全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（2）：355–362 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–09–27；修回日期：2011–12–27
基金项目：国家农业综合开发项目（GH32311002）；江苏省林业三项工程项目（lxsx[2008]02）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chenpeng@yzu.edu.cn；Tel：0514-87972072）
银杏类黄酮 O–甲基转移酶基因的克隆与表达
分析
张传丽 1，陈 鹏 2,*，仲月明 2，周长远 2，梁国华 3，沈丹红 2，吴秋月 2
（1 扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2 扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009；3 扬州大
学教育部植物功能基因组学重点实验室，江苏扬州 225009）
摘 要：采集扬州大学银杏种质资源圃不同发育时期的银杏叶片提取 RNA，经简并引物 PCR 和 5′
RACE 扩增，得到了 5′端包含起始密码子在内的长为 876 bp 的银杏类黄酮 O–甲基转移酶（flavonoid
O-methyl-transferase，FOMT）基因 cDNA 片段，命名为 GbFOMT-13，其在 GenBank 数据库注册号为
JN711433。对所得核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行 BLAST 比对分析和进化树分析，结果证实了
GbFOMT-13 为银杏的 FOMT 部分序列。半定量 RT-PCR 结果表明，GbFOMT-13 表达水平在银杏叶片的
不同发育时期差异很大，其表达模式表现为春季幼叶＞秋季老叶＞夏季成熟叶，与类黄酮总量增长速率
变化趋势相似。
关键词：银杏；叶片；GbFOMT-13；基因；克隆；表达模式
中图分类号：S 664.3 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）02-0355-08

Cloning and Expression of Flavonoid O-methyltransferase Gene in Ginkgo
biloba
ZHANG Chuan-li1，CHEN Peng2,*，ZHONG Yue-ming2，ZHOU Chang-yuan2，LIANG Guo-hua3，SHEN
Dan-hong2，and WU Qiu-yue2
（1 College of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China；2 School of
Horticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China；3 Key Laboratory of Plant
Functional Genomics，Ministry of Education，Yangzhou University，Jiangsu Yangzhou 225009，China）
Abstract：Ginkgo biloba leaves were collected from Ginkgo Germplasm Resources Garden of
Yangzhou University during different developmental periods，and were used to extract total RNA. After
degenerate primer PCR and 5′ RACE amplifying，a 876 bp cDNA sequence containing 5′ end and start
codon，named GbFOMT-13 was obtained，which had been embodied in GenBank database，and accession
No. is JN711433. Alignment with BLAST of the nucleotide and deduced amino acid sequence and
phylogenetic tree analysis showed that GbFOMT-13 was partial of FOMT gene from Ginkgo biloba.
Semi-quantitative RT-PCR analysis revealed that GbFOMT-13 was developmental stage-specific and its
expression level was the highest in the spring and the lowest in the summer，which is similar with the
change of total flavonoid increase rate in Ginkgo biloba leaf.

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Key words：Ginkgo biloba；leaf；GbFOMT-13；gene；cloning；expression pattern

银杏类黄酮是银杏次生代谢形成的最主要功能性成分之一。甲基化是类黄酮基本结构形成后由
类黄酮 O–甲基转移酶（flavonoid O-methyltransferase，FOMT）（EC 2.1.1-）催化的最主要的修饰
反应之一，它可降低类黄酮活性基团的化学反应活性，还可增加其脂亲和性，扩大其在细胞内的分
布范围（Yang et al.，2004），同时提高其抗菌性（Ibrahim & Muzac，2000）。甲基化与酰基化、
糖基化等基本修饰反应导致了类黄酮种类及功能的多样性（Ibrahim & Anzellotti，2003；李际红 等，
2011）。
目前已从欧洲云杉（Kim et al.，2010）、美洲黑杨（Kim et al.，2006a；Joe et al.，2010）、水
稻（Kim et al.，2006c；Lee et al.，2008）、小麦（Zhou et al.，2006）及拟南芥（Muzac et al.，2000）
等多种植物中克隆到了与类黄酮甲基化相关的 FOMT 基因。银杏叶片类黄酮含量丰富，银杏叶提取
物（Extract of Ginkgo biloba leaves，EGB）EGB761 中类黄酮含量高达 24%（Jacobs & Browner，2000；
Smith & Luo，2004）。异鼠李素是银杏主要的黄酮苷元之一（Beek et al.，1991；Hasler et al.，1992；
李卫星 等，2010），属 3′–甲基槲皮素衍生物，这说明在银杏中存在着编码可催化槲皮素 3′-OH 甲
基化的类黄酮 O–甲基转移酶基因 3′-FOMT（Kim et al.，2006b；Schmidt et al.，2010）。迄今为止
尚未见有关于银杏 FOMT 的研究报道。研究银杏 FOMT 基因克隆与表达对揭示银杏黄酮苷元的衍变
及该基因的结构与进化具有重要理论意义，同时亦为其基因表达调控，进行遗传改良以提高银杏叶
片中类黄酮含量提供了基因资源与技术依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试银杏叶片均采自扬州大学文汇路校区银杏种质资源圃银杏雄株。于 2010 年 4 月采集幼嫩期
叶片，7 月采集成熟期叶片，10 月采集衰老期叶片液氮冷冻，置–70 ℃保存备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 DH5α 购买自南京百斯凯科技有限公司。引物由上海英骏生物
技术有限公司（Invitrogen）合成，其名称及序列见表 1。

表 1 使用的引物信息
Table 1 Sequence of primers
引物名称 引物序列 用途
Primer Sequence（5′–3′） Description
GAPDHF AGACTGGCGTAGAGTATGTGG 内参基因引物 Reference gene primers
GAPDHR TCAGATTCCTCCTTGATGGCG 内参基因引物 Reference gene primers
OMTP GTIGAYGTIGGIGGIGGIAMHGG 简并引物 Degenerate primer
OMTB1 TCRTCRKWCCARTCRTGMARAAT 简并引物 Degenerate primer
5 RACE outer primer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA 5′端克隆 5′ end amplification
5 RACE inner primer CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG 5′端克隆 5′ end amplification
M13W5 CCGGATGGTACACTGTCAA 5′端克隆；半定量 RT-PCR
5′ end amplification；Semi-quantitative PCR
M13N5 TGAGATTGAGTGTGGATCCG 5′端克隆 5′ end amplification
GbOMTCF1 TAAAGGGAATTGGAATGGG 半定量 RT-PCR Semi-quantitative PCR
注：引物序列中 R 代表 A/G；Y 代表 C/T；M 代表 A/C；W 代表 A/T；K 代表 G/T；H 代表 A/T/C；I 为次黄嘌呤，代表 A/T/G/C。
Note：In degenerate primers sequence，R represents A/G；Y represents C/T；M represents A/C；W represents A/T；K represents G/T；H represents
A/T/C；I is hypoxanthine，representing A/T/G/C.
2 期 张传丽等：银杏类黄酮 O–甲基转移酶基因的克隆与表达分析 357

1.2 银杏叶片总 RNA 提取和总 RNA 反转录
参照 CTAB 法（Wang et al.，2005）提取银杏叶片总 RNA。用分光光度计测其浓度，10 g · L-1
琼脂糖凝胶电泳检测后备用。
以 2 µg 银杏叶片总 RNA 为模板，参照 TaKaRa 公司 PrimeScript® 1st Strand cDNA Synthesis Kit
反转录试剂盒说明书进行 cDNA第一链的合成。选用银杏甘油醛3–磷酸脱氢酶基因（glyceraldehyde-
3-phospate dehydrogenase，GAPDH，GenBank accession number：L26924）为内参基因（Jansson et al.，
1994；Xu et al.，2008），以 GAPDHF/GAPDHR 为上、下游引物，反转录产物为模板进行 cDNA 模
板检测。
PCR 反应体系为：cDNA 模板 1 μL，GAPDHF/GAPDHR（5 mmol · L-1）上、下游引物各 2 μL，
10 × Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol · L-1）2 μL，dNTPs（10 mmol · L-1 each）2 μL，TaKaRa Taq 酶
0.2 μL，用灭菌双蒸水补足到 25 μL，混匀。PCR 反应扩增运行程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃
30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环；4 ℃停止反应。10 g · L-1 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3 GbFOMT-13 基因中间片段扩增和 PCR 产物回收、克隆及测序
根据其他植物 O–甲基转移酶（O-methyltransferase，OMT）蛋白的氨基酸序列保守区，设计了
一对简并引物 OMTP/OMTB1，进行中间片段克隆。PCR 反应体系：cDNA 模板 2 μL，OMTP/OMTB1
（5 mmol · L-1）上、下游引物各 4 μL，10 × Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol · L-1）2 μL，dNTPs（10
mmol · L-1 each）2 μL，TaKaRa Taq 酶 0.2 μL，用灭菌双蒸水补足到 25 μL，混匀。PCR 反应程序为：
94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，45 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃停止反应。
PCR 反应产物经 12 g · L-1 琼脂糖凝胶电泳检测后回收，与 pMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞，菌落 PCR 以及质粒酶切鉴定后由上海生工生物技术有限公司测序。
1.4 GbFOMT-13 基因 5′ RACE PCR 和 PCR 产物回收、克隆及测序
根据测序得到的 GbFOMT-13 基因中间片段序列设计 5′ RACE 基因特异性引物 M13W5 和
M13N5，按照 5′ Full RACE Kit（TaKaRa）试剂盒使用说明、以 5′ RACE Outer Primer/M13W5 为上、
下游引物进行 GbFOMT-13 基因 5′ RACE Outer PCR。5′ RACE Outer PCR 反应体系为：5′ RACE 反
转录反应液 2 μL，1 × cDNA Dilution Buffer 8 μL，10 × LA PCR buffer II（Mg2＋ Free）4 μL，MgCl2
（25 mmol · L-1）3 μL，TaKaRa LA Taq 酶 0.25 μL，5 RACE Outer Primer（10 mmol · L-1）和 M13W5
（10 mmol · L-1）各 2 μL，用灭菌双蒸水补足到 50 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃
30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25 个循环；72 ℃延伸 10 min。
以 5′ RACE Outer PCR 反应液为模板、利用 5′ RACE Inner Primer/M13N5 和 5′ RACE Inner
Primer/M13W5 两对引物分别进行 5′ RACE Inner PCR。5′ RACE Inner PCR 反应体系：Outer PCR 反
应液 1 μL，10 × LA PCR buffer II（Mg2＋ Free）5 μL，MgCl2（25 mmol · L-1）5 μL，dNTPs Mixture
（2.5 mmol · L-1 each）8 μL，TaKaRa LA Taq 酶 0.5 μL，5′ RACE Inner Primer（10 mmol · L-1）和
M13W5/ M13N5（10 mmol · L-1）各 2 μL，用灭菌双蒸水补足到 50 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预
变性 3 min；94 30 s℃ ，52 30 s℃ ，72 90 s℃ ，30 个循环；72 ℃延伸 10 min。
PCR 反应产物经 12 g · L-1 琼脂糖凝胶电泳检测后回收，与 pMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞，菌落 PCR 以及质粒酶切鉴定后由上海生工生物工程技术有限公司测序。
1.5 序列分析
利用 Primer Primer 5 软件进行编码区分析及其相应的氨基酸序列推导；核苷酸和氨基酸序列分
358 园 艺 学 报 39 卷
别利用 NCBI 网站上的 BLASTn、RPS-BLAST 以及 Specialized BLAST（http: //blast.ncbi. nlm.nih.gov/
Blast.cgi）进行相似性分析及保守区域预测；用 DNAMAN 6.0.40 软件通过氨基酸序列分析银杏
FOMT 多肽片段与其他植物 FOMT 的关系。
1.6 GbFOMT-13 表达分析
分别提取 2010 年 4 月幼嫩期、7 月成熟期和 10 月衰老期的银杏雄株叶片总 RNA 并进行反转录。
以反转录的 cDNA 为模板，以 GbOMTCF1/M13W5 为上下游引物，研究 GbFOMT-13 在叶片不同发
育期的表达情况。内参基因利用银杏 GAPDH 的特异引物 GAPDHF/GAPDHR 进行测定。
2 结果与分析
2.1 中间片段扩增
以银杏雄株叶片总 RNA 反转录产物为模板，利用简并引物扩增中间片段，经 12 g · L-1 琼脂糖
凝胶电泳检测，得到 3 条特异性 DNA 条带，M11、M12 和 M13，分别回收、连接、转化、测序后，
进行 BLAST 分析，发现仅长度为 190 bp 的 M13 为目的片段（图 1）。
2.2 5 RACE 扩增
利用 5 RACE Inner Primer/M13N5 和 5′ RACE Inner Primer/M13W5 两对引物分别进行 5′ RACE
Inner PCR。经检测，仅以 5′ RACE Inner Primer/M13W5 为引物的 PCR 得到了长度为 964 bp 的 5′
末端序列（图 1）。将上述的中间片段和 5′ 末端序列进行序列拼接，得到了长度为 876 bp 的基因序
列，命名为 GbFOMT-13，在 GenBank 中注册号为 JN711433。


图 1 银杏 GbFOMT-13 基因片段电泳图
M：DNA marker；1：简并引物扩增产物；2：5′ RACE 扩增产物。
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of degenerate primer PCR and 5′ RACE PCR amplified products of GbFOMT-13
M：DNA marker；1：The product of degenerate primer PCR；2：The product of 5′ RACE PCR amplifying.

2.3 序列分析
序列分析表明，GbFOMT-13 序列 5′非编码区（5′ Untranslated Region，5′ UTR）长度为 67 bp，
编码区长度为 809 bp，可编码 269 个氨基酸残基多肽片段。对其氨基酸序列进行 BLASTp 分析，发
现 GbFOMT-13 具有植物 OMT 蛋白二聚体结构域（dimerization domain，GenBank accession number：
cl06920）（Met31-Ala81）和 OMT 超家族（O-methyltransferase superfamily，GenBank accession number：
cl14604）序列（Gly96-Thr269）（图 2）。
2 期 张传丽等：银杏类黄酮 O–甲基转移酶基因的克隆与表达分析 359

图 2 GbFOMT-13 基因核苷酸序列及推测到的氨基酸序列
灰色部分为二聚体结构域；方框部分为植物 O–甲基转移酶超家族结构域。
Fig. 2 Nucleotide sequence of GbFOMT-13 cDNA and deduced amino acid sequence
Dimerization domain is highlighted in gray；Boxes stand for plant O-methyltransferase superfamily domain.

对GbFOMT-13的cDNA序列进行BLASTn分析，结果显示GbFOMT-13与欧洲云杉（AJ868575）、
火炬松（AY764795）等裸子植物 OMT 基因同源性较高（表 2）。氨基酸序列 BLASTp 分析结果显
示 GbFOMT-13 与拟南芥（NP_200227）、猫眼草（AAA80579，P59049，Q42653）、小麦（Q38J50）
以及玉米（ACG37598）等植物 FOMT 的同源性很高（表 3）。
用 DNAMAN 6.0.40 软件对 GbFOMT-13 氨基酸序列与杂交薄荷（AAR09601）、拟南芥
（NP_200227）、猫眼草（AAA80579，P59049，Q42653）、小麦（Q38J50，Q84N28）、玉米（ACG37598，
NP_001106407）、大麦（CAA54616，ABQ58825）、日本晴水稻（ABB90678）、紫花苜蓿（AAC49928，
O22309，P93324）、蒺藜苜蓿（Q29U27，ABD83924）、甘草（Q84KK5，Q84KK6）、大豆（AEI54338）
以及多毛番茄（ADZ76433）和毛果杨（XP_002312934）等多种植物 FOMT 的氨基酸进行分析，得
到了相似的结果：GbFOMT-13 与拟南芥（NP_200227）和猫眼草（AAA80579，P59049，Q42653）
等植物 FOMT 蛋白的同源关系较近（图 3）。以上结果均表明 GbFOMT-13 确为银杏类黄酮 O-甲基
转移酶基因的序列片段。

表 2 GbFOMT-13 基因核苷酸序列与其他裸子植物 OMT 基因的同源性
Table 2 The nucleotide sequence homoeology between GbFOMT-13 and OMTs from other gymnospermaes
基因登录号
Accession number
物种
Species
碱基同源性/%
Max identity
E–值
E-value
AJ868575 欧洲云杉 Picea abies 79 0.0
HE574557 海岸松 Pinus pinaster 79 0.0
AY764795 火炬松 Pinus taeda 79 2e-131
EU866228 花旗松 Pseudotsuga menziesii 85 6e-55
EU866229 大果黄杉 Pseudotsuga macrocarpa 83 6e-55
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图 4 GbFOMT-13 表达模式分析
GAPDH 为内参基因。
Fig. 4 Expression profiles of GbFOMT-13 in different
developmental stage
GAPDH is reference gene.
表 3 GbFOMT-13 氨基酸序列与其他植物 FOMT 蛋白的同源性
Table 3 The amino acid sequence homoeology between GbFOMT-13 and other plant FOMTs
基因登录号 物种 分值 序列覆盖度/% E–值
Accession number Species Total score Query coverage E-value
NP_200227 拟南芥 Arabidopsis thaliana 301 94 2e-99
Q42653 猫眼草 Chrysosplenium americanum 291 91 9e-96
P59049 猫眼草 Chrysosplenium americanum 290 91 3e-95
AAA80579 猫眼草 Chrysosplenium americanum 268 91 2e-86
Q38J50 小麦 Triticum aestivum 263 98 2e-84
ACG37598 玉米 Zea mays 255 94 2e-81
ABQ58825 大麦 Hordeum vulgare subsp. vulgare 245 98 2e-77
AAR09601 杂交薄荷 Mentha × piperita 238 90 1e-74
Q84N28 小麦 Triticum aestivum 237 94 3e-74
ADZ76433 多毛番茄 Solanum habrochaites 230 97 5e-71
AEI54338 大豆 Glycine max 189 87 8e-56
P93324 紫花苜蓿 Medicago sativa 187 87 1e-54


图 3 推导的 GbFOMT-13 氨基酸序列与多种植物氨基酸系统树
Fig. 3 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of GbFOMT-13 and
their homologues in other plants

2.4 GbFOMT-13 在银杏不同发育期的表达分析
半定量 RT-PCR 分析表明，GbFOMT-13
在银杏叶片幼叶期、成熟叶期以及老叶期均有
表达，但不同发育时期表达水平存在较大差异，
夏季成熟叶期表达量最低，春季幼嫩叶片期以
及秋季老叶期表达水平较高，具有发育时期特
异性（图 4）。
2 期 张传丽等：银杏类黄酮 O–甲基转移酶基因的克隆与表达分析 361

3 讨论
类黄酮是植物次生代谢的结果，其合成是以光合产物为基础，以叶片衰老为前提的（程水源 等，
2001）。春季银杏叶片分生组织活跃时，类黄酮合成较快，但叶片本身合成能力有限，故类黄酮含
量不高；秋季叶片衰老时又有一个较大的类黄酮合成高峰，且此时叶片合成能力强，类黄酮含量最
高（Thomas & Paul，1994）。幼叶期、成熟叶期及老叶期银杏叶片类黄酮含量测定试验发现老叶期
银杏叶片类黄酮含量最高，幼叶期最低（数据未列出）。陈鹏等（2000）研究发现，秋季老叶期银
杏叶片类黄酮含量约为 65 mg · g-1，是整个生长季节类黄酮含量最高峰期，秋季类黄酮的合成约为
13 mg · g-1；夏季成熟叶期类黄酮含量约为 52 mg · g-1，类黄酮的合成约为 0；春季嫩叶期类黄酮含
量较低，其合成约为 52 mg · g-1，银杏叶片类黄酮的合成量为春季 > 秋季 > 夏季。本试验半定量
RT- PCR 结果证明 GbFOMT-13 在春季幼叶期 mRNA 表达量最高，夏季成熟叶片期最低，秋季居中。
因此银杏叶片中 GbFOMT-13 表达量季节变化规律与叶片中类黄酮合成速率季节变化规律是相似的。
GbFOMT-13 这种表达模式与其同源基因葡萄 AOMT 的表达模式相似。研究发现葡萄开花后 60 d
花青素含量快速增长，此时 AOMT 基因表达水平也快速提高，之后花青素合成速率降低，AOMT 的
表达量也降低；AOMT 属可诱导表达基因，其表达产物 AOMT 可能参与了花青素甲基化反应
（Hugueney et al.，2009）。以此类推，GbFOMT 基因表达产物 GbFOMT 可能参与了银杏叶片中类
黄酮甲基化反应，且 GbFOMT（GbFOMT-13）基因是受底物诱导表达的。
查尔酮异构酶（CHI）、花青素合成酶（ANS）与 FOMT 同属类黄酮生物合成酶，它们的编码
基因 CHI 属 FOMT 上游基因，而 ANS 则属 FOMT 下游基因（Brenda，2001；李琳玲 等，2010）。
银杏中 GbFOMT-13 与 GbCHI 和 GbANS 的表达模式既有相同点也有不同点，虽然这 3 个基因（或
基因片段）在银杏幼叶期和老叶期（或成熟叶期）的叶片中均有一定量的基本水平的表达，但 GbCHI
和 GbANS 在类黄酮含量较低的幼叶期的表达量要远低于类黄酮含量较高的老叶中的表达量（Xu et
al.，2008；Cheng et al.，2011），与 GbFOMT-13 的表达模式完全不同的，表明 GbFOMT-13 基因转
录水平上的调控模式与 GbCHI 和 GbANS 的是不同的。
有关 GbFOMT 基因全长 cDNA 与基因组 DNA 序列克隆及功能分析等仍需继续研究。

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