subdivision of the
Proteobacteria. International Journal of Systematic Bacteriology，44 (3)：379–386.
Jagoueix S，Bové J M，Garnier M. 1996. PCR detection of the two‘Candidatus’Liberobacter species associated with greening disease of citrus.
Molecular and Cellular Probes，10 (1)：43–50.
Loconsole G，Saldarelli P，Doddapaneni H，Savino V，Martelli G P，Saponari M. 2012. Identification of a single-stranded DNA virus associated with
citrus chlorotic dwarf disease，a new member in the family Geminiviridae. Virology，432 (1)：162–172.
Murray M G，Thompson W F. 1980. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research，8 (19)：4321–4326.
Tan Jin，Wang Xue-feng，Su Hua-nan，Li Zhong-an，Zhou Chang-yong. 2013. Genetic diversity of two hypervariable genes from prophage regions
of‘Candidatus Liberibacter asiaticus’in China. Scientia Agricultura Sinica，46 (18)：3784–3792. (in Chinese)
谭 锦，王雪峰，苏华楠，李中安，周常勇. 2013. 中国柑橘黄龙病病原菌两个原噬菌体超变异基因遗传多样性. 中国农业科学，46 (18)：
3784–3792.
Texeira D C，Ayres J，Kitajima E W，Danet L，Jagoueix-Eveillard S，Saillard C，Bové J M. 2005. First report of a Huanglongbing-like disease of
citrus in São Paulo State，Brazil and association of a new Liberibacter species，“Candidatus Liberibacter americanus”，with the disease. Plant
Disease，89 (1)：107.
Teixeira D C，Saillard C，Couture C，Martins E C，Wulff N A，Eveillard-Jagoueix S，Yamamoto P T，Ayres A J，Bove J M. 2008. Distribution
and quantification of Candidatus Liberibacter americanus，agent of huanglongbing disease of citrus in São Paulo State，Brazil，in leaves of an
affected sweet orange tree as determined by PCR. Molecular and Cellular Probes，22 (3)：139–150.
Wang Chun-mei，Zhang Qiu-ming，Luo Qi-ke，Wang Hong. 2009. Comparicon of extraction methods of DNA from citrus huanglongbing pathogen.
Southwest China Journal of Agricultural Sciences，(5)：1341–1344. (in Chinese)
王春梅，张秋明，罗齐克，王 红. 2009. 柑橘黄龙病病原 DNA 提取方法比较. 西南农业学报，(5)：1341–1344.
Wang Qian，Liao Hui-hong，Huang Hong-ming，Lu Yu-ying，Li Wen-xin，Xu Ning，Wei Zong-bian，Li Yi-wei. 2013. Comparative test for DNA
extraction methods of citrus huanglongbing pathogen. Journal of Southern Agriculture，(2)：225–229. (in Chinese)
王 茜，廖惠红，黄宏明，陆玉英，李文信，徐 宁，韦宗便，李一伟. 2013. 柑橘黄龙病病原DNA 提取方法比较. 南方农业学报，(2)：225–229.
Yi Long，Sheng Ku-jun，Zhong Ba-lian，Lai Xiao-hua，Chen Ci-xiang. 2012. Molecular characterization of citrus huanglongbing bacteria in Gannan
navel orange based on 16S rDNA sequences alignment. Journal of Fruit Science，28 (6)：1099–1103. (in Chinese)
易 龙，声苦军，钟八莲，赖晓华，陈慈相. 2012. 基于 16S rDNA 序列比对分析赣南脐橙上柑橘黄龙病病原的分子特征. 果树学报，
28 (6)：1099–1103.
Zhou Chang-yong，Hailstones D，Connor R，Rarkley P，Bowyer J. 2001. A method for micro and rapid extraction of Citrus tristeza virus（CTV）
nucleic acid applied to RT-PCR amplification. Journal of Fujian Agricultural University，30 (Supplement)：200. (in Chinese)
周常勇，Hailstones D，Connor R，Rarkley P，Bowyer J. 2001. 一种微量快速抽提柑橘衰退病毒（CTV）核酸应用于 RT-PCR 扩增的方
法. 福建农业大学学报，30 (增刊)：200.
Zhou Kai-long，Ye Meng-min. 2010. Fruit in China（Citrus）. Beijing：China Forestry Publishing House：1–8. (in Chinese)
周开隆，叶萌民. 2010. 中国果树志柑橘卷 · 北京：中国林业出版社：1–8.

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