全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（8）：1567–1574 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–02–21；修回日期：2012–06–15
基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（2012CB113900）；国家自然科学基金项目（31071802，31000908）；重庆市自然科学基金
重点项目（2011BA1002）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2009C126）；教育部博士点基金项目（20090182120003）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：swausongm@yahoo.com.cn；wxj@swu.edu.cn）
结球甘蓝花粉膜联蛋白基因的克隆及其表达分
析
孙梓健，许俊强，宋 明*，韦静宜，汤青林，王志敏，王小佳*
（西南大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点试验室，南方山地园艺学教育部重点试验室，重庆 400715）
摘 要：对结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）花粉总蛋白双向电泳及差异蛋白质谱分析，
发现膜联蛋白在花粉萌发后较萌发前表达下调。通过同源扩增和 RACE 等方法首次在结球甘蓝花粉中扩
增得到 BoAnnexin2 基因的 cDNA 序列，该基因 cDNA 全长 1 157 bp，开放阅读框为 951 bp，编码 316 个
氨基酸残基，预测分子量为 36.02 kD，等电点 6.33。BoAnnexin2 编码蛋白 C 端有 4 个膜联蛋白重复序列，
共 2 个Ⅱ型钙结合区域，在第 4 个钙结合区位点包含 GXXXGXS（T）/DXXG 基序。实时荧光定量试验
表明，BoAnnexin2 在甘蓝成熟未萌发花粉中的表达量是萌发 45 min 后表达量的 8 倍，表明 BoAnnexin2 在
甘蓝花粉萌发起始阶段起到重要调控作用。
关键词：结球甘蓝；花粉；膜联蛋白
中图分类号：S 635.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）08-1567-08

Molecular Cloning and Expression Analysis of Annexin Gene from Cabbage
SUN Zi-jian，XU Jun-qiang，SONG Ming*，WEI Jing-yi，TANG Qing-lin，WANG Zhi-min，and WANG
Xiao-jia*
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University；Chongqing Key Laboratory of Olericulture；
Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education，Chongqing 400715，
China）
Abstract：Plant annexins constitute a multigene family having suggested roles in a variety of cellular
processes. We have isolated and characterized an annexin cDNA of cabbage（Brassica oleracea L. var.
capitata L.）gene（BoAnnexin2）encoding annexin proteins using RT-PCR and RACE-PCR after 2-D
electrophoresis of cabbage pollen total proteins，which found that annexin protein was downregulated
when pollens were germinated. The BoAnnexin2 gene was 1 157 bps，which contained 951 bps open
reading frame. The predicted molecular mass of BoAnnexin2 is 36.02 kD with acidic pI of 6.33. At the
amino acid level，BoAnnexin2 contains two typeⅡCa2+ binding domain repeats，there was a GXXXGXS
（T）/DXXG motif in the fourth domain. The quantitative RT-PCR revealed that the BoAnnexin2 gene
expression in mature pollen is eight times higher than that in germinated pollen. These results indicate that
BoAnnexin2 gene may play an important role in cabbage pollen germination.

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Key words：cabbage；pollen；annexin

钙离子在植物体内作为第二信使通过钙调素（CaM）、钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）和钙调磷
酸 B 类蛋白（CBL）等钙感受蛋白参与胞内信号传导以应对外界刺激（孙梓健 等，2012），除此以
外，有大量研究表明另一类钙结合蛋白——膜联蛋白（Annexin）也在植物细胞信号传导中起着十分
重要的作用（Knight & Knight，2001）。
膜联蛋白广泛存在于真核生物细胞中，属于钙依赖性磷脂结合蛋白，相对于动物研究而言，膜
联蛋白在植物中的研究起步更晚。在植物细胞中，膜联蛋白主要参与了细胞分泌、钙离子代谢、信
号转导及环境胁迫信号的应答等功能（Carroll et al.，1998；Lee et al.，2004；Konopka-Postupolska et
al.，2009；Laohavisit et al.，2009）。在细胞内，膜联蛋白对于膜的形成起到了十分重要的作用，在
膜联蛋白与钙离子相结合后，能够与另一种钙感受蛋白 S100A10 结合形成聚合体，随后膜联蛋白 N
端磷酸化，最终完成胞吞及胞吐作用，这对于质膜的形成具有重要的作用（Bevers et al.，2000）。
拟南芥 8 个家族膜联蛋白的氨基酸序列比对结果表明，膜联蛋白可能参与花粉管的极性生长，
Clark 等（1994）的免疫定位结果表明在玉米花粉管内也有大量的膜联蛋白聚集。对自交不亲和性机
理的研究发现，钙在信号转导的过程中具有普遍而重要的作用，许多花粉管萌发和伸长所需要的蛋
白质，都是钙相关蛋白（Luan et al.，2002；Dai et al.，2007），这些钙相关蛋白在植物适应环境和实
现生殖发育的信号传导中起着极其重要的作用。因此，尚未分离鉴定的甘蓝花粉钙感应蛋白与甘蓝
自交不亲和性的关系是值得深入研究的内容。本试验中通过双向电泳等方法，在结球甘蓝花粉萌发
过程中发现 BoAnnexin2 蛋白表达下调，结合国内外的研究报道和已有的研究基础，通过同源扩增
等方法首次从甘蓝花粉 cDNA 中扩增得到甘蓝膜联蛋白基因的 cDNA 序列，并对花粉萌发前后该基
因的表达量进行了分析，推断 BoAnnexin2 基因可能对结球甘蓝花粉的萌发具有重要的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
结球甘蓝高度自交不亲和系 E1 的成熟花粉于 2011 年 4 月采自西南大学十字花科蔬菜研究所试
验田。试验于 2011 年 12 月至 2012 年 2 月在西南大学重庆市蔬菜学重点实验室完成。
1.2 花粉萌发及蛋白双向电泳试验
将收集的自交不亲和系花粉在相对湿度 100%条件下静置培养 2 h，后置于花粉液体萌发培养基
中（Roberts et al.，1983），25 ℃培养 1 h。
将成熟未萌发（实际通过液体培养基收集，为培养 1 ~ 3 min 的混合样本）和萌发试验 45 min
后的花粉样本离心收集，采用 Protein Extraction Kit（Bio-Rad，163-2086）抽提总蛋白，使用 2-D 纯
化试剂盒（Bio-Rad，163-2130）纯化总蛋白，除去杂质，最后使用 Bradford 法定量（Fermentas，
#R1271）后置–80 ℃保存。
纯化得到的花粉总蛋白第一向等电聚焦使用 Bio-rad 17 cm IPG 3-10 非线性胶条在 PROTEANⅡ
（Bio-Rad）上进行，蛋白上样量为 60 ng · gel-1，等电聚焦条件为：250 V 1 h；3 000 V 2 h；8 000 V
2 h；10 000 V 恒压至 100 000 Vh。
第二向电泳条件：10 mA · gel-1，30 min；15 mA · gel-1 至电泳结束。
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1.3 BoAnnexin2 的 cDNA 克隆
根据双向电泳质谱鉴定结果以及 GenBank 数据库中拟南芥 Annexin D2 的核苷酸序列（GenBank
登录号：NM_125901 和 AED97986）设计引物对 BoAnn-F（5′-CGTTTATGCAGCTACCTACAAT-3′）
和 BoAnn-R（5′-GAATGCTGTTTCTTCGCTGATA-3′）用于 cDNA 序列片段的扩增。分别提取萌发
与未萌发花粉的总 RNA 用于实时荧光定量分析，混合这两个总 RNA 样本用于基因克隆。总 RNA
使用 Trizol 提取，DNaseⅠ去除总 RNA 样品中的 gDNA，最后使用 PrimeScript RT-PCR Kit 合成第
一链 cDNA。RT-PCR 扩增体系为 ddH2O 32.8 μL，10 × PCR 缓冲液 5 μL，2 mmol · L-1 dNTP 5 μL，
25 mmol · L-1 MgSO4 3 μL，BoAnn-F/BoAnn-R 各 1.5 μL，KOD DNA 聚合酶 1 μL，模板 DNA 1 μL。
PCR 扩增参数为：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35 个循环。回收目的片段
分别连接到 pEASY-Blunt simple 载体后转化至大肠杆菌感受态细胞 JM109，取阳性克隆进行酶切鉴
定并送测序。
根据测序得到的序列信息设计 RACE 引物 BoAnn-F-3（5′-GCGTTCCTTTGGACCGTGCTATC
G-3′）/BoAnn-R-5（5′-TGCTCGCAAGATCCGAAGCCAAG-3′），RACE 试验 PCR 扩增体系为 ddH2O
11 μL，10 × LA Taq PCR 缓冲液 2.5 μL，2.5 mmol · L-1 dNTP 4 μL，UPM 引物（5′-CTAATACGACTC
ACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′）2.5 μL，BoAnn-F-3/BoAnn-R-5（10 mmol · L-1）
各 1 μL，LA Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，模板 DNA 1 μL。PCR 扩增参数为 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，
72 ℃ 3 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30
s，72 ℃ 3 min，21 个循环。
根据克隆得到的 BoAnnexin2 的 cDNA 读框序列，使用 Vector NTI 软件进行预测得到氨基酸残
基序列，然后根据其他植物 Annexin 蛋白的分析（Lu et al.，2012）对 BoAnnexin2 的功能结构域进
行注释。将预测得到的 BoAnnexin2 序列与从 GenBank 数据库检索到拟南芥等部分高等植物膜联蛋
白家族氨基酸序列经 Clustal X2 比对后通过 MEGA 软件构件系统发生树。
1.4 花粉 BoAnnexin2 的表达分析
分别收集成熟萌发和未萌发花粉样本。实时荧光定量 RT-PCR 试验方法采用 Livak Method
（2–ΔΔCT）在 C1000 Thermal Cycler（Bio-Rad）上进行。试验以 β-Actin 为内参基因，引物为上游：
5′-TATCAACTACCAGCCACC-3′，下游：5′-GAACACCTCAGCTACACTC-3′，BoAnnexin2 表达分析
引物为 BoActin-F（5′-CCAAAGAATCCACCAAA-3′）/ BoActin-R（5′-CCAGAGGAAGCAATAGC-3′），
使用 SsoFastTM EvaGreen® Supermix（Bio-Rad）预混液配制反应体系，扩增条件为：95 ℃ 2 min；
95 ℃ 1 s，57.5 ℃ 2 s，72 ℃ 2 s，40 个循环。每个取样点设 3 个技术重复，3 个生物学重复。
2 结果与分析
2.1 花粉总蛋白双向电泳分析
提取成熟未萌发花粉（图 1，a）与萌发花粉（图 1，b）总蛋白，进行双向电泳，结果经 PDquest
软件分析共得到 31 个明显的蛋白差异点（图 1，c、d，箭头），图中第 26 号蛋白点在萌发后的花粉
蛋白中没有出现。
将此蛋白点进行质谱（MALDI-TOF-MS）分析，结果显示其与拟南芥 Annexin D2 蛋白具有较
高的同源性。
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图 1 结球甘蓝成熟花粉（a、c）和萌发花粉（b、d）双向电泳图
Fig. 1 2-D images of mature（a，c）and germination pollen（b，d）of cabbage

2.2 BoAnnexin2 的 cDNA 克隆及其序列分析
使用引物 BoAnn-F 和 BoAnn-R 在结球甘蓝花粉 cDNA 中扩增得到 844 bp 的片段（图 2，A），
在得到这一片段后设计 RACE 引物，扩增得到 212 bp（图 2，B，包含 UPM 引物片段的长度为 264 bp）
的 5′端片段和 588 bp（图 2，B，包含 UPM 引物片段的长度为 636 bp）的 3′端片段。

图 2 BoAnnexin2 同源扩增（A）和 RACE 扩增（B）电泳图
M：D2K plus DNA marker；m：DL2000 DNA marker；An：BoAnnexin2 片段；C：阴性对照；
A3：BoAnnexin2 3′RACE 片段；A5：BoAnnexin2 5′RACE 片段。
Fig. 2 RT-PCR amplification of BoAnnexin2 in pollen of cabbage（A）and RACE of BoAnnexin2（B）
M：D2K plus DNA marker；m：DL2000 DNA marker；An：BoAnnexin2 fragment；
C：No template control；A3：3′RACE fragment of BoAnnexin2；
A5：5′RACE fragment of BoAnnexin2.

2.3 BoAnnexin2 分子结构，钙离子结合区域与进化分析
利用同源克隆及 RACE 等方法通过拼接得到结球甘蓝 BoAnnexin2 全长 1 157 bp（GenBank 登录
号 JQ639088），GC 含量 45.12%，开放阅读框（ORF）位于 74 ~ 1 024 bp，3′ UTR 为 133 bp，5′ UTR
8 期 孙梓健等：结球甘蓝花粉膜联蛋白基因的克隆及其表达分析 1571

为 73 bp，加尾信号（AATAAA）位于第 1 063 bp 处（图 3）。
根据 cDNA 序列所推导得到的 BoAnnexin2 共 316 个氨基酸残基，预测分子量为 36.02 kD，等
电点为 6.33。BoAnnexin2 蛋白具有 4 个重复的膜联蛋白超家族结构域，钙离子结合区域位于第 28 ~
80，100 ~ 152，183 ~ 235，259 ~ 311 位氨基酸残基（图 3）。
通过 SignalP 分析该蛋白不含信号肽（Henrik et al.，1997），TargetP 亚细胞定位预测表明此蛋白
在叶绿体和线粒体中存在的可能性极低，定位于其他细胞器的可能性较高。



图 3 结球甘蓝 BoAnnexin2 基因序列及其推导氨基酸序列
灰色阴影部分为 4 个钙离子结合区域，红色标记的氨基酸残基为 BoAnnexin2 结构域保守氨基酸残基，
方框标记为 GXXXGXS（T）/DXXG 基序。紫色底纹：His40 过氧化物酶结合位点；
黄色：S3 cluster；绿色：IRI actin 结合位点。
Fig. 3 BoAnnexin2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of cabbage
The amino acids symbol in red at the positions are in agreement with the residues that have conserved amino
acid properties of BoAnnexin2；Amino acid with frame is GXXXGXS（T）/ DXXG motif.
The sequences highlighted are as follows：Calcium binding domain，grey；
His 40 key peroxidase residue，purple；S3 clusters，yellow；
IRI actin-binding motif，green.

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系统发生树（图 4）表明结球甘蓝 BoAnnexin2 与芥菜 Annexin 2 和拟南芥 Annexin D2 位于相同
的进化枝上，与拟南芥的 Annexin D6 和 Annexin D7 关系较近。

 
图 4 Annexin 系统发生树
Fig. 4 Phylogenetic tree of Annexin
 
2.4 BoAnnexin2 在花粉萌发中的表达分析
BoAnnexin2 在花粉萌发前表达量为花粉萌发 45 min 后的 8 倍左右，表明 BoAnnexin2 在花粉萌
发后期表达下调。


图 5 结球甘蓝花粉 BoAnnexin2 表达分析
Fig. 5 Expression analysis of BoAnnexin2 in pollens of Brassica oleracea
8 期 孙梓健等：结球甘蓝花粉膜联蛋白基因的克隆及其表达分析 1573

3 讨论
相对于动物而言，植物中的膜联蛋白更小，从家族基因数量上来说也更少，在拟南芥和水稻中
膜联蛋白家族分别是 8 个和 10 个，而人类基因组中则有 13 个（Clark et al.，2001；Cantero et al.，
2006），从这也可以看出膜联蛋白基因在植物中属于多基因家族。通过将结球甘蓝 BoAnnexin2 蛋白
与其他高等植物进行同源性分析发现，BoAnnexin2 蛋白与拟南芥 Annexin D2 和芥菜 Annexin2 具有
较高的同源性，拟南芥和芥菜的 Annexin D2 和 Annexin2 仅在叶、根和花器官中表达（Cantero et al.，
2006）。从系统发生树的结论与 Cantero 等（2006）研究结果推测 BoAnnexin 2 与拟南芥 Annexin D1、
Annexin D2、Annexin D6 和 Annexin D7 一样，相对于其他多基因家族基因，在功能和结构上缺乏多
样性，这在构建的系统发生树中也可以看到，BoAnnexin2 与拟南芥 Annexin D6 和 Annexin D7 聚在
较近的枝上，因此，BoAnnexin2 可能与拟南芥 Annexin D2、Annexin D6 和 Annexin D7 具有类似的
功能。
在已有的研究中发现，膜联蛋白在番茄、马铃薯、拟南芥（Clark et al.，2001），烟草（Proust et
al.，1999）和大麦（Smallwood et al，1992）等植物中呈现组织特异性表达；对膜联蛋白在百合花粉
管（Blackbourn et al.，1992）和豌豆茎尖（Clark et al.，1998）的免疫定位试验表明，膜联蛋白在植
物极性生长中具有重要作用；大量植物逆境胁迫的研究表明膜联蛋白在抵抗胁迫的过程中起到了关
键的作用。参照已知膜联蛋白的功能，推测 BoAnnexin2 第 2 个和第 3 个串联重复区决定了其功能
特异性，而不是像哺乳动物那样由 N 端序列的多样性决定（Cantero et al.，2006）。在其他膜联蛋白
中的保守氨基酸残基（Barton et al.，1991）也同样出现在 BoAnnexin2 氨基酸序列中同样的位置（图
3），通过对酸性氨基酸残基在 4 个串联重复区域中位置（第 68 位谷氨酸和第 298 位天冬氨酸）分析
推测 BoAnnexin2 序列中 4 个串联重复序列中第 1 个和第 4 个属于Ⅱ类钙结合位点，这两个位点即
是最有可能与磷脂相结合的区域。在第 4 个重复序列中发现其含有 GTP 结合基序（GXXXXGXKS/T
和 DXXG 基序）和 actin 结合位点（图 3），这表明 BoAnnexin2 可能具有 ATP 酶和 GTP 酶活性（Mc
Clung et al.，1994；Shin & Brown，1999；Mortimer et al.，2008）。这些推测有待在后续试验中对
BoAnnexin2 蛋白中可能的磷酸化位点及 BoAnnexin2 转录后剪切机制进一步研究证实。另外，对
BoAnnexin2 的序列分析发现其含有的 His40 过氧化物酶等活性位点（图 3），表明它可能参与膜上电
子传递等过程，对维持膜结构的稳定，进而在细胞抵御外界环境胁迫方面可能也起到一定作用
（Hofmann et al.，2003）。
实时荧光定量研究表明，BoAnnexin2 表达量在花粉萌发后期下调，与花粉总蛋白双向电泳结果
一致；在拟南芥中 Annexin D2、Annexin D6 和 Annexin D7 在花器官中均有表达（Cantero et al.，2006），
通过免疫定位等试验也发现在玉米花粉管中有膜联蛋白的聚集（Clark et al.，1994），推断 BoAnnexin2
对结球甘蓝花粉的萌发具有重要作用。

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